Profilage de l'expression génique spécifique au type cellulaire dans le foie de souris

Amber  W. Wang; Adam  M. Zahm; Kirk  J. Wangensteen

doi:10.3791/60242

Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Profilage de l'expression génique spécifique au type cellulaire dans le foie de souris

7.5K vues

⸱

DOI :

10.3791/60242

⸱

17 septembre 2019

Amber W. Wang¹ , Adam M. Zahm¹ , Kirk J. Wangensteen¹^,²

¹Department of Genetics, University of Pennsylvania, ²Department of Medicine, University of Pennsylvania

Dans cet article

Résumé

La traduction de la purification d'affinité de ribosome (TRAP) permet l'isolement rapide et efficace de l'ARNm de traduction de type de cellule-spécifique. Ici, nous démontrons une méthode qui combine l'injection hydrodynamique de queue-veine dans un modèle de souris de repeuplement de foie et de TRAP pour examiner le profil d'expression des hépatocytes repoptant.

Résumé

Le repeuplement du foie après une blessure est une caractéristique cruciale des mammifères qui empêche l'échec immédiat des organes et la mort après l'exposition des toxines environnementales. Une meilleure compréhension des changements dans l'expression des gènes qui se produisent pendant le repeuplement pourrait aider à identifier des cibles thérapeutiques pour favoriser la restauration de la fonction hépatique dans le cadre des blessures. Néanmoins, les méthodes pour isoler spécifiquement les hépatocytes repoptant sont inhibées par un manque de marqueurs cellulaires, un nombre limité de cellules, et la fragilité de ces cellules. Le développement de la technologie de purification d'affinité de ribosome de traduction (TRAP) en conjonction avec le modèle fah^-/souris pour récapituler le repeuplement dans le cadre des dommages de foie permet le profilage d'expression de gène du repopulating Hépatocytes. Avec TRAP, l'ARNm de traduction spécifique au type cellulaire est rapidement et efficacement isolé. Nous avons développé une méthode qui utilise TRAP avec l'isolement basé sur l'affinité de traduire l'ARNm des hépatocytes qui expriment sélectivement la protéine fluorescente verte (GFP)-étiquetée protéine ribosomal (RP), GFP:RPL10A. TRAP contourne la longue période de temps nécessaire pour le tri cellulaire activé par la fluorescence qui pourrait changer le profil d'expression génique. En outre, puisque seuls les hépatocytes repopant s'expriment la protéine de fusion GFP:RPL10A, l'ARNm isolé est dépourvu de contamination par les hépatocytes blessés environnants et d'autres types de cellules dans le foie. L'ARNm purifié par affinité est de haute qualité et permet l'analyse en aval du séquençage PCR ou à haut débit de l'expression génique.

Introduction

En tant qu'organe métabolique principal chez les vertébrés, le foie est responsable de l'homéostasie du glucose, de la synthèse des protéines du sérum, de la sécrétion d'acide biliaire et du métabolisme et de la désintoxication xénobiotiques. Le foie possède une capacité extraordinaire de régénérer le parenchyme blessé lors de l'exposition aux toxines pour prévenir l'insuffisance hépatique immédiate¹. Cependant, l'échec de la régénération peut se produire dans le cadre de l'acétaminophène ou la surconsommation d'alcool, qui peut conduire à une insuffisance hépatique aigue². En outre, les dommages chroniques de foie provo....