Article de méthode

Profilage de l'expression génique spécifique au type cellulaire dans le foie de souris

DOI :

10.3791/60242

⸱

17 septembre 2019

 ,  , 
1Department of Genetics, University of Pennsylvania, 2Department of Medicine, University of Pennsylvania

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La traduction de la purification d'affinité de ribosome (TRAP) permet l'isolement rapide et efficace de l'ARNm de traduction de type de cellule-spécifique. Ici, nous démontrons une méthode qui combine l'injection hydrodynamique de queue-veine dans un modèle de souris de repeuplement de foie et de TRAP pour examiner le profil d'expression des hépatocytes repoptant.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le repeuplement du foie après une blessure est une caractéristique cruciale des mammifères qui empêche l'échec immédiat des organes et la mort après l'exposition des toxines environnementales. Une meilleure compréhension des changements dans l'expression des gènes qui se produisent pendant le repeuplement pourrait aider à identifier des cibles thérapeutiques pour favoriser la restauration de la fonction hépatique dans le cadre des blessures. Néanmoins, les méthodes pour isoler spécifiquement les hépatocytes repoptant sont inhibées par un manque de marqueurs cellulaires, un nombre limité de cellules, et la fragilité de ces cellules. Le développement de la technologie de purification d'affinité de ribosome de traduction (TRAP) en conjonction avec le modèle fah-/souris pour récapituler le repeuplement dans le cadre des dommages de foie permet le profilage d'expression de gène du repopulating Hépatocytes. Avec TRAP, l'ARNm de traduction spécifique au type cellulaire est rapidement et efficacement isolé. Nous avons développé une méthode qui utilise TRAP avec l'isolement basé sur l'affinité de traduire l'ARNm des hépatocytes qui expriment sélectivement la protéine fluorescente verte (GFP)-étiquetée protéine ribosomal (RP), GFP:RPL10A. TRAP contourne la longue période de temps nécessaire pour le tri cellulaire activé par la fluorescence qui pourrait changer le profil d'expression génique. En outre, puisque seuls les hépatocytes repopant s'expriment la protéine de fusion GFP:RPL10A, l'ARNm isolé est dépourvu de contamination par les hépatocytes blessés environnants et d'autres types de cellules dans le foie. L'ARNm purifié par affinité est de haute qualité et permet l'analyse en aval du séquençage PCR ou à haut débit de l'expression génique.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En tant qu'organe métabolique principal chez les vertébrés, le foie est responsable de l'homéostasie du glucose, de la synthèse des protéines du sérum, de la sécrétion d'acide biliaire et du métabolisme et de la désintoxication xénobiotiques. Le foie possède une capacité extraordinaire de régénérer le parenchyme blessé lors de l'exposition aux toxines pour prévenir l'insuffisance hépatique immédiate1. Cependant, l'échec de la régénération peut se produire dans le cadre de l'acétaminophène ou la surconsommation d'alcool, qui peut conduire à une insuffisance hépatique aigue2. En outre, les dommages chroniques de foie provoqués par l'infection virale d'hépatite, la maladie de foie gras, et la stéatohépatite peuvent causer la fibrose de foie, la cirrhose, et le carcinome hépatocellulaire3. Le seul traitement curatif disponible pour la maladie hépatique en phase terminale est la transplantation, mais est limité par la pénurie d'organes, empêchant un traitement efficace pour tous les patients4. Une meilleure compréhension du processus de récupération après des lésions hépatiques toxiques est donc cruciale pour le développement de traitements visant à stimuler la régénération suffisante pour sauver la fonction dans l'organe malade.

Le système modèle le plus largement appliqué pour l'étude de la régénération du foie est l'hépatectomie partielle chez les rongeurs, dans laquelle une grande proportion du foie est réséquée pour stimuler l'expansion rapide des hépatocytes5. Cependant, l'hépatectomy partiel ne récapitule pas l'expansion d'hépatocyte suivant des dommages toxiques de foie dus au manque d'infiltration de cellules immunitaires et de nécrose de cellules d'hépatocyte souvent observées dans l'arrangement des dommages aigus de foie chez les humains6. Un système plus approprié pour modéliser cette forme de renouvellement d'organe est le Fah-/- souris, qui manque d'hydrolase fonctionnel de fumarylacetoacetate (FAH) exigé pour le métabolisme approprié de tyrosine et développe des dommages graves de foie menant à la mort7. Ces souris peuvent être maintenues dans un état sain indéfiniment par le traitement avec la nitisinone de drogue dans l'eau potable. Alternativement, l'expression de FAH peut être reconstituée par la livraison de transgène à un sous-ensemble d'hépatocytes, qui se développera pour repeupler le foie sur l'enlèvement de nitisinone8.

Pour profiler les changements d'expression génique des hépatocytes repoptant, un outil pour isoler spécifiquement les hépatocytes répliférants dans le Fah-/- souris sans contamination des hépatocytes blessés voisins et d'autres types de cellules est nécessaire. Malheureusement, le tri des cellules assistées par fluorescence (FACS) des hépatocytes est difficile puisque (1) la fragilité des hépatocytes repeuplent conduit à une mauvaise récupération après la perfusion du foie, (2) la reproduction des hépatocytes sont très variables en taille, ce qui rend l'isolement d'une population pure par FACS difficile, et (3) le temps de procédure de perfusion de foie à l'isolement d'ARN est plus grand que 2 h, donc les profils d'expression de gène peuvent subir des changements artificiels substantiels avant que des échantillons soient acquis9.

Alternativement, l'expression des ribosomes épitope-marqués spécifiquement dans les hépatocytes repoptant permet l'isolement rapide de traduire activement l'ARNm lié par des ribosomes utilisant la purification d'affinité immédiatement après la récolte d'organe, avec le foie en vrac lysates tissulaires. Ici, nous décrivons un protocole pour effectuer la purification d'affinité de traduisme-ribosome (TRAP)10 suivie du séquençage à haut débit d'ARN (TRAP-seq), pour isoler et profiler spécifiquement l'ARNm dans les hépatocytes repoptant dans le Fah-/- souris9. La coexpression de la protéine nerbiomale fluorescente verte (GFP:RPL10A) avec FAH permet la purification d'affinité de traduire l'ARNm lié par des polysomes contenant GFP:RPL10A. Cette méthode évite toute dissociation cellulaire, comme la perfusion du foie pour isoler les hépatocytes repopuantfragiles. Au lieu de cela, il utilise la lyse de tissus d'organes entiers et des anticorps pour extraire rapidement l'ARN spécifiquement des cellules cibles. Enfin, l'isolement de l'ARNm abondant et de haute qualité via TRAP-seq permet aux applications en aval telles que l'analyse de séquençage de profiler le changement dynamique de l'expression des gènes pendant le processus de repeuplement.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les méthodes qui impliquent l'utilisation de souris sont conformes aux lignes directrices fournies par l'IACUC du Penn Office of Animal Welfare de l'Université de Pennsylvanie.

1. Préparation de réactif

  1. Cycloheximide Cycloheximide
    1. Pour faire 500 oL de cycloheximide de 0,1 g/mL, suspendre 50 mg de cycloheximide dans 500 l de méthanol.
      MISE EN GARDE: Le cycloheximide est extrêmement toxique pour l'environnement et peut causer une malformation congénitale. Tous les déchets et tampons contenant du cycloheximide doivent être collectés pour une élimination appropriée.
      REMARQUE: Le cycloheximide peut être stocké à 4 oC jusqu'à 1 jour. Cycloheximide inhibe la traduction.
  2. Dithiothreitol (TNT)
    1. Pour faire 1 ml de 1 M DTT, suspendre 0,15 g de poudre de TNT dans de l'eau sans RNase.
      MISE EN GARDE: La TNT peut causer une irritation de la peau, des yeux et des voies respiratoires.
      REMARQUE: La TNT est un détergent. La TNT peut être stockée à -20 oC. Il est recommandé de stocker 1 M TNT dans des aliquots à usage unique de 50 L.
  3. Deoxycholate (DOC)
    1. Pour faire 10% de DOC, suspendre 1 g de DOC dans un tube conique de 50 ml et ajouter de l'eau sans RNase jusqu'à 10 ml. Agiter vigoureusement jusqu'à ce que la poudre soit dissoute.
      REMARQUE: La solution DOC de 10 % est légèrement jaune et peut être stockée à température ambiante (RT) jusqu'à 1 an. DOC est utilisé pour la lyse nucléaire.
  4. Anticorps GFP
    1. Aliquot GFP anticorps lors de l'utilisation pour la première fois. Congeler les aliquots et les conserver à -80 oC.
      REMARQUE: Il est recommandé de stocker 50 g d'anticorps GFP dans des aliquots à usage unique.
  5. B protéine biotinylated L
    1. Resuspendre la protéine biotinylated L dans 1x saline tamponnée par phosphate (PBS) pour faire la concentration finale de 1 g/L.
      REMARQUE: La solution rechargée peut être stockée à -20 oC jusqu'à 6 mois.

2. Préparation tampon

  1. Albumine de sérum bovin (BSA) tampon
    1. Pour faire 50 ml de tampon BSA de 3 %, ajouter 1,5 g de poudre BSA sans IgG et protéase dans 40 mL de PBS suivi d'un vortex. Après la dissolution du BSA, ajouter du PBS à un volume final de 50 ml.
      REMARQUE: Le tampon BSA peut être stocké à 4 oC pendant une température pouvant aller jusqu'à six mois.
  2. Tampon de dissection
    1. Pour faire 50 ml de stock tampon de dissection, combiner 5 ml de 10x solution de sel équilibrée de Hank (HBSS), 125 'L de 1 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acide (HEPES), 1 750 'L de 1 M de glucose, et 200 'L de 1 M NaHCO3. Ajouter de l'eau sans RNase à un volume final de 50 ml.
      REMARQUE: Le stock tampon de dissection peut être stocké à 4 oC pendant une température pouvant aller jusqu'à six mois.
    2. Immédiatement avant l'utilisation, ajouter 100 g/mL de cycloheximide de 0,1 g/mL et garder sur la glace.
  3. Tampon à haute teneur en sel
    1. Pour faire 50 ml de stock tampon à haute teneur en sel, ajouter 1 ml de 1 M HEPES, 8,75 ml de 2 M KCl, 500 oL de 1 M MgCl2, et 500 l de 100% nonylphényle polyéthylène glycol (Table of Materials) à l'eau sans RNase.
      REMARQUE: Le stock tampon à haute teneur en sel peut être stocké à 4 oC pendant une durée pouvant aller jusqu'à six mois.
    2. Immédiatement avant l'utilisation, ajouter 0,5 L/mL de 1 M DTT et 1 l/mL de cycloheximide de 0,1 g/mL. Gardez le tampon frais de haute teneur en sel sur la glace.
  4. Tampon à faible teneur en sel
    1. Pour faire 50 ml de stock tampon à faible teneur en sel, ajouter 1 ml de 1 M HEPES, 3,75 ml de 2 M KCl, 500 oL de 1 M MgCl2, et 500 l de 100% nonylphényle polyéthylène glycol à 44,25 Ml d'eau sans RNase.
      REMARQUE: Le stock tampon à faible teneur en sel peut être stocké à 4 oC pendant une durée pouvant aller jusqu'à six mois.
    2. Ajouter 0,5 L/mL de 1 M DTT et 1 l/mL de cycloheximide de 0,1 g/mL avant d'utiliser. Gardez le tampon frais à faible teneur en sel sur la glace.
  5. Tampon de lyse tissulaire
    1. Pour faire 50 ml de stock tampon de lyse tissulaire, mélanger 1 ml de 1 M HEPES, 3,75 ml de 2 M KCl, et 500 oL de 1 M MgCl2. Ajouter de l'eau sans RNase à une finale de 50 ml.
      REMARQUE: Le stock tampon de dissection peut être stocké à 4 oC pendant une température pouvant aller jusqu'à six mois.
    2. Ajouter 1 comprimé/10 ml d'inhibiteur de la protéase sans EDTA, 1 l/mL de cycloheximide de 0,1 g/mL, 10 l/mL d'inhibiteurs de la NNase chacun immédiatement avant l'utilisation. Gardez le tampon de lyse des tissus frais sur la glace.

3. Conjugaison d'anticorps aux perles magnétiques

  1. Anticorps
    1. Calculez la quantité d'anticorps GFP nécessaires pour tous les échantillons et préparez-vous à un échantillon supplémentaire.
      REMARQUE: Pour chaque échantillon, 50 g de chaque anticorps GFP sont nécessaires.
    2. Décongeler les anticorps GFP sur la glace et tourner à une vitesse maximale (13 000 x g)pendant 10 min à 4 oC et transférer les supernatants dans un nouveau tube de microcentrifugeur.
      REMARQUE: L'étape de préparation des anticorps peut être effectuée avant la préparation des perles et les anticorps décongelés peuvent être conservés sur la glace. Alternativement, cette partie peut être exécutée pendant l'incubation de la perle magnétique et de la protéine biotinylated L.
  2. Resuspendre les perles magnétiques
    1. Resuspendre les perles magnétiques (Table of Materials) par pipetage doux.
    2. Pour chaque échantillon, utilisez 150 ll de perles magnétiques. Calculez le volume de perles magnétiques requis pour tous les échantillons et préparez-en un de plus. Transférer les perles magnétiques resuspensionsuruns à un tube microcentrifuge de 1,5 ml ou 2 ml. Si plus de 1 ml est nécessaire pour une expérience, diviser le montant total en volumes égaux.
    3. Recueillir des perles sur un support magnétique pour 'gt'1 min et enlever le supernatant. Retirez le tube de microcentrifuge du support magnétique et ajoutez 1 ml de PBS suivi d'un tuyauterie de haut en bas pour laver les perles. Recueillir des perles sur un support magnétique pour 'gt;1 min et supprimer PBS.
  3. Préparation de perles enrobées de protéines L
    1. Pour chaque échantillon, utilisez 60 ll de protéine Biotinylated L. Si la protéine L est préalablement remise en suspension et stockée à -20 oC, décongeler la protéine L sur la glace. Si la protéine L est remise en suspension avant l'utilisation, prenez la quantité requise pour tous les échantillons et préparez-en un de plus.
    2. Ajoutez le volume calculé de protéine L biotinylated aux perles magnétiques resuspendues et lavées. Ajouter 1x PBS pour faire le volume final 1 ml si vous utilisez un tube microcentrifuge de 1,5 ml, ou 1,5 ml si vous utilisez un tube microcentrifuge de 2 ml. Incuber des perles magnétiques avec la protéine biotinylated L pendant 35 min à RT sur un rotateur de tube.
      REMARQUE: Les anticorps peuvent être préparés à cette étape pendant que les perles couvent avec la protéine Biotinylated L.
    3. Recueillir des protéines L-enduitde perles sur un support magnétique pour 'gt'1 min et enlever le supernatant. Retirez le tube de microcentrifuge du support magnétique et ajoutez 1 ml de tampon BSA de 3 % suivi d'une pipetilline douce pendant au moins 5 fois pour laver les perles enduites de protéines L.
    4. Recueillir des perles enduites sur un support magnétique pour 'gt;1 min et enlever le supernatant. Répétez les étapes de lavage avec 3% BSA pour un autre 4 fois (un total de 5 fois).
  4. Fixation d'anticorps
    1. Ajouter la quantité calculée d'anticorps GFP dans les perles enrobées de protéines L et incuber pendant 1 h à 4 oC sur un rotateur à tube.
      REMARQUE: Après l'incubation des anticorps, prenez soin de ne pas vortexlant la matrice d'affinité.
    2. Pendant l'incubation, préparer un tampon à faible teneur en sel en calculant le volume total requis pour tous les échantillons et ajouter 0,5 L/mL de 1 M DTT et 1 l/mL de cycloheximide de 0,1 g/mL au stock tampon à faible teneur en sel avant utilisation.
      REMARQUE : 3 ml de tampon à faible teneur en sel pour laver chaque tube de perles conjuguées au GFP et 200 L/échantillon pour la suspension des perles conjuguées au GFP est nécessaire. Un tampon frais à faible teneur en sel peut être conservé sur la glace pendant quelques heures.
    3. Recueillir la matrice d'affinité sur un support magnétique pour 'gt;1 min et enlever le supernatant. Ajouter 1 ml de tampon à faible teneur en sel et pipette doucement de haut en bas pour laver la matrice d'affinité. Recueillir la matrice d'affinité sur un support magnétique pour 'gt;1 min et enlever tampon à faible teneur en sel. Répétez les étapes de lavage avec un tampon à faible teneur en sel pour un autre 2 fois (un total de 3 fois).
    4. Resuspendre les perles dans un tampon à faible teneur en sel afin que chaque échantillon ait 200 ll de matrice d'affinité.
      REMARQUE: La matrice d'affinité peut être stockée dans 0,02% NaN3 à 4 oC pendant jusqu'à 2 semaines. La matrice d'affinité doit être lavée rapidement dans un tampon à faible teneur en sel 3 fois et remise en suspension délicate sur un rotateur de tube à 4 oC pendant au moins 10 min si la matrice d'affinité est préparée dans un délai de 1 semaine ou pendant la nuit si la matrice d'affinité est stockée pendant plus d'une semaine. Le protocole peut être mis en pause après cette étape.
      MISE EN GARDE: L'azide de sodium est extrêmement toxique pour l'environnement. Le contact avec les acides produit des gaz toxiques. Tous les déchets doivent être collectés pour une élimination appropriée.

4. Lyse tissu l'hépatique

  1. Préparation et configuration de l'équipement de tampon
    1. Calculer le nombre de tubes de microcentrifuge requis, étiqueter et refroidir sur la glace.
      REMARQUE: Habituellement, sept tubes microcentrifugeurs de 1,5 ml sont nécessaires pour chaque échantillon : 1 pour le foie disséqué restant, 4 pour 4 ml de lysate homogénéisé du foie et 2 pour le transfert des supernatants.
    2. Préparer un tampon de dissection frais en calculant le volume total requis pour tous les échantillons et ajouter 1 cycloheximide de 0,1 g/mL. Placez le tampon de dissection fraîche sur la glace pour garder au froid tout au long de l'expérience.
      REMARQUE: Pour chaque échantillon, 10 ml de tampon de dissection sont nécessaires.
    3. Préparer un tampon de lyse fraîche en calculant le volume total requis pour tous les échantillons et ajouter 1 comprimé/10 ml d'inhibiteur de la protéase sans EDTA, 1 l/mL de cycloheximide de 0,1 g/mL et 10 'L/mL d'inhibiteurs de la RNase chacun. Gardez le tampon de lyse sur la glace tout au long de l'expérience.
      REMARQUE: Pour chaque échantillon, 4 ml de tampon de lyse sont nécessaires.
    4. Mettre en place le broyeur de tissu (Table of Materials) de sorte que le polytétrafluoroéthylène (PTFE) tubes de verre peut être placé sur la glace lors de l'homogénéisation des morceaux de foie. Mettre 4 ml de tampon de lyse froide dans les tubes de verre PTFE.
  2. Repopulation de l'homogénéisation du foie
    1. Euthanasiez un Fahde 8 à 12 semaines-/- souris injectée avec le vecteur TRAP et repeuplée pendant une ou quatre semaines avec anesthésie et luxation cervicale selon les directives expérimentales animales approuvées.
    2. Placez la souris sur un tableau de dissection et vaporisez l'abdomen avec 70% d'éthanol. Tente zetez la peau et le péritoine bas dans l'abdomen à l'aide de forceps et utilisez des ciseaux pour faire une incision transversale. Continuer à couper avec les ciseaux pour faire un large rabat péritonéal en forme de U, avec soin de ne pas couper les viscères. Retourner le rabat péritonéal sur le sternum pour exposer le foie.
    3. Retirez soigneusement le foie à l'aide de ciseaux et de forceps fins et placez rapidement le tissu dans un tampon de dissection froide pour rincer. Pour homogénéiser les tissus congelés, déplacez rapidement la quantité désirée de tissu hépatique dans des tubes de verre PTFE avec tampon de lyse froide sans dégeler le tissu.
      REMARQUE: Le tissu disséqué peut être congelé au flash et stocké à -80 oC après avoir été lavé avec un tampon de dissection. Le protocole peut être mis en pause après cette étape.
    4. Peser le foie sur un plat Petri et isoler 200 à 500 mg de morceaux de foie et se déplacer dans les tubes de verre PTFE. Placer le tissu hépatique restant dans un tube microcentrifuge préréfrigéré et un gel éclair.
    5. Homogénéiser les échantillons dans un homogénéisateur motorisé à partir de 300 tr/min pour dissocier les hépatocytes de la structure hépatique pendant au moins 5 coups. Abaissez le tube de verre à chaque fois, mais prenez soin de ne pas laisser le pilon s'élever au-dessus de la solution pour prévenir l'aération qui pourrait causer la dénaturation des protéines.
    6. Augmenter la vitesse à 900 tr/min pour homogénéiser complètement les tissus hépatiques pour au moins 12 coups complets.
    7. Transférer le lysate dans les tubes étiquetés et préréfrigérés, avec pas plus de 1 ml de lysate par tubes microcentrifuges de 1,5 ml. Si 4 ml de tampon de lyse est utilisé, garder 1 tube et flash geler les 3 tubes restants.
      REMARQUE: Les lysates peuvent être conservés sur la glace jusqu'à 1 h tout en disséquant le prochain animal et en préparant des lysates frais. Le foie homogénéisé peut être congelé au flash après l'étape de lyse et stocké à -80 oC. Il pourrait y avoir une diminution de 50 % de l'ARN isolé si des lysates congelés sont utilisés. Le protocole peut être mis en pause après cette étape.
  3. Lyse nucléaire
    1. Centrifuger le lysate du foie à 2 000 x g à 4 oC pendant 10 min et transférer le supernatant dans un nouveau tube de microcentrifuge préréfrigéré sur glace.
    2. Ajouter 1/9 du volume supernatant de 10% de polyéthylène polyéthylène glycol pour faire la concentration finale 1% nonylphényl polyéthylène glycol et mélanger en inversant doucement les tubes microcentrifuge.
    3. Faites rapidement tourner vers le bas les tubes de microcentrifuge et ajoutez 1/9 du volume d'échantillon de 10% DOC pour faire la concentration finale 1% DOC et mélangez en inversant doucement les tubes de microcentrifuge. Faites rapidement tourner les tubes de microcentrifuge et incubez sur la glace pendant 5 min.
    4. Centrifuger le lysate nucléaire à 20 000 x g à 4 oC pendant 10 min et transférer le supernatant dans un nouveau tube de microcentrifuge préréfrigéré sur glace.
      REMARQUE: Le supernatant appauvri par les mitochondries peut être placé sur la glace pendant quelques heures pendant que les échantillons restants sont prélevés.

5. Immunoprécipitation

  1. Pour chaque tube, éliminer 1 % du volume total du supernatant comme contrôle pré-immunoprécipitation pour comparer l'enrichissement de la cible après l'incubation avec la matrice d'affinité. Placez les contrôles de pré-immunoprécipitation sur un rotateur de tube à 4 oC pendant la nuit, de la même manière que les échantillons immunoprécipités sont traités.
  2. Ajouter 200 l de matrice d'affinité à chaque échantillon. Prenez soin de resuspendre les perles par pipetting douce avant d'ajouter la matrice d'affinité à chaque échantillon. Incuber les lysates avec une matrice d'affinité à 4 oC pendant la nuit avec un mélange doux sur un rotateur de tube.
    REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause jusqu'à un jour après cette étape.

6. Isolation de l'ARN

  1. Préparation et configuration de l'équipement de tampon
    1. Placer la grille magnétique à 4 oC pendant au moins 30 min pour pré-réfrigérer et garder la grille sur la glace tout au long de l'expérience.
    2. Calculer le nombre de tubes de microcentrifugerie requis et pré-refroidir sur la glace ou à 4 oC.
      REMARQUE: Habituellement, chaque échantillon nécessite 1 tube microcentrifugepour l'ARN purifié final.
    3. Faites rapidement tourner les tubes à partir de l'étape 5.2 et collectez les perles en plaçant sur le support magnétique pendant au moins 1 min. Recueillir ou jeter le supernatant dans des tubes microcentrifuge supplémentaires.
      REMARQUE: Le supernatant collecté qui contient une fraction non liée peut être congelé au flash et stocké à -80 oC pour se comparer à la fraction liée pour l'enrichissement de la transcription après la purification. Le protocole peut être mis en pause après cette étape.
    4. Préparer un tampon à haute teneur en sel en ajoutant 0,5 L/mL de 1 M DTT et 1 l/mL de cycloheximide de 0,1 g/mL au stock tampon à haute teneur en sel.
      REMARQUE: Pour chaque échantillon, 5 ml de tampon à haute teneur en sel sont nécessaires.
  2. Isolement de l'ARN
    1. Ajouter 1 ml de tampon frais à haute teneur en sel à chaque tube suivi d'une pipetilisation douce pendant au moins 5 fois sans introduire de bulles.
      REMARQUE: Un lavage insuffisant pourrait introduire des antécédents de transcriptions non liées tandis que l'introduction de bulles pourrait accélérer la dégradation de l'ARN.
    2. Recueillir des perles sur un support magnétique pour 'gt'1 min et enlever le supernatant. Répétez les étapes de lavage avec un tampon à haute teneur en sel pour un autre 4 fois (un total de 5 fois).
    3. Retirer le reste de la mémoire tampon à haute teneur en sel et retirer les tubes de microcentrifuge du support magnétique et placer à RT pendant 5 minutes pour se réchauffer.
    4. Resuspendre les perles dans 100 l de tampon de lyse (fourni dans le kit d'isolement de l'ARN) avec du mercaptoéthanol.
      REMARQUE: Tout kit d'isolement et de purification de l'ARN qui contient la guanidine thiocyanate dénaturante peut être utilisé comme tampon de lyse pour libérer l'ARN lié de la matrice d'affinité. L'extraction de l'ARN doit être traitée à RT puisque la guanidine thiocyanate peut se cristalliser à basse température.
    5. Vortex les perles et tampon pour au moins 5 s à la vitesse la plus élevée, rapidement spin vers le bas pour recueillir le tampon sur le côté du tube microcentrifuge et incuber les perles avec le tampon à RT pendant 10 min pour libérer l'ARN lié à la perle dans le tampon de lyse.
    6. Recueillir des perles sur un support magnétique pour 'gt;1 min et de recueillir le supernatant de procéder immédiatement au nettoyage de l'ARN selon le protocole de purification de l'ARN comme spécifié dans le kit (Tableau des matériaux).
      REMARQUE: Le supernatant contenant l'ARN éluté dans le tampon de lyse peut également être stocké à -80 oC pendant jusqu'à 1 mois avant le nettoyage en réchauffant jusqu'à RT lors de la décongélation.
    7. Pour obtenir la qualité maximale de l'ARN isolé, effectuer toutes les étapes facultatives, y compris la digestion DNase et toutes les étapes d'élution de l'ARN. Chauffez le tampon d'élution fourni par le kit d'isolement de l'ARN ou l'eau sans RNase à 60 oC pour une récupération maximale de l'ARN.
      REMARQUE: L'ARN isolé peut être stocké à -20 oC pendant une durée allant jusqu'à 1 mois ou -80 oC pendant plusieurs années. Le protocole peut être mis en pause après cette étape.

7. Analyse facultative de la qualité de l'ARN (recommandé)

  1. Évaluer la qualité de l'ARN à l'aide d'un bioanalyseur11 et la quantité avec un spectrophotomètre12 pour déterminer si la répétition du processus d'immunoprécipitation est nécessaire pour obtenir un ARN suffisant et de haute qualité.
    REMARQUE: La qualité optimale de l'ARN pour le séquençage à haut débit doit suivre les protocoles spécifiés par les kits de préparation de la bibliothèque et les plates-formes de séquençage.

8. Applications en aval

REMARQUE: L'ARN total isolé par le protocole TRAP peut être utilisé dans un certain nombre d'applications standard en aval, y compris l'ARN-seq (TRAP-seq). La transcription inverse standard et les protocoles PCR quantitatifs peuvent également être utilisés après TRAP.

  1. Pour TRAP-seq, effectuer la préparation de la bibliothèque RNA-seq selon les méthodes standard13.
  2. Pour l'ARN-seq, préparez des bibliothèques de séquençage de cDNA utilisant des kits commerciaux d'ARN-seq avec l'enrichissement d'oligo d(T)-basé des transcriptions polyadenylated poly(A). Alternativement, si la qualité totale de l'ARN est inférieure à celle recommandée pour l'enrichissement en poly(A), utilisez des modules d'épuisement de l'ARNre. Cependant, attendez-vous à voir plus d'alignement de rRNA après le séquençage.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour profiler l'expression des gènes dans les hépatocytes repopuants du Fah-/souris, la fusion Gfp:Rpl10a et les transgènes Fah sont co-livrés dans un plasmide8 contenant des transposons (vecteur TRAP) aux foies par injection hydrodynamique (Figure 1A). L'élimination de la nitisinone induit une lésion hépatique toxique qui crée une pression de sélection pour les hépatocytes exprima...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TRAP-seq est une technique pour l'isolement de type cellulaire spécifique de traduire l'ARNm par l'intermédiaire de ribosomes épitope-marqués et présente une alternative aux approches FACS, car il contourne des limitations telles que des exigences de temps de FACS9. Au lieu de cela, TRAP permet l'isolement rapide et efficace de l'ARN directement à partir des tissus en vrac, aidant à éviter toute altération de l'expression des gènes. TRAP-seq est particulièrement bien adapté pour une utilisation da...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par les subventions suivantes: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW), et P30-DK050306 (Subvention pilote à KJW).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Broyeur de tissus de 10 ml, Potter-Elv, CoatedDWK Life Sciences (Wheaton)358007
Absolutely RNA Miniprep KitAgilent400800
Anticorps anti-GFPMemorial Sloan-Kettering Anticorps & Bioresource CoreGFP Ab #19C8 et GFP Ab #19F7
Albumine sérique bovine, sans IgG, sans protéaseJackson ImmunoResearch001-000-162
cOmplete, Mini, sans EDTA Cocktail inhibiteur de protéase Roche11836170001
CycloheximideMillipore SigmaC7698
Acide désoxycholique, DOCMillipore SigmaD2510
D-Glucose, DextroseFisher ScientificD16
DL-DithiothreitolMillipore SigmaD9779
Dynabeads MyOne Streptavidin T1Thermo Fisher Scientific65602
Fisherbrand Boîtes de Pétri avec couvercle transparentFisher ScientificFB0875712
HBSS (10x), calcium, magnésium, sans rouge de phénolThermo Fisher Scientific14065-056
HEPES, solution 1 M, pH 7,3, qualité biologie moléculaire, ultrapure, Thermo ScientificThermo Fisher ScientificAAJ16924AE
magnésium, MgCl2sp ;Millipore SigmaM8266
MéthanolFisher ScientificA452
NanoDrop 2000/2000c SpectrophotomètreThermo Fisher ScientificVV-83061-00
NEBNext Poly(A) Module d’isolation magnétique d’ARNmNew England BioLabsE7490S
NEBNext Kit de préparation de bibliothèque d’ARN Ultra pour IlluminaNew England BioLabsE7530S
Polyéthylène glycol nonylphényle, NP-40. IGEPAL CA-630Millipore SigmaI8896
Eau sans nucléases, non traitée au DEPCAmbionAM9932
Agitateur suspenduDWK Life Sciences (Wheaton 903475
Tampon PBS (10x), pH 7,4AmbionAM9625
Percer la protéine recombinante L, biotinyléeThermo Fisher Scientific29997
Chlorure de potassium, KClMillipore SigmaP4504
RNA 6000 Pico Kit & RéactifsAgilent5067-1513
RNaseZap RNase Solution de décontaminationInvitrogenAM9780
RNasin Inhibiteurs de la ribonucléasePromegaN2515
Azoture de sodium, NaN3Millipore SigmaS2002
Bicarbonate de sodium, NaHCO3Millipore SigmaS6297
SUPERase· ; Dans l’inhibiteur de la RNaseInvitrogenAM2694
chlorure de

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).
  2. Lee, W. M. Etiologies of acute liver failure. Seminars in Liver Disease. 28 (2), 142-152 (2008).
  3. Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment. The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).
  4. Jadlowiec, C. C., Taner, T. Liver transplantation: Current status and challenges. World Journal of Gastroenterology. 22 (18), 4438-4445 (2016).
  5. Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. Liver regeneration. Science. 276 (5309), 60-66 (1997).
  6. Michalopoulos, G. K. Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas. The American Journal of Pathology. 176 (1), 2-13 (2010).
  7. Grompe, M., et al. Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice. Genes & Development. 7 (12A), 2298-2307 (1993).
  8. Wangensteen, K. J., et al. A facile method for somatic, lifelong manipulation of multiple genes in the mouse liver. Hepatology. 47 (5), 1714-1724 (2008).
  9. Wang, A. W., et al. TRAP-seq identifies cystine/glutamate antiporter as a driver of recovery from liver injury. The Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2297-2309 (2018).
  10. Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
  11. Agilent Technologies. Agilent RNA 6000 Pico: User Manual. , Retrieved from https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90046_RNA600Pico_KG_EN.pdf (2016).
  12. NEBNext. NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina: User Manual. , Retrieved from https://international.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale7530.pdf (2018).
  13. NanoDrop. 2000/2000c Spectrophotomerter: User Manual. , Retrieved from https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CAD/manuals/NanoDrop-2000-User-Manual-EN.pdf (2009).
  14. Liu, J., et al. Cell-specific translational profiling in acute kidney injury. The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1242-1254 (2014).
  15. Lu, S. C. Regulation of glutathione synthesis. Molecular Aspects of Medicine. 30 (1-2), 42-59 (2009).
  16. Wang, A. W., et al. The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver. bioRxiv. , (2019).
  17. Zahm, A. M., et al. A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver. bioRxiv. , (2019).
  18. Stork, C., Zheng, S. Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq. Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).
  19. Zhao, X., et al. Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish. Hepatology. 64 (3), 894-907 (2016).
  20. Halpern, K. B., et al. Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver. Nature. 542 (7641), 352-356 (2017).
  21. Camp, J. G., et al. Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency. Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).
  22. Wang, Y. J., Kaestner, K. H. Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets--a Promise Not yet Fulfilled? Cell Metabolism. 29 (3), 539-544 (2019).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Translating Ribosome Affinity PurificationTRAP seqHepatocyte IsolationLiver RepopulationGFP L10A Fusion ProteinMagnetic Bead IsolationNuclear Lysate PreparationRNA Cleanup ProtocolHigh throughput Sequencing

Articles connexes