Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Imagerie cellulaire en direct pour évaluer la dynamique du moment de la métaphase et le destin cellulaire à la suite de perturbations mitotiques spindle

8K vues

⸱

DOI :

10.3791/60255

⸱

20 septembre 2019

 ,  , 
1Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici nous présentons un protocole pour évaluer la dynamique de la formation de fuseau et de la progression mitotique. Notre application de l'imagerie en time-lapse permet à l'utilisateur d'identifier les cellules à divers stades de la mitose, de suivre et d'identifier les défauts mitotiques, et d'analyser la dynamique du fuseau et le destin des cellules mitotiques lors de l'exposition à des médicaments anti-mitotiques.

Résumé

L'imagerie en accéléré cellulaire en direct est un outil important en biologie cellulaire qui donne un aperçu des processus cellulaires qui pourraient autrement être négligés, mal compris ou mal interprétés par l'analyse des cellules fixes. Bien que l'imagerie et l'analyse des cellules fixes soient robustes et suffisantes pour observer l'état stable cellulaire, elle peut être limitée dans la définition d'un ordre temporel des événements au niveau cellulaire et est mal équipée pour évaluer la nature transitoire des processus dynamiques, y compris progression mitotique. En revanche, l'imagerie cellulaire vivante est un outil éloquent qui peut être utilisé pour observer les processus cellulaires au niveau d'une seule cellule au fil du temps et a la capacité de capturer la dynamique des processus qui seraient autrement mal représentés dans l'imagerie cellulaire fixe. Ici nous décrivons une approche pour produire des cellules portant des marqueurs fluorescents étiquetés de chromatine et de microtubules et leur utilisation dans les approches vivantes d'imagerie de cellules pour surveiller l'alignement de chromosome de métaphase et la sortie mitotique. Nous décrivons des techniques basées sur l'imagerie pour évaluer la dynamique de la formation de fuseau et de la progression mitotique, y compris l'identification des cellules à divers stades de la mitose, l'identification et le suivi des défauts mitotiques, et l'analyse de la dynamique du fuseau et destin de cellule mitotique suivant le traitement avec des inhibiteurs mitotic.

Introduction

L'analyse basée sur l'image des cellules fixes est couramment utilisée pour évaluer les changements de niveau de population cellulaire en réponse à diverses perturbations. Lorsqu'elles sont combinées avec la synchronisation cellulaire, suivie par la collecte et l'imagerie des points de temps de série, ces approches peuvent être utilisées pour suggérer une séquence cellulaire des événements. Néanmoins, l'imagerie cellulaire fixe est limitée en ce que les relations temporelles sont implicites pour une population et non démontrées au niveau des cellules individuelles. De cette façon, alors que l'imagerie et l'analyse des cellules fixes sont suffisantes pour observer des phénotypes robustes et des changements d'état stable, la capacité de détecter les changements transitoires au fil du temps et les changements qui n'ont d'impact qu'une sous-population des cellules est imparfaite. En revanche, l'imagerie cellulaire vivante est un outil éloquent qui peut être utilisé pour observer les processus cellulaires et subcellulaires au sein d'une seule cellule, ou population cellulaire, au fil du temps et sans l'aide d'approches de synchronisation qui peuvent eux-mêmes avoir un impact sur le comportement cellulaire 1 Fois , 2 (en) , 3 (en) , 4 ( en plus) , 5 Annonces , 6.

La formation d'un fuseau mitotique bipolaire est essentielle pour la ségrégation appropriée de chromosome pendant la division cellulaire, ayant pour résultat deux cellules de fille génétiquement identiques. Les défauts dans la structure mitotique de fuseau qui corrompent la progression mitotique et compromettent la fidélité de la ségrégation de chromosome peuvent avoir comme conséquence des divisions cellulaires catastrophiques et la viabilité réduite de cellules. Pour cette raison, les poisons mitotiques qui modifient la formation de fuseau sont des thérapies prometteuses pour limiter la prolifération rapide des cellules cancéreuses7,8,9. Néanmoins, l'analyse cellulaire fixe de la structure du fuseau à la suite de l'ajout de poisons mitotiques est limitée dans sa capacité à évaluer le processus dynamique de formation du fuseau et peut ne pas indiquer si les changements observés dans la structure du fuseau sont permanents ou sont au lieu transitoire et peut être surmonté pour permettre la division cellulaire réussie.

Dans ce protocole, nous décrivons une approche pour évaluer la dynamique de la mitose suivant des perturbations de fuseau par la formation image de cellules vivantes. Utilisation de la lignée cellulaire RPE-1 immortalisée par hTERT conçue pour exprimer un Histone 2B marqué par la DP pour visualiser la chromatine, ainsi qu'une tubuline étiquetée EGFP pour visualiser les microtubules, le moment de l'alignement des chromosomes métaphase, l'enclenchée et, en fin de compte, Le destin de cellule mitotique sont évalués utilisant des indices visuels du mouvement de chromosome, du compactage, et de la morphologie nucléaire.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

1. Génération de cellules hTERT-RPE-1 exprimant de façon stable la DP-Histone 2B (RFP-H2B) et le 'tubulin-EGFP'(tub-EGFP)

REMARQUE : Toutes les étapes suivent des techniques aseptiques et se déroulent dans un coffret de sécurité de niveau de biosécurité II (BSL2MD).

  1. Générer le rétrovirus porteur des gènes d'intérêt (-tubulin-EGFP et RFP-H2B) par la transfection des cellules 293T avec les plasmides lentiviraux appropriés selon les instructions du fabricant du système de transfection à base de lipides.
    1. Jour 1 : Utilisez une pipette Pasteur en verre jetable pour aspirer le milieu de culture cellulaire à partir d'une plaque de cellules 293T sous-confluentes et lavez le milieu résiduel avec de la saline tamponnée en phosphate (PBS) en ajoutant 5 ml de PBS. Tourbillonner pour distribuer PBS sur le fond de la plaque, puis aspirer le PBS avec une pipette stérile en verre pasteur en verre.
    2. Ajouter 2 ml de trypsine de 0,05 % qui a été réchauffé e à 37 oC et remettre la plaque dans un incubateur humidifié à 37 oC avec 5 % de CO2 pendant 2 à 5 min pour permettre aux cellules adhérentes d'être libérées de la surface du plat de culture cellulaire.
    3. Ajouter 8 ml de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) complété par 10 % de sérum bovin fœtal (SGF) et 1 % de pénicilline/streptomycine dans la plaque contenant de la trypsine.
    4. Resuspendre les cellules en pipetilage doucement et transférer la suspension à un tube conique stérile de 15 ml. Placer le tube conique dans une centrifugeuse équilibrée et tourner à 161 x g pendant 5 min à température ambiante pour granuler doucement les cellules.
    5. Aspirez la solution moyenne/trypsine des cellules granulées et resuspendez des cellules dans 10 ml de DMEM complétée s'est complétée par 10% de FBS et 1% de pénicilline/streptomycine. Utilisez un hémocytomètre pour compter la suspension des cellules 293T et la plaque 2 x 106 cellules 293T par puits d'une plaque de 6 puits.
    6. Cellules de culture dans un volume total de 2 ml de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline/streptomycine et de maintenir dans un incubateur humidifié à 37 oC avec 5% CO2.
    7. Jour 2 : Pipette 7 L de réactif de transfection à base de lipides et 100 l de milieu sérique réduit dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml et lui permettre d'incuber à température ambiante pendant 5 min (tube #1).
    8. Dans un tube de microcentrifuge distinct de 1,5 ml, pipette 1 g de vecteur d'expression RFP-H2B (ou 1 g de vecteur d'expression de tubulin-EGFP), ainsi que 5 réagents d'exhausteur de l'année (selon les directives du fabricant), 0,5 g de pMD2.G, et 1 g de psPAX2 et 100 l de milieu sérique (tube #2).
    9. Combinez le contenu de l'étape 1.1.7 et l'étape 1.1.8 en faisant soigneusement la #2 de tube dans le tube #1 et incuber pendant 20 min à température ambiante.
      REMARQUE : La réaction peut être mise à l'échelle au besoin pour la transfection des cellules dans d'autres puits.
    10. Pipette la réaction de transfection goutte à l'heure du puits désiré contenant 293T cellules dans 2 ml de milieu et de retourner le plat à l'incubateur humidifié à 37 oC avec 5% CO2.
      REMARQUE : Pour générer des cellules exprimant à la fois la DP-H2B et le 'tubulin-EGFP,' générer un virus distinct pour chaque construction d'expression (étapes 1.1.7- 1.1.9).
    11. Jour 3: Aspirer et remplacer le milieu par 2 ml de DMEM frais complété s'est complété de 10% FBS et 1% de pénicilline/streptomycine. Remettre le plat à l'incubateur humidifié à 37 oC avec 5 % de CO2.
  2. Jour 4 : Recueillir le milieu contenant des particules virales exprimées, en faisant preuve de prudence pour ne pas perturber ou enlever les cellules 293T. Filtrer le milieu contenant des particules virales en le passant à travers un filtre de 0,45 M attaché à une seringue de 5 ml. Virus Aliquot pour un stockage à court terme à 4 oC, ou un stockage à long terme à -80 oC.
    REMARQUE : Les particules virales obtenues de cette manière seront présentes dans une fourchette de 1 x 107 à 1 x 108 Unités de transduiseur/mL. Comme les cellules et les cellules productrices virales à infecter sont toutes deux cultivées dans le même milieu, la concentration virale pour remplacer le milieu n'est pas nécessaire et les particules virales filtrées peuvent être utilisées directement pour infecter les cellules.
  3. Seed 2 x 105 hTERT-RPE-1 cellules par puits d'un plat de 6 puits en préparation de l'infection virale. Cellules de culture dans 2 ml de DMEM complétées avec 10% FBS et 1% pénicilline/streptomycine et maintiennent dans un incubateur humidifié à 37 oC avec 5% de CO2.
  4. Jour 5 : Ajouter le bromure d'hexadimethrine (p. ex., polybrene) aux cellules hTERT-RPE-1 à une concentration finale de 8 g/mL. Infecter les cellules avec un mélange de 500 l de virus dilué dans 500 l de milieu de culture cellulaire.
    REMARQUE : La solution de stock de bromure d'hexadimethrine est préparée dans de l'eau distillée stérile, puis filtrée à travers un filtre de 0,45 m.
  5. Jour 6: À l'aide d'une pipette Pasteur en verre jetable, aspirer le milieu des puits contenant les cellules infectées par le virus. Remplacer le milieu de culture cellulaire par 2 mL de DMEM contenant 10% de FBS, 1% de pénicilline/streptomycine, et des concentrations appropriées d'antibiotiques à sélectionner pour l'intégration et l'expression plasmide.
    REMARQUE : Le plasmide d'expression de la tubuline-EGFP utilisé dans les expériences décrites porte un gène de résistance à la puromycine et le plasmide d'expression RFP-H2B porte un gène de résistance à la blasticidin. Par conséquent, 10 g/mL de puromycine et 2 g/mL de blasticidin sont utilisés pour la sélection des cellules RPE-1 de la RFP-H2B. Les concentrations d'antibiotiques utilisés pour la sélection peuvent différer pour les différentes lignées cellulaires utilisées.
  6. Maintenir les cellules sous sélection d'antibiotiques pendant 5-7 jours, en remplaçant le milieu tous les 3 jours par un milieu frais contenant des réactifs de sélection appropriés.
    REMARQUE : Les cellules doivent être maintenues à la sous-confluence pendant la sélection et devraient être élargies au besoin, comme décrit dans les étapes 1.1.1 à 1.1.4.
  7. Utilisez l'imagerie par immunofluorescence pour confirmer l'expression des constructions étiquetées.
    REMARQUE : Si désiré, des clones de cellules uniques peuvent être dérivés pour obtenir des niveaux d'expression uniformes au sein de la population cellulaire. Une fois que les clones stables sont confirmés, les cellules peuvent être maintenues dans les conditions de culture standard en l'absence de sélection d'antibiotiques.

2. Préparation des cellules pour l'imagerie cellulaire vivante suite à des perturbations de fuseau mitotique

REMARQUE : Utilisez des techniques aseptiques et effectuez les étapes dans une armoire de sécurité BSL2.

  1. À l'aide d'une pipette pasteur en verre jetable stérile, aspirez le milieu de la plaque de culture contenant la ligne cellulaire qui porte l'expression construct(s) (à partir de l'étape 1.7). Laver brièvement les cellules avec 10 ml de PBS stérile. Tourbillonner pour distribuer PBS sur le fond de la plaque, puis aspirer PBS avec une pipette stérile en verre jetable Pasteur.
  2. Ajouter 2 ml de trypsine de 0,05 % dans la plaque de 10 cm. Incuber la plaque à 37 oC pendant 2-5 min ou jusqu'à ce que les cellules se soient détachées de la surface de la plaque.
  3. Ajouter 8 ml de milieu frais à la plaque contenant de la trypsine. Resuspendre les cellules en pipetilage doucement et transférer la suspension à un tube conique stérile de 15 ml. Placer le tube conique dans une centrifugeuse équilibrée et tourner à 161 x g pendant 5 min à température ambiante pour granuler doucement les cellules.
  4. Aspirez soigneusement le supernatant et resuspend ezif dans 10 ml de PBS en pipetting doucement avec une pipette sérologique de 10 ml. Placer le tube conique dans une centrifugeuse équilibrée et tourner à 161 x g pendant 5 min à température ambiante pour granuler doucement les cellules.
  5. Aspirez soigneusement le supernatant et resuspendez dans 10 ml du milieu frais en pipetting doucement avec une pipette sérologique de 10 ml.
  6. Compter les cellules, puis calculer le nombre cellulaire à l'aide d'un hémacytomètre et diluer à une concentration de 1-2 x 105 cellules/mL dans le milieu de culture cellulaire. Graine 500 l de la suspension cellulaire à chaque puits d'une plaque inférieure stérile de 12 puits d'imagerie. Placez la plaque dans l'incubateur de culture cellulaire et laissez les cellules adhérer à la surface de la plaque.
    REMARQUE : L'imagerie cellulaire vivante exige que les cellules soient bien respectées afin qu'elles restent associées au plan d'imagerie pendant l'acquisition de l'image. La durée du temps nécessaire pour que les cellules adhèrent après le placage peut différer d'une lignée cellulaire à l'autre et devrait être optimisée pour la lignée cellulaire à l'étude.
  7. Jusqu'à 30 minutes avant de commencer l'imagerie en accéléré, ajouter une concentration pertinente d'un médicament mitotique à un ou plusieurs des puits ensedus de cellules. Pour tenir compte de l'impact potentiel du solvant organique sur le comportement cellulaire, ajoutez un volume égal de diluant de l'inhibiteur aux cellules comme témoins. Par exemple, assurez-vous que l'ajout de 100 nM de l'inhibiteur spécifique de la kinase mitotique Aurora A (par exemple, alisertib) est parallèle à un volume égal de DMSO, le diluant pour ce médicament, dans un puits témoin de cellules.
    REMARQUE : L'analyse comparative des changements dynamiques dans la progression mitotique exige des puits des cellules à préparer en l'absence de perturbations pour permettre l'imagerie des mitoses normales en parallèle aux conditions expérimentales.

3. Microscope mis en place pour l'imagerie en accéléré des cellules exprimant esquissées par la DP-H2B, la tubuline-GFP (Figure 1, Figure 2)

  1. Placez la plaque de culture cellulaire contenant la DP-H2B, la tubuline-GFP exprimant les cellules hTERT RPE-1 pour qu'elles soient représentées dans un insert d'étape approprié sur un microscope à épifluorescence inversée équipé d'une caméra haute résolution (taille de pixels de 0,67 m à 20x), un chambre environnementale préchauffé à 37 oC, et un système de livraison pour humidifié 5% CO2.
    REMARQUE : Des chambres environnementales fermées ou des inserts d'étape à température contrôlée peuvent être appropriés à condition que le CO2 humidifié de 5 % puisse être livré et que le contrôle de la température soit obtenu.
  2. Utilisez un objectif d'air 20x avec une ouverture numérique de 0,5 et équipé pour la fluorescence de contraste élevé et le contraste de phase ou l'imagerie brightfield. Voir les cellules avec le contraste de phase ou brightfield et ajuster le cours et la mise au point fine sur le microscope pour mettre les cellules au point.
  3. Identifiez et fixez les temps d'exposition optimaux pour l'acquisition d'images brightfield, GFP et DP en sélectionnant le cube de filtre respectif avec une excitation et une émission appropriées pour les fluorophores qui seront représentés. Vous pouvez également cliquer sur le bouton d'exposition automatique pour entrer un temps d'exposition prédéterminé. Si le signal n'est pas suffisamment intense, sélectionnez le binning de pixel pour permettre des temps d'exposition plus courts en cliquant sur l'onglet binning et en sélectionnant 2 x 2 pixels binning du menu de descente.
    REMARQUE : La phototoxicité peut nuire à la progression mitotique et à la viabilité cellulaire. L'échec des cellules mitotiques dans les populations témoins pour compléter les mitoses normales peut être une indication que les temps d'exposition et / ou la durée de l'imagerie doit être encore optimisée.
  4. Utilisez un logiciel d'acquisition et d'analyse qui permet d'acquérir simultanément l'imagerie multi-coordonnées et multi-puits et de définir les paramètres de l'acquisition d'images.
    1. Sélectionnez et étalonnez l'étape du microscope pour le plat multi-puits, selon les instructions du fabricant. Utilisez le logiciel d'acquisition d'images pour mettre en évidence ou sélectionner les puits qui seront photographiés en cliquant sur les puits pertinents dans le diagramme du format de plaque qui est utilisé.
    2. Sous le panneau de contrôle GeneratedPoints (Figure 2), définissez les coordonnées de chaque puits qui seront représentées en cliquant sur l'onglet Point Placement et en sélectionnant le placement de coordonnées prédéfinis ou aléatoires à partir de le menu de baisse. Sélectionnez l'onglet Zone de travail et sélectionnez restreint dans le menu déroulant pour limiter la zone de sélection de coordonnées afin d'exclure les limites du puits. Cliquez sur les onglets Compter et Distribution pour sélectionner le nombre et la distribution des points à capturer par puits, respectivement.
      REMARQUE : Le nombre de coordonnées pouvant être représentées par puits dans l'incrément de 5 minutes sera limité par le nombre de puits à imager, ainsi que par le temps d'exposition de chaque canal. Typiquement, 5-8 coordonnées par puits sont suffisantes pour observer au moins 50 cellules dans chaque progression de condition par mitose dans un délai de 4 h.
    3. Sélectionnez et entrez l'intervalle de temps et la durée pour collecter des images en cliquant sur et en entrant les valeurs dans le panneau de contrôle TimeSequence.
      REMARQUE : L'acquisition d'images toutes les 1 à 5 minutes est appropriée pour surveiller la dynamique de la progression mitotique. La durée globale de l'imagerie devrait refléter le point de terminaison et le taux de prolifération souhaités de la lignée cellulaire. Par exemple, 4 heures est suffisante pour voir de nombreuses cellules progresser à travers la mitose, 16 heures est suffisante pour voir la plupart des cellules RPE-1 dans une population asynchrone progresser par mitose.

4. Analyse d'image time-lapse pour déterminer le moment de la métaphase et le sort des cellules mitotiques à la suite de perturbations mitotiques du fuseau

REMARQUE : Effectuez l'analyse d'image à l'aide d'un logiciel d'acquisition d'images(Tableau des matériaux),ImageJ, ou d'un logiciel d'analyse d'images comparable.

  1. Visualisez la chromatine étiquetée RFP-H2B en sélectionnant les images capturées avec le cube de filtre DeP en place. Identifiez une cellule entrant dans la mitose telle qu'indiquée par le compactage initial de la chromatine(figure 2C, tête de flèche bleue) et l'enveloppe nucléaire se décomposent (lorsque l'émabuline-EGFP n'est plus exclue par la limite nucléaire).
  2. Déterminer le moment mitotique de l'alignement des métaphases et de l'apparition de l'anaphase dans les cellules individuelles : Suivez la cellule à travers des points de temps consécutifs dans le film acquis afin de déterminer le nombre de points de temps/minutes entre l'entrée mitotique jusqu'à la chromatine étiquetée RFP-H2B complète l'alignement à l'équateur cellulaire pendant la métaphase(figure 2C, pointe de flèche jaune).
  3. Pour surveiller le moment mitotique, la fidélité mitotique et le destin cellulaire, continuez à suivre la cellule à travers des moments consécutifs afin d'identifier le temps de coordination à partir duquel la ségrégation chromosomique anaphase est apparente (figure 2C, tête de flèche blanche) et/ou où la décompaction de chromatine et la réforme de l'enveloppe nucléaire (comme indiqué par l'exclusion de la tubuline du noyau) se sont produites.
    REMARQUE : Les perturbations dans l'assemblage de fuseau ou la progression mitotique peuvent être évaluées en fonction du temps requis pour obtenir un fuseau mitotique bipolaire et réaliser l'alignement complet de chromosome, ou pour accomplir la ségrégation de chromosome d'anaphase.
  4. Visualisez RFP-H2B pour identifier les cellules de chaque population qui présentent des défauts mitotiques, y compris les chromosomes en retard et les ponts de chromatine pendant la ségrégation chromosomique anaphase.
    REMARQUE : La fidélité mitotique compromise peut également entraîner des cellules filles multinuculées ou micronuculées et peut être visualisée dans les cellules post-sortie mitotique, comme dans la figure 3.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Évaluation de la progression mitotique en présence de perturbations de fuseau
La régulation de la mise au point du pôle de fuseau est une étape essentielle dans la formation bipolaire appropriée de fuseau. Perturbation dans ce processus par des épuisements de protéine, inhibition de drogue, ou des changements dans la structure corrompue de fuseau de nombre centrosome et retardent ou arrêtent la progression mitotique10,

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

La résolution temporelle fournie par l'imagerie en time-lapse permet la visualisation et l'évaluation des événements cellulaires séquentiels dans les cellules individuelles. Les approches qui font usage de la synchronisation cellulaire suivie de la collecte et de la fixation des cellules aux points de temps séquentiels sont limitées en ce sens que les comparaisons sont finalement faites entre les populations de cellules. Dans les contextes où la réponse cellulaire aux perturbations peut être non uniforme, ou où le proces...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

DLM est soutenu par un GRFP NSF. ALM bénéficie d'un financement du Smith Family Award for Excellence in Biomedical Research.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,05 % TrypsineGibo-Life sciences25-510Une protéase à sérine utilisée pour libérer les cellules adhérentes des boîtes de culture
Tubes à centrifuger de 15 mlOlympus Plastics28-101
20x CFI Plan Objectif fluor  ;NikonPour l’imagerie de cellules vivantes pour visualiser à la fois le fond clair et la fluorescence
Cellules 293TATCCCRL-3216Pour une utilisation dans la transfection rétrovirale ; utilisé à l’étape 1.1
a-tubuline-EGFP  ;Addgenedivers nombresVecteur d’expression de la tubuline alpha fusionnée à une étiquette de protéine fluorescente verte ; pour utilisation dans la visualisation de la tubuline dans l’imagerie de cellules vivantes : disponible dans le commerce auprès d’addgene et d’autres fournisseurs
AlisertibSelleckchemS1133Inhibiteur de la kinase mitotique Aurora A. La concentration de stock est préparée à 10 mM dans le DMSO et utilisée à une concentration finale de 100 nM.
BlasticidineInvitrogenA11139-03Agent de sélection d’antibiotiques ; utilisé pour sélectionner les cellules exprimant A-tub-EGFP
C02AirgasPour une utilisation dans la culture cellulaire et l’imagerie de cellules vivantes
Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3)Chroma49005Jeu de filtres monobande ; longueur d’onde d’excitation 545 nm avec une bande passante de 25 nm et émission à une longueur d’onde de 605 nm avec une largeur de bande de 70 nm ; pour la visualisation de H2B-RFP
Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2)Chroma49002Jeu de filtres monobande ; longueur d’onde d’excitation 470nm avec bande passante 40nm et émission à 525nm longueur d’onde avec bande passante 50nm ; pour la visualisation de
pipettes Pastuer en verre jetables GFP-tubuline, stérilisées  ;Fisher Scientific13-678-6APour une utilisation dans les cellules d’aspiration  ;
Dulbecco' s Milieu Eagle modifié (DMEM)Gibo-Life sciences11965-084Milieu de culture cellulaire pour la croissance des cellules RPE-1 et 293T
Sérum fœtal bovin (FBS)Gibo-Life sciences10438-026Supplément de milieu de culture cellulaire
Lipofectamine 3000 et p3000InvitrogenL3000-015Réactif de transfection à base de lipides pour la transfection de plasmides ; utilisé dans 1.1.4
Boîtes de culture tissulaire multipuitsCorningdiverspour une utilisation dans la culture cellulaire, la transfection/infection et l’imagerie de cellules vivantes
Microscope Nikon Ti-EMicroscope à épifluorescence inversée Nikon pour une utilisation dans l’imagerie de cellules vivantes
NikonVersion 4.51Logiciel d’acquisition et d’analyse d’images ; utilisé dans les sections 3 et 4
OPTI-MEMGibo-Life sciences31985-070Milieu sérique réduit pour la transfection cellulaire ; utilisé à l’étape 1.1.3
Pénicilline/Streptomycine  ;Gibo-Life sciences15140-122antibiotique utilisé dans le milieu de culture cellulaire
solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Caisson labsPBP06-10X1LTsolution saline stérile pour utilisation avec la culture cellulaire
pMD2.GAddgene12259Construction d’expression de l’enveloppe lentivirale VSV-G ; utilisé à l’étape 1.1.4
PolybreneSigma-AldrichH9268Polymère cationique utilisé pour améliorer l’efficacité de l’infection virale ; utilisé à l’étape 1.1.10
psPAXAddgene12260Plasmide d’emballage lentiviral de 2e génération ; utilisé à l’étape 1.1.4
PuromycinInvitrogenant-pr-1Agent de sélection d’antibiotiques ; utilisé pour sélectionner les cellules exprimant RFP-H2B
RFP- Histone 2B (H2B)Addgenedivers numérosVecteur d’expression de l’histone 2B marquée à une protéine fluorescente rouge ; pour une utilisation dans la visualisation de la chromatine dans l’imagerie de cellules vivantes : disponible dans le commerce auprès d’Addgene et d’autres fournisseurs
RNAi MaxInvitrogen13778-150Réactif de transfection à base de lipides pour la transfection de structures d’ARNi
Cellules RPE-1ATCCCRL-4000Lignée cellulaire épithéliale de pigment rétinien humain
Boîte de culture tissulaire 100x20mmCorning  ;353003pour une utilisation dans la culture de cellules adhérentes
Zyla sCMOS camera  ;Nikonfixé au microscope, utilisé pour capturer des images de cellules
NIS Elements HC  ;Appareil photo

Références

  1. Szuts, D., Krude, T. Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage. Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).
  2. Gayek, A. S., Ohi, R. CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis. PLoS One. 11, e0157491(2016).
  3. Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint. The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).
  4. Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells. Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).
  5. Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes & Development. 22, 2189-2203 (2008).
  6. Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
  7. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).
  8. van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 76, 1101-1112 (2015).
  9. Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death and Diseases. 3, 411(2012).
  10. Martin, M., Akhmanova, A. Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization. Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).
  11. Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).
  12. Vitre, B. D., Cleveland, D. W. Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy. Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).
  13. Godinho, S. A., Pellman, D. Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).
  14. Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes. Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).
  15. Conte, N., et al. TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer. Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).
  16. Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 125, 4391-4402 (1998).
  17. Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces. Molecular Cancer. 10, 131(2011).
  18. Chan, J. Y. A clinical overview of centrosome amplification in human cancers. International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).
  19. Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death. Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).
  20. Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
  21. Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4, e6564(2009).
  22. Nigg, E. A. Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression? Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).
  23. Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).
  24. Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering. Science. 307, 127-129 (2005).
  25. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Marqueurs marqu s par fluorescencemicrotubules de la chromatineanalyse de la formation du fuseausuivi de la progression mitotiqueidentification des d fauts mitotiquesvaluation de la dynamique du fuseauanalyse du devenir des cellules mitotiques
Imagerie cellulaire en direct pour évaluer la dynamique du moment de la métaphase et le destin cellulaire à la suite de perturbations mitotiques spindle
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.