Les tests d'interaction de co-culture présentés dans ce protocole sont peu coûteux, haut débit, et simple. Ces essais peuvent être utilisés pour observer les interactions microbiennes dans la co-culture, identifier les modèles d'interaction et caractériser le potentiel inhibiteur d'une souche microbienne d'intérêt contre les agents pathogènes humains et environnementaux.
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Article de méthode
Tests de co-culture à haut débit pour l'étude des interactions microbiennes
Dans cet article
Résumé
Résumé
L'étude des interactions entre micro-organismes a mené à de nombreuses découvertes, allant de nouveaux antimicrobiens à des connaissances en écologie microbienne. De nombreuses approches utilisées pour l'étude des interactions microbiennes nécessitent un équipement spécialisé et sont coûteuses et chronoplient. Cet article présente un protocole pour les tests d'interaction de co-culture qui sont peu coûteux, évolutifs à de grands nombres d'échantillons, et facilement adaptables à de nombreuses conceptions expérimentales. Les micro-organismes sont cultivés ensemble, chacun représentant une combinaison de micro-organismes. Un organisme d'essai est cultivé d'un côté de chaque puits et est d'abord incubé en monoculture. Par la suite, les organismes cibles sont simultanément inoculés sur le côté opposé de chaque puits à l'aide d'un timbre d'inoculation imprimé en 3D. Après la co-culture, les essais terminés sont notés pour les phénotypes visuels, tels que la croissance ou l'inhibition. Ces essais peuvent être utilisés pour confirmer les phénotypes ou identifier les modèles parmi les isolats d'intérêt. Grâce à cette méthode simple et efficace, les utilisateurs peuvent analyser les combinaisons de micro-organismes rapidement et efficacement. Cette approche de co-culture s'applique à la découverte d'antibiotiques ainsi qu'à la recherche sur le microbiome basée sur la culture et a déjà été appliquée avec succès aux deux applications.
Introduction
Dans la nature, les micro-organismes existent rarement isolément; par conséquent, ils interagissent constamment avec d'autres organismes. Par conséquent, l'étude de la façon dont les micro-organismes interagissent les uns avec les autres est essentielle pour comprendre une multitude de comportements microbiens1. Les interactions microbiennes peuvent être mutualistes, commensales ou antagonistes. Ces teractions peuvent affecter non seulement les micro-organismes eux-mêmes, mais aussi les environnements et les hôtes que les micro-organismes colonisent1,2.
De nombreux scientifiques étudient les interactions microbiennes pour identifier de nouvelles molécules antimicrobiennes. L'une des premières molécules antimicrobiennes cliniquement importantes a été trouvée grâce à l'étude des interactions microbiennes. Sir Alexander Fleming a observé un isolat contaminant de penicillium qui a inhibé la croissance d'une souche de Staphylococcus, qui a mené à la découverte de la pénicilline antibiotique couramment utilisée3. La caractérisation des mécanismes que les micro-organismes utilisent pour contrarier leurs concurrents reste une ressource fructueuse pour la découverte de molécules antimicrobiennes. Par exemple, il a été récemment montré que Streptomyces sp. souche Mg1 produit des linearmycins antibiotiques, qui ont une activité lytique et dégradative contre Bacillus subtilis4.
En outre, un peptide non-ribosomally synthétisé nommé lugdunin a été récemment découvert après l'observation que nasal commensal Staphylococcus lugdunensis inhibe Staphylococcus aureus5. Des études ont également montré que les interactions mutualistes entre micro-organismes sont tout aussi puissantes que les interactions antagonistes pour la découverte de molécules antimicrobiennes. Par exemple, de nombreuses fourmis cultivantes de champignons de la tribu Attini abritent des bactéries symbiotiques appelées Pseudonocardia sur leur exosquelette qui produit des molécules antifongiques pour inhiber un agent pathogène obligatoire de leur culture fongique6. Comme l'étude des interactions microbiennes a été bénéfique pour la découverte de molécules antimicrobiennes, l'utilisation d'écrans à haut débit peut entraîner la découverte de nouvelles molécules antimicrobiennes.
En ce qui concerne le coût et la facilité de performance, les méthodologies utilisées pour étudier les interactions microbiennes vont de simples à complexes. Par exemple, un test de prise d'agar est une méthode peu coûteuse et simple qui peut être employée pour étudier l'antagonisme entre les micro-organismes multiples7. Cependant, un analyse de prise d'agar n'est pas une procédure efficace et peut être laborieux pour beaucoup de combinaisons pairewise. Pour évaluer les effets des produits produits microbiens sur les isolats cibles d'intérêt d'une manière à haut débit, de nombreux laboratoires utilisent des tests de diffusion de disques8. Ces essais sont faciles et peu coûteux et peuvent être évolutifs à un nombre plus élevé d'échantillons7. Cependant, cet essai nécessite la production d'extraits microbiens et peut produire des résultats trompeurs pour certaines combinaisons d'organismes cibles et d'antibiotiques, tels que Salmonella et céphalosporines9.
Les approches précédentes reposent sur des composants isolés pour susciter une réponse dans un organisme cible, au lieu de permettre aux micro-organismes d'interagir les uns avec les autres. Ceci est à noter parce que les interactions entre les microbes peuvent provoquer la production de molécules antimicrobiennes « cryptiques » qui ne sont pas produites en monoculture. Par exemple, il a été récemment démontré que le keyicine antimicrobien n'est produit que par un Micromonospora sp. lorsqu'il est co-cultivé avec un Rhodococcus sp. qui est isolé du microbiome éponge même10. Des méthodologies d'interaction plus complexes contournent cet obstacle potentiel de monoculture. Par exemple, l'iChip est utile pour isoler les bactéries rares et difficiles à cultiver à partir d'échantillons environnementaux et permet l'observation des interactions microbiennes par la croissance in situ11. Pour étudier les interactions en détail, la spectrométrie de masse d'imagerie par imagerie par imagerie par imagerie par laser assistée par matrice (MALDI-TOF-IMS) peut être utilisée. Cette approche fournit des informations détaillées sur la composition et la distribution de petites molécules et peptides produites par des colonies microbiennes en interaction avec une haute résolution spatiale. MALDI-TOF-IMS a également été utilisé dans de multiples études d'interactions bactériennes pour caractériser les mécanismes de la concurrence12,13,14,15. Cependant, MALDI-TOF-IMS nécessite souvent une préparation laborieuse d'échantillons, une expertise spécialisée pour faire fonctionner l'équipement et des spectromètres de masse coûteux et spécialisés. Pour ces raisons, il est difficile d'utiliser une technique pour les études à haut débit. Ainsi, un test de co-culture simple, évolutif et à haut débit pour les interactions microbiennes qui surmonte de nombreuses limites des approches ci-dessus serait bénéfique.
Ici, un protocole pour la co-culture microbienne à haut débit est présenté. Cet test est simple et facilement intégré dans les études préexistantes des interactions microbiennes. Contrairement à de nombreuses méthodes couramment utilisées pour l'étude des interactions microbiennes, notre méthode est simple, peu coûteuse, et est prête à étudier un grand nombre d'interactions. Ces essais sont non seulement faciles à réaliser, mais les matériaux sont largement disponibles auprès de la plupart des fournisseurs de laboratoire ou des ressources publiques (p. ex., bibliothèques et makerspaces). Par conséquent, cet analyse est avantageux comme première ligne d'investigation pour identifier et analyser les modèles intéressants parmi de nombreuses combinaisons de micro-organismes, ce qui peut être particulièrement utile pour l'étude de l'écologie microbienne.
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Protocole
Le consentement éclairé a été obtenu des parents du donneur, et le Comité des sujets humains de l'Université du Wisconsin-Madison a approuvé l'étude (Numéro d'approbation H-2013-1044 de la Commission d'examen institutionnel [IRB]).
1. Culture d'échantillon
REMARQUE: Cette procédure est utilisée ici pour l'étude des interactions entre les isolats bactériens de la cavité nasale humaine. En principe, les méthodes suivantes s'appliquent à toute condition de culture. Le bouillon d'infusion de cerveau-coeur (BHI) est employé pour la propagation générale des bactéries nasaux. Toutes les plaques sont solidifiées à l'aide de 1,5% d'agar. Pour cette étude, des échantillons sont prélevés à partir d'une solution saline rincée dans le nez d'un donneur (lavage nasal), transférée dans des tubes microcentrifugeurs et congelée à -80 oC.
- Utilisez des techniques de culture standard pour déposer 100 oL de chacun des échantillons de lavage décongelés sur des plaques d'IBH.
- Incuber les plaques aérobiement à 37 oC pendant 1 semaine.
- Après l'incubation, sélectionnez 2 colonies de chaque morphotype distinct par plaque et passageez les isolats aérobiement sur les plaques DE BHI en stries d'une colonie de la plaque initiale sur une nouvelle plaque DE BHI et en couvant la plaque à 37 oC. Répétez l'opération jusqu'à ce que les cultures bactériennes soient pures.
REMARQUE: Les isolats bactériens peuvent être identifiés par la morphologie de colonie, le gram-staining, le séquençage de gène de rRNA de 16S, ou une autre méthode. Cependant, connaître l'identité de l'isolat n'est pas nécessaire pour poursuivre le protocole. - Cryopreserve tous les isolats bactériens à -80 oC après avoir combiné 1 ml de glycérol à 50 % avec 1 ml de culture bactérienne de nuit (voir la section 3) dans des cryotubes.
2. Timbres d'impression 3D
REMARQUE: Le polycarbonate a été choisi comme matériau d'estampage en raison de sa température de transition en verre élevée (147 oC) qui dépasse les températures autoclaves standard (121 oC), ce qui minimise le risque de déformation après des utilisations répétées.
- Chargez l'imprimante 3D avec du filament en polycarbonate.
- Appliquer de la colle d'école blanche (acétate de polyvinyle) sur le lit d'impression pour faciliter l'adhérence et minimiser la déformation du timbre d'inoculation pendant l'impression.
- Chargez le . Fichier modèle STL (Fichier de données supplémentaires) pour le timbre d'inoculation ( Figure1) dans le logiciel d'imprimante 3D.
- Imprimez le timbre d'inoculation à une température de buse de 290 oC, à une température de lit de 60 oC et à une hauteur de couche de 0,38 mm.
- Envelopper le timbre dans le papier d'aluminium et stériliser en autoclant pendant 1,5 h sur un cycle de gravité avec 15 min de séchage.
REMARQUE: Bien que le polycarbonate soit hygroscopique, les timbres ne conservent qu'environ 0,5 % de poids de l'eau après l'autoclacage.
3. Préparation des cultures de nuit
- À l'aide d'une pipette sérologique, pipette 3 mL de bouillon stérile BHI dans des tubes de culture de 14 ml.
- À l'aide d'une boucle inoculation stérile de 1 oL, inoculer une colonie bactérienne dans le bouillon. Faites pivoter la boucle pour s'assurer que le bouquet se disperse dans le bouillon. Vortex les tubes de culture peu avant l'incubation.
- Incuber les tubes de culture à 37 oC pendant la nuit (16 h) sur un shaker à 250 tr/min.
- Vortex pour briser les amas de cellules une fois que les cultures bactériennes atteignent une turbidité suffisante (OD600 - 1).
4. Préparation des plaques de bioanalyse
REMARQUE: Les plaques de bio-analyse sont préparées dans une hotte à débit laminaire pour maintenir la stérilité.
- Préparer les supports BHI avec 1,5% d'agar et stériliser en autoclantant selon les instructions du fabricant.
- Après l'autoclage, refroidir le support BHI à 55 oC dans un bain d'eau à température contrôlée.
- À l'aide d'une pipette sérologique, la pipette 3 ml de support BHI fondu dans chacun des 12 puits sur une plaque de 12 puits. Assurez-vous que les puits sont aussi précis et même que possible. Un litre de support produira 27 plaques de bioanalyse.
- Laisser l'agar se reposer toute la nuit.
5. Inoculation des plaques de bioanalyse avec l'organisme d'essai
REMARQUE: Un organisme d'essai se réfère à l'organisme pour lequel la production d'activité inhibitrice (p. ex., la production d'antibiotiques) est déterminée à l'aide de l'analyse d'interaction de co-culture. Pour cette expérience, les organismes testés sont des Actinobactéries isolées à partir d'échantillons de lavage sas.
- Inoculer l'organisme d'essai sur une plaque de bio-analyse en insérant une boucle inoculation stérile de 10 l dans la culture de la nuit et en stries d'une gouttelette de culture sur le tiers gauche d'un puits de plaque.
REMARQUE: Il est recommandé de ne strier qu'un tiers du puits, car la surcroissance du puits interdit l'inoculation ultérieure d'organismes cibles. - Répétez l'opération jusqu'à ce que les 12 puits de la plaque aient été inoculés avec l'organisme d'essai.
- Incuber les plaques à l'envers à la température appropriée pendant 7 jours. À des températures plus élevées (37 oC) ou dans des climats plus secs, entreposez les plaques dans un contenant humide pour empêcher les plaques de se dessécher.
6. Préparation d'organismes cibles
REMARQUE: Un organisme cible se réfère à l'organisme dont le statut d'inhibition est déterminé à l'aide de l'exemple d'interaction de co-culture. Pour cette expérience, les organismes cibles sont Staphylococcus spp. isolés à partir d'échantillons de lavages nasaux.
- Après avoir incubé les plaques de bio-analyse pendant 6 jours, préparer les cultures de nuit des organismes cibles spécifiés, comme cela a été fait ci-dessus (voir la section 3).
7. Inoculation d'organisme cible
REMARQUE: Après l'incubation de nuit, assurez-vous que les cultures sont turbides (OD600 -1). Certaines cultures bactériennes peuvent flocculer au bas du tube de culture. Vortex les tubes de culture pour disperser les touffes et évaluer la turbidité de la culture.
- Préparer la plaque cible en remplissant chaque puits d'une plaque de 12 puits vide avec 1,8 ml de BHI et 200 l de la culture cible du jour au lendemain.
- Déballez et placez un timbre d'inoculation stérile dans la plaque cible. Faites tournoyer doucement les cultures dans les puits, en prenant soin de s'assurer que les cultures ne contaminent pas les puits voisins.
- Soulevez le timbre d'inoculation et assurez-vous qu'il y a une gouttelette de culture cible diluée sur chaque pointe de timbre.
-
Préparer une plaque de contrôle de monoculture en plaçant le timbre d'inoculation sur une plaque de bio-analyse non inoculée et basculer doucement le timbre de sorte qu'une goutte de culture inocule chaque puits. Une fois le timbre d'inoculation enlevé, une gouttelette de culture doit être visible dans les puits de la plaque de bio-analyse.
- Si les puits ne sont pas inoculés avec le timbre d'inoculation en raison de niveaux inégaux de médias, placez 3 ll de culture diluée de nuit sur le côté droit des puits à l'aide d'une pipette.
- Inoculer les plaques de bio-analyse comme ci-dessus (voir l'étape 7.4.1), mais aligner le timbre de sorte que les pointes s'alignent avec le côté droit de la plaque de puits 12. Assurez-vous que le timbre ne communique pas avec la colonie bactérienne existante lors de l'inoculation des puits.
- Retirez soigneusement le timbre et replacez-le dans la plaque cible.
- Répétez l'inoculation pour chaque plaque de bio-analyse jusqu'à ce que toutes les plaques soient inoculées.
- Incuber les plaques de bio-analyse à l'envers à la température appropriée pendant 7 jours.
8. Notation
-
Après avoir co-culturé le test et ciblé les organismes pendant 1 semaine, marquer les interactions en fonction de l'évaluation visuelle suivante :
- Marquer les puits avec la croissance de l'organisme cible qui présente une croissance qui est indiscernable du contrôle de la monoculture comme «0» (pas d'inhibition) (Figure 2A,B).
- Marquer les puits avec l'organisme cible qui présente une croissance diminuée par rapport au contrôle comme «1» (faible inhibition) (Figure 2C).
- Marquer les puits où l'organisme cible n'a pas grandi comme «2» (forte inhibition) (Figure 2D).
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Résultats
Les tests d'interaction de co-culture peuvent être utilisés pour comprendre les interactions microbiennes, identifier les modèles d'intérêt et découvrir des isolats microbiens avec des activités intrigantes. Dans ces essais, un organisme d'essai est monoculturel sur un côté d'une plaque d'agar de 12 puits et incubé pendant 7 jours. Par la suite, un organisme cible est repéré à côté de l'organisme d'essai et les deux microbes ont été co-cultivés pendant 7 jours avant de marquer pour le phé...
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Discussion
Les antibiotiques et autres métabolites secondaires qui font la médiation des interactions microbiennes sont utiles pour une multitude d'applications, y compris la découverte de médicaments. Ici, un protocole pour les essais de co-culture pour évaluer un grand nombre d'interactions microbiennes est présenté. Ces tests d'interaction de co-culture sont un moyen simple, abordable, évolutif, et haut débit pour étudier de nombreuses combinaisons de micro-organismes en tandem. Les organismes cibles sont repérés à côté d'organi...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Remerciements
Nous remercions Daniel May, Marc Chevrette et Don Hoang pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail, y compris les efforts de Cameron R. Currie, a été soutenu par l'Université du Wisconsin-Madison, Bureau du vice-chancelier pour la recherche et l'éducation des diplômés avec un financement de la Wisconsin Alumni Research Foundation, financement également fourni par le National Institutes of Health Centers for Excellence for Translational Research (U19-AI109673-01). Reed M. Stubbendieck a reçu l'appui d'une subvention de formation de la Bibliothèque nationale de médecine au Programme de formation en informatique et en informatique en biologie et en médecine (NLM 5T15LM007359). Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'interprétation des données, ni dans la décision de soumettre l'œuvre à la publication.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 1 &mu ; L Boucles d’inoculation jetables en polystyrène, bleu | VWR | 12000-806 | |
| 10 &mu ; Boucles d’inoculation jetables en polystyrène L, plaque de | VWR | 12000-810 | |
| 12 puits, stérile avec couvercle | Greiner bio-one | 665 180 | |
| Tube à fond rond en polystyrène de 14 ml, 17 x 100 mm |
Références
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Réimpressions et autorisations
