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Article de méthode

Approche expérimentale pour examiner la signalisation de leptine dans les corps carotides et ses effets sur le contrôle de la respiration

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DOI :

10.3791/60298

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25 octobre 2019

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Johns Hopkins University, 2Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Respiratorias (CIBERES), Hospital Universitario Virgen del Rocío/Universidad de Sevilla

Dans cet article

Résumé

Notre étude se concentre sur les effets de la signalisation de leptine dans le corps carotide (CB) sur la réponse ventilatoire hypoxique (HVR). Nous avons effectué des expériences de « perte de fonction » mesurant l'effet de la leptine sur le HVR après la dénervation CB et les expériences de « gain de fonction » mesurant le HVR après surexpression du récepteur de la leptine dans CB.

Résumé

Une hormone produite par l'adipocyte la leptine est un stimulant respiratoire puissant, qui peut jouer un rôle important dans la défense de la fonction respiratoire dans l'obésité. Les corps carotides (CB), un organe clé de la sensibilité hypoxique périphérique, expriment le long isoforme fonctionnel du récepteur de la leptine (LepRb) mais le rôle de la signalisation de lepin dans le contrôle de la respiration n'a pas été entièrement élucidé. Nous avons examiné la réponse ventilatoire hypoxique (HVR) (1) chez les souris C57BL/6J avant et après l'infusion de leptine à la ligne de base et après la dénervation de CB ; (2) dans LepRb-déficients obèses souris db/db à la ligne de base et après le lepRb surexpression dans les CBs. Dans les souris de C57BL/6J, le leptin a augmenté HVR et les effets de la leptine sur HVR ont été supprimés par la dénervation de CB. Chez les souris db/db, l'expression lepRb en CB a augmenté le HVR. Par conséquent, nous concluons que la leptine agit dans CB pour augmenter les réponses à l'hypoxie.

Introduction

Un adipocyte produit des actes d'hormone de leptine dans l'hypothalamus pour supprimer la prise de nourriture et augmenter le taux métabolique. Les études exécutées dans notre laboratoire1,2 et par d'autres investigateurs3,4 ont prouvé que le leptine augmente la réponse ventilatoire hypercapnique (HVR) empêchant l'hypoventilation d'obésité dans la leptine l'obésité déficiente. Cependant, une majorité d'individus obèses ont des niveaux élevés de leptine de plasma et démontrent la résistance aux effets métaboliques et respiratoires de l'hormone5,6,7,8. La résistance à la leptine est multifactorielle, mais la perméabilité limitée de la barrière hémato-encéphalique (BBB) à la leptine joue un rôle majeur. Nous proposons que la leptine agit au-dessous de BBB dans un organe clé de la sensibilité hypoxique périphérique, les corps carotides (CB), pour défendre la respiration dans les individus obèses. Les CB expriment le long isoforme fonctionnel du récepteur de lepin, LepRb, mais le rôle de CB dans les effets respiratoires de la leptine n'a pas été suffisamment élucidé9,10.

Le but de notre méthode était d'examiner l'effet de la signalisation de leptine dans le CB sur HVR. Notre justification était d'effectuer (a) la perte des expériences de fonction infusant la leptine chez les souris avec les corps carotides intacts et les corps carotides denervated suivis des mesures de HVR ; b) gain d'expériences fonctionnelles chez des souris db/db dépourvues de LepRb, dans lesquelles nous avons mesuré le HVR à la ligne de base et après l'expression de LepRb exclusivement en CB. L'avantage de nos techniques était que nous avons effectué toutes nos expériences chez des souris non anésiles non retenues pendant le sommeil et l'éveil. Les chercheurs précédents ont effectué leurs expériences sous anesthésie9 ou n'ont pas mesuré les effets de la leptine pendant le sommeil10. En outre, notre étude est la première à utiliser un gain unique de l'approche de fonction avec l'expression sélective de LepRb dans CB décrit ci-dessus.

Dans le contexte général, notre approche peut être généralisée à d'autres récepteurs exprimés dans CB et leur rôle dans la sensibilité hypoxique. Les investigateurs peuvent infuser un ligand à un récepteur d'intérêt et mesurer le HVR à la ligne de base et après la dénervation de CB. En tant qu'approche complémentaire, un récepteur d'intérêt peut être surexprimé dans les mesures CB et HVR peuvent être effectuées avant et après la surexpression en utilisant notre technologie décrite dans ce manuscrit.

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Protocole

Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (MO18M211).

1. Infusion de leptin

REMARQUE: Afin d'examiner l'effet de la leptine sur la respiration, nous avons infusé la leptine sous-cutanée dans les souris maigres c57BL/6J par une pompe osmotique pour augmenter les niveaux circulants de leptine à ceux observés chez les souris obèses.

  1. Préparation de la pompe osmotique
    1. Peser la pompe vide pour vérifier le poids net de la solution chargée.
    2. Ajouter la leptine (5 mg/ml) à la pompe osmotique (1 l/h pendant 3 jours). Remplir la pompe d'une petite seringue (1 ml). Après le remplissage, fermez la pompe avec le tube de remplissage de 27 jauges à pointe émoussée fourni.
      REMARQUE: La seringue et le tube attenant doivent être exempts de bulles d'air.
    3. Après le remplissage, peser la pompe à nouveau pour vérifier le poids net de la solution.
    4. Insérez la pompe à leptine sous-cutanée dans la zone interscapulaire.
      REMARQUE :       Si vous voulez commencer l'infusion immédiatement, incubez la pompe préremplie dans la saline stérile à 37 oC pendant au moins 4 à 6 h (de préférence pendant la nuit).

2. Réponse ventilatoire hypoxique (HVR)

REMARQUE: Les conditions thermoneutres éliminent les facteurs stressants imposés par la température ambiante fraîche et modifient considérablement le métabolisme chez les souris. Par conséquent, toutes les mesures respiratoires doivent être effectuées dans les conditions thermoneutres (t ' 30 oC) à l'aide d'un incubateur néonatal12 (figure 1A). L'ensemble de la chambre de pléthysmographie du corps (WBP) a été utilisé pour toutes les mesures. Tous les animaux doivent être acclimatés à la chambre de pléthysmographie barométrique et à un collier de cou simulé pour l'enregistrement ultérieur d'oxymétrie d'impulsion pendant 3-5 jours avant les mesures de HVR. HVR est enregistré entre 10 h et 17 h. Le HVR est supprimé pendant le sommeil, c'est pourquoi il peut être mesuré séparément pendant le sommeil et l'éveil tranquille13. Pour assurer le stade spécifique de veille-sommeil de l'animal pendant la mesure de HVR, les électrodes d'EEG/EMG devraient être implantées comme headmount d'EEG/EMG comme précédemment décrit14. Les animaux doivent être autorisés à récupérer pendant au moins 72 h après le front. La mise en scène de sommeil doit être exécutée dans 5 s époques. Le sommeil NREM est reconnu par l'activité eEG à ondes lentes occupant plus de 50% de l'époque. L'éveil tranquille se manifeste par l'activité alpha EEG en l'absence de mouvements. Le sommeil paradoxal est identifié par l'activité prédominante d'Alpha et de theta EEG en présence du tonus musculaire réduit sur EMG. Typiquement, le sommeil paradoxal n'est pas observé pendant les défis de gaz de HVR.

  1. Le protocole d'enregistrement HVR
    1. Utilisez la chambre WBP de la taille suivante : diamètre interne de 80 mm, hauteur de 50,5 mm et volume de 0,4 L. La chambre WBP se compose de deux chambres, des chambres scellées et de référence, et d'une plate-forme circulaire pour placer la souris14 (figure 1B). L'entrée et l'écoulement à l'intérieur de la chambre sont contrôlés par des sources de pression positives et négatives qui maintiennent la pression atmosphérique. Ce contrôle crée un flux de biais régulier dans la chambre et empêche la rétention de CO2. Pour plus de détails sur la mise en place du WBP, voir Hernandez et ses collègues15.
    2. Mesurez la température à l'intérieur de la chambre et l'humidité relative dans la pièce avant de placer la souris dans le WBP.
    3. Mesurer le poids corporel et la température rectale.
    4. Placez le collier d'oxymètre autour du cou de la souris (la zone doit être déjà rasée).
    5. Placez la souris à l'intérieur du WBP et assurez-vous que la chambre est complètement scellée afin d'éviter les fuites d'air.
    6. Attendez environ 30 min jusqu'à ce que la souris soit silencieuse et que la chambre soit à un volume constant.
    7. Normoxia: après 30 min, si la souris est silencieuse, commencer à enregistrer les signaux respiratoires et la saturation périphérique de l'oxygène (SpO2) à la phase normoxia (21% FiO2 à 1 atm de pression) pendant 20 min, en utilisant LabChart 7 Pro (version 7.2).
    8. Hypoxie: après 20 min de normoxie tranquille, commencer à enregistrer le premier cycle de l'hypoxie aigue et SpO2. Pour la phase d'hypoxie, exposez les animaux à un flux constant de gaz mixte composé de 10 % O2 et de 3 % de CO2 pendant 5 min.
      1. Au cours des 30 premières secondes d'hypoxie, le gaz mixte traverse la chambre via 2 petits ports latéraux à la base permettant au FiO2 de passer de 21% (à 1 atm de pression) à 10%.
      2. Après les 30 s initiaux, fermez l'un des petits ports latéraux de la chambre WBP et continuez à enregistrer à l'hypoxie constante à 10% FiO2 pendant 5 min.
        REMARQUE: Le mélange de 10% O2 et 3% CO2 à l'hypoxie est utilisé afin de maintenir l'eucapnée11.
    9. Après les 5 min d'hypoxie, exposez la souris à l'air de la pièce à nouveau (21% FiO2 à 1 atm de pression) en changeant la source d'entrée.
    10. Attendre au moins 30 min jusqu'à ce que le prochain enregistrement normoxia afin de récupérer de l'exposition hypoxique précédente pour éviter le phénomène de repérage ventilatoire (c.-à-d., suppression centrale de la respiration pendant l'hypoxie16).
      REMARQUE: Répétez les cycles normoxia/hypoxie trois fois dans chaque souris pour assurer la reproductibilité des mesures. D'après notre expérience, les expositions hypoxiques supplémentaires (plus de 3 fois par jour) devraient être évitées, en raison de l'adaptation ventilatoire (phénomène de roll-off).
    11. À la fin de l'expérience, calibrer la chambre WBP (avec la souris est toujours à l'intérieur) en injectant 1 ml d'air de pièce 3 fois avec une seringue branchée dans l'un des petits ports latéraux à la base de la chambre.
    12. Mesurer à nouveau la température dans la chambre avec l'animal à l'intérieur.
    13. Ouvrez la chambre et mesurez la température rectale de la souris avant de la remettre dans sa cage d'origine.
  2. Calcul HVR
    1. Numériser tous les signaux pour le calcul HVR à 1 000 Hz (fréquence d'échantillonnage par canal).
      REMARQUE: L'analyse du volume des marées du WBP est effectuée dans le tableau de laboratoire 7 basé sur l'équation17de Drorbaugh et Fenn. Les variables requises comprennent la température rectale de la souris et la température de la chambre (avant et après la mesure hVR), l'humidité relative et la constante du gaz de chambre. Cette constante résulte de la déviation de la pression WBP après les injections d'air de 1 ml dans la phase d'étalonnage. Pour plus de détails, voir Hernandez et ses collègues15.
    2. Après avoir calculé l'équation de Drorbaugh et Fenn, multipliez le canal de la chambre de volume de marée (Vt) par la constante.
    3. Sélection d'enregistrements pour l'analyse
      1. Normoxie : sélectionnez uniquement les sections de respiration constante avec un volume de marée constant. Évitez les sections à proximité des mouvements de la souris.
      2. Hypoxie : jetez les 30 premiers s lorsque les niveaux o2 diminuent de 21 % à 10 %, choisissez des sections de 30 s à 2 min d'exposition à 10 % O2 (un intervalle de 90 s). Dans cet intervalle, sélectionnez uniquement les sections à respiration constante avec un volume de marée constant. Évitez les sections à proximité des mouvements de la souris. L'analyse est fiable si au moins 10 s d'hypoxie sont sélectionnés dans chaque cycle.
        REMARQUE: La composante périphérique de chemoreflex régi par CB prédomine au cours de la première 1-2 min d'exposition16,18,19. Au cours de la deuxième phase, entre 2 min et 5 min d'exposition hypoxique, le composant périphérique et central joue un rôle. Enfin, la troisième phase, la 5 min, se caractérise par une hypoventilation (le phénomène de roll-off) régie principalement par des chimiorécepteurs centraux. Notre expérience montre que les souris sont souvent éveillées pendant l'exposition hypoxique en raison des commutateurs manuels dans la source de flux d'air.
    4. Après la sélection, calculer la ventilation minute moyenne (VE) à des conditions normoxiques et hypoxiques en utilisant la formule VE - taux respiratoire X volume de marée.
    5. Calculer la moyenne SpO2 à des conditions de normoxie et d'hypoxie.
    6. Calculez le HVR manuellement à l'aide de la formule HVR (VE (10 % O2) - VE (21 %O2)) / (SpO2 (10 % O2) - SpO2 (21 % O2)).
      REMARQUE: Chez les souris C57BL/6J, la pompe osmotique pour l'infusion de leptine peut altérer la détection précise du signal SpO2 par le col du cou. Dans ce cas, HVR est calculé sur la base des valeurs FiO2 à des conditions normotiques et hypoxiques comme HVR 'V E / 'FiO211.

3. Dénervation du corps carotide ou dissection du nerf du sinus carotide (CSND)

REMARQUE: Nous avons exécuté la dénervation chirurgicale et chimique combinée une semaine d'intervalle, parce que la dénervation chirurgicale seule n'abolit pas le chemoreflex hypoxique.

  1. Préparation chirurgicale
    1. Effectuer toutes les procédures sur les souris mâles adultes C57BL/6J. Stérilisez tous les instruments chirurgicaux. Utilisez des gants chirurgicaux stériles, des seringues et des applicateurs à pointe de coton.
    2. Anesthésiez les souris mâles C57BL/6J avec 1-2% d'isoflurane à l'aide d'un cône nasal et placez une couverture chaude pour prévenir l'hypothermie. L'isoflurane est soigneusement titré pour maintenir la fréquence respiratoire à 1 Hz (60 respirations/min). L'adéquation de l'anesthésie avant le début des chirurgies sera évaluée par la fréquence respiratoire, l'absence de mouvements et de bruits sonores, l'absence de réponse aux stimuli tactiles et le réflexe de sevrage de l'avant-membre ou de la pédale postérieure.
    3. Administrer la buprénorphine (0,05 mg/kg) par voie intrapéritone pour prévenir l'inconfort de la douleur. Enlever les poils à la région ventrale du cou et désinfecter la zone avec de la bétadine et de l'alcool.
    4. Pour prévenir la dessiccation cornéenne, lubrifier les yeux des souris avec un onestorat ophtalmique stérile pendant l'anesthésie.
  2. Procédures cSND
    Étape 1 : Dénervation chirurgicale
    1. Après l'incision de midline, exposez la bifurcation des artères carotides communes en enlevant des tissus conjonctifs et du tissu adipeux.
    2. Identifiez le nerf hypoglossal, qui est habituellement très proéminent, et puis soulevez-le vers le haut pour exposer le nerf glossaryngeal immédiatement dessous. Disséquer les nerfs carotides de sinus bilatéralement utilisant des ciseaux de ressort micro.
    3. Fermer l'incision avec 6-0 suture de soie.
    4. Administrer 1 ml de saline normale sous-cutanée pour prévenir la déshydratation.
    5. Loger les souris dans une chambre de récupération et surveiller leur comportement toutes les 15 min pendant 1 h initial jusqu'à ce que les souris reprennent conscience pour maintenir la charge sternale. Renvoyez les souris dans leurs cages d'origine après leur récupération complète. Continuez à surveiller les souris deux fois par jour pendant les 3 prochains jours. Donnez de la buprénorphine supplémentaire si les souris présentent des signes de douleur (p. ex., diminution de l'appétit, agitation).
      Étape 2 : Dénervation chimique
    6. Une semaine après la chirurgie, peindre l'artère carotide avec une solution de 2% de phénol dilué dans l'éthanol au point de ramification du nerf glossopharyngé au pôle crânien du CB. Les mêmes soins postopératoires devraient être fournis après la dénervation chimique comme décrit ci-dessus dans la section chirurgicale de dénervation.
      REMARQUE : Pour un groupe de chirurgie de faux, les mêmes procédures sont exécutées excepté la dissection carotide de nerf de sinus.
    7. Laissez les animaux récupérer pendant 5-7 jours avant les mesures HVR.

4. Expression de LepRb dans le CB à l'aide d'un vecteur adénoviral (Ad-LepRb) vs control (Ad-LacZ)

  1. Suspension Ad-LepRb et Ad-LacZ
    1. Transfect les souris avec adénovirus (Ad-LepRb-GFP, 2-5x1010 pfu/mL pour la surexpression, Ad-Lacz, 1 x 1010 pfu/mL pour le contrôle) à la zone CB.
    2. Décongeler la matrice de Matrigel en submergeant le flacon dans de la glace dans un réfrigérateur de 4 oC pendant la nuit.
    3. Suspendre délicatement l'adénovirus dans la matrice liquide de Matrigel à 1:5 (1 l de matrice matrigel et 4 l d'adénovirus appliqué bilatéralement).
    4. Gardez toujours la suspension virale sur la glace jusqu'à ce qu'elle soit appliquée dans le CB.
  2. Préparation chirurgicale
    1. Utilisez les mêmes instruments chirurgicaux que le protocole CSND.
    2. Anesthésiez les souris LepRb-déficientes db/db avec 2-2.5% isoflurane utilisant un cône de nez et placez les animaux sur une couverture chaude pour empêcher l'hypothermie. L'isoflurane est soigneusement titré pour maintenir la fréquence respiratoire à 1 Hz (60 respirations/min). L'adéquation de l'anesthésie sera évaluée par la fréquence respiratoire, l'absence de mouvements et de bruits sonores, l'absence de réponse aux stimuli tactiles et le réflexe de retrait de la pédale de l'avant ou de l'arrière-pays.
    3. Administrer la buprénorphine (0,05 mg/kg) par voie intrapéritone.
    4. Enlever les poils à la région ventrale du cou et désinfecter la zone avec de la bétadine et de l'alcool comme dans le protocole CSND.
    5. Pour prévenir la dessiccation cornéenne, lubrifier les yeux des souris avec un onestorat ophtalmique stérile pendant l'anesthésie.
  3. Traitement de l'adénovirus du CB
    1. Exposer les CB tels que décrits dans le protocole cSND et appliquer 5 ll de la suspension virale à la zone CB bilatéralement.
    2. Attendez 2-3 min jusqu'à ce que la matrice liquide Matrigel devienne un gel. Après avoir confirmé que la suspension virale a été congealed, fermez l'incision avec la suture de soie 6.0.
  4. Après la chirurgie
    1. Loger les souris dans une chambre de récupération et surveiller leur comportement toutes les 15 min pendant 1 h initial jusqu'à ce que les souris reprennent conscience pour maintenir la charge sternale. Renvoyez les souris dans leurs cages d'origine après leur récupération complète. Continuez à surveiller les souris deux fois par jour pendant les 3 prochains jours. Donnez de la buprénorphine supplémentaire si les souris présentent des signes de douleur (p. ex., diminution de l'appétit, agitation).
    2. Administrer la buprénorphine (0,05 mg/kg) par voie intrapéritone au besoin pour prévenir l'inconfort de la douleur pendant la période postopératoire.
    3. Mesurez le HVR 9 jours après la transfection de l'adénovirus.

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Résultats

L'infusion continue de leptine a considérablement augmenté le HVR chez les souris maigres C57BL/6J de 0,23 à 0,31 ml/min/g/FiO2 (P lt; 0,001, figure 2)11. CSND a aboli l'augmentation induite par la leptine dans HVR (figure 2), tandis qu'aucun effet atténuant de CSND sur HVR n'a été observé dans le groupe de chirurgie de faux après perfusion de leptine.

L'expression de LepRb dans le CB des ...

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Discussion

L'objectif principal de notre étude était d'examiner les effets respiratoires de la signalisation de leptine dans le CB. Plusieurs protocoles ont été élaborés pour évaluer le rôle de la leptine d'une manière mécaniste. Tout d'abord, la contribution spécifique de CB au HVR a été analysée par la quantification soigneuse du HVR pendant les 2 premières min d'exposition hypoxique. Deuxièmement, la pertinence de cb dans la régulation de la leptine du contrôle de la respiration a été examinée par deux approches complémentaires....

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont pas d'intérêts ou de divulgations contradictoires.

Remerciements

R01HL138932, RO1HL133100, RO1HL128970, AHACDA34700025

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1 mL Seringues à insulineBD Biosciences309311
1x PBS (pH 7,4)Gibco10010-023500 ml
Ad-LaczDr. Christopher Rhodes (Université de Chicago)1 x 1010 pfu/mL
Ad-LepRb-GFPVectorBiolabsADV-2633802-5 x 1010 pfu/mL
Chariot d’anesthésieAtlantic Biomedical
BetadinePurdue Products Ltd.12496-0757-5
Buprénorphine (Buprenex)Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.12496-0757-50,3 mg/mL
C57Bl/6JJackson laboratory000664Mice Strain
Cotton Gauze SpongesFisherbrand22-362-178
db/dbJackson laboratory000697Mice Strain
EthanolPharmco-AAPER111000200
IsofluraneVetone502017
Lab ChartData Science International (DSI)Logiciel
Matrigel MatrixBD Biosciences356234
Micro Spring ScissorsWorld Precision Instruments (WPI)14124
Mouse Ox PlusSTARR Life Sciences Corp.Logiciel
souris Ox Plus Collier CapteurSTARR Life Sciences Corp.015022-2Clip de collier moyen spécial 7"
Chambre de pléthysmographie du corps entier de la sourisData Science International (DSI)PLY3211
Ohio Care Plus IncubateurOhmedaHCHD000173
Ciseaux d’opérationWorld Precision Instruments (WPI)501753-G
Pompe osmotiqueAlzet1003D1 &mu ; L/h, 3 jours
PhenolSigma-AldrichP4557
Protéine de leptine de souris recombinanteR& D systems498-OB-05M5 mg
SalineRICCA Chemical7210-160,9 % Chlorure de sodium
Suture chirurgicale stérileDemeTechDT-639-1Soie, taille 6-0
ThermomètreInnovative Calibration Solutions (INNOCAL)EW 20250-91
droite

Références

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