Ici, nous présentons une méthode polyvalente pour la transformation des racines de tomate suivie de l’inoculation avec Ralstonia solanacearum pour effectuer l’analyse génétique simple pour l’étude de la maladie bactérienne de flétrir.
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Article de méthode
Transformation des racines de tomate suivie de l’inoculation avec Ralstonia Solanacearum pour l’analyse génétique directe de la maladie bactérienne de wilt
Dans cet article
Résumé
Résumé
Ralstonia solanacearum est un agent pathogène vasculaire dévastateur transmis par le sol qui peut infecter un large éventail d’espèces végétales, ce qui constitue une menace importante pour l’agriculture. Cependant, le modèle Ralstonia est considérablement sous-exploré par rapport à d’autres modèles impliquant des pathogènes végétaux bactériens, tels que les seringues Pseudomonas dans Arabidopsis. La recherche visant à comprendre l’interaction entre Ralstonia et les plantes cultivées est essentielle pour développer des solutions durables pour lutter contre la flétrie bactérienne, mais elle est actuellement entravée par l’absence d’essais expérimentaux simples pour caractériser les différentes composantes de l’interaction dans les plantes hôtes indigènes. Dans ce scénario, nous avons développé une méthode pour effectuer l’analyse génétique de l’infection Ralstonia de la tomate, un hôte naturel de Ralstonia. Cette méthode est basée sur Agrobacterium rhizogenes- transformation médiatisée des racines de tomate, suivie par l’inoculation du sol Ralstonia des plantes résultantes, contenant des racines transformées exprimant la construction de l’intérêt. La polyvalence de l’essai de transformation des racines permet d’effectuer soit la surexpression génétique ou le silençage génétique médié par les ARNi. Comme preuve de concept, nous avons utilisé cette méthode pour montrer que le silence par médiation RNAi de SlCESA6 dans les racines de tomate confère une résistance à Ralstonia. Ici, nous décrivons cette méthode en détail, permettant aux approches génétiques de comprendre la maladie bactérienne de flétrissement dans un temps relativement court et avec de petites exigences de l’équipement et de l’espace de croissance des plantes.
Introduction
Ralstonia solanacearum, l’agent causal de la maladie bactérienne de flétrissement, est un agent pathogène vasculaire dévastateur transmis par le sol avec une distribution mondiale qui peut infecter une grande gamme d’espèces végétales, y compris la pomme de terre, la tomate, le tabac, la banane, le poivre et l’aubergine, entre autres1,2. Les pertes de rendement causées par Ralstonia peuvent atteindre 80-90% de la production de tomates, de pommes de terre ou de bananes, selon le cultivar, le climat, le sol et d’autres facteurs3. Cependant, le modèle Ralstonia est considérablement sous-exploré par rapport à d’autres modèles impliquant des pathogènes végétaux bactériens, tels que pseudomonas syringae ou Xanthomonas spp. En outre, la plupart des études sur les interactions plantes-microbe sont axées sur la plante modèle Arabidopsis thaliana. Bien que la recherche utilisant ces modèles ait largement contribué à notre compréhension des interactions plante-bactérie, elles ne répondent pas à la nécessité actuelle de comprendre ces interactions dans les plantes cultivées. La recherche visant à comprendre l’interaction entre Ralstonia et les plantes cultivées est essentielle pour développer des solutions durables pour lutter contre la flétrie bactérienne, mais elle est actuellement entravée par l’absence d’essais expérimentaux simples pour caractériser les différentes composantes de l’interaction. En particulier, la tomate, un hôte naturel pour Ralstonia, est la deuxième culture végétale la plus importante dans le monde et est affectée par une pléthore de maladies4, y compris la maladie bactérienne de flétrissement. Dans ce travail, nous avons développé une méthode facile pour effectuer l’analyse génétique de l’infection de Ralstonia de la tomate. Cette méthode est basée sur Agrobacterium rhizogenes-transformation négociée des racines de tomate, en utilisant la fluorescence DsRed comme marqueur de sélection5, suivie par l’inoculation du sol Ralstonia des plantes résultantes, contenant des racines transformées exprimant la construction de l’intérêt. La polyvalence de l’essai de transformation des racines permet d’effectuer soit la surexpression génétique ou le silençage génétique médié par les ARNi.
Une limitation potentielle de cette méthode consiste en la croissance résiduelle des racines non transformées. Ceci est particulièrement important dans les cas où le plasmide utilisé n’a pas de gène reporter qui permet la sélection des racines transformées. Pour résoudre ce problème, nous avons développé une méthode alternative basée sur la sélection des antibiotiques, qui inhibe la croissance de racines non transformées tout en permettant la croissance de racines transformées résistantes aux antibiotiques saines. Étant donné que A. rhizogenes n’induit pas la transformation des pousses, ils sont sensibles à l’antibiotique, et, par conséquent, ils doivent être tenus séparés du milieu antibiotique contenant.
Bien que la résistance des plantes contre Ralstonia ne soit pas bien comprise, plusieurs rapports ont associé des altérations de la paroi cellulaire à une résistance accrue au flétrissement bactérien6,7,8,9. Il a été suggéré que ces altérations de mur cellulaire affectent le développement vasculaire, un aspect essentiel pour le mode de vie de Ralstonia à l’intérieur de la plante10. Les mutations dans les gènes codant les synthases de cellulose CESA4, CESA7 et CESA8 dans Arabidopsis thaliana ont été montrés pour altérer l’intégrité secondaire de mur de cellules, causant une résistance accrue à Ralstonia, qui semble être liée à la signalisation ABA8. Par conséquent, comme une preuve de concept pour notre méthode, nous avons effectué le silençage génétique RNAi-négocié de SlCESA6 (Solyc02g072240), une synthase de cellulose cellule-mur secondaire secondaire, et orthologue de AtCESA8 (At4g18780). L’inoculation subséquente de sol-drenching avec Ralstonia a prouvé que le silence SlCESA6 a augmenté la résistance aux symptômes bactériens de flétrissement, suggérant que la résistance mur-négociée de cellules à Ralstonia est probablement conservée dans la tomate, et validant notre méthode pour effectuer l’analyse génétique de la résistance bactérienne de flétrie dans les racines de tomate. Ici, nous décrivons cette méthode en détail, permettant aux approches génétiques de comprendre la maladie bactérienne de flétrissement dans un temps relativement court et avec de petites exigences de l’équipement et de l’espace de croissance des plantes.
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Protocole
REMARQUE : Des parties importantes de cette méthode impliquent la manipulation des matériaux végétaux in vitro, et il est donc important de maintenir des conditions stériles pendant toutes ces procédures, y compris la visualisation de la fluorescence DsRed. Pendant tout le processus de transformation, les semis de tomates poussent à 25 à 28 oC et à 16 h/8 h léger/foncé (130 photons demol m-2s-1 lumière). Les plaques sont scellées avec du ruban adhésif micropore afin de faciliter l’échange de gaz et la transpiration.
1. Préparation des plants de tomates et des rhizogenes Agrobacterium
- Stériliser les graines de tomates (Solanum lycopersicum cv. Moneymaker, LA2706, Tomato Genetics Resource Center, TGRC) avec 5% (v/v) hypochlorite de sodium pendant 5 min. Laver 4-5 fois avec de l’eau stérile distillée et garder les graines trembler lentement dans l’eau stérile pendant la nuit pour faciliter la germination.
- Transférer les graines de tomate à murashige et Skoog (1/2 MS) moyen sans saccharose (2,21 g/L MS, 8% w/v agar). Maintenir les graines dans l’obscurité à 25 à 28 oC pendant trois jours(figure 1A).
REMARQUE : Environ 40 graines sont habituellement nécessaires pour chaque construction. - Autoclave 8,5 cm2 papiers filtres carrés. Placez les papiers filtres carrés à l’intérieur des boîtes de Petride 9 cm 2 cm 2 carrés contenant un milieu de 1/2 MS (placez le papier sur le dessus de l’agar) et placez six graines de tomates germées dans chaque assiette(figure 1B). Sceller la plaque avec du ruban adhésif micropore et incuber les graines germées à 25 à 28 oC pendant 3 à 4 jours.
- Cultivez Agrobacterium rhizogenes MSU440 en milieu LB solide (avec antibiotiques appropriés) à 28 oC deux jours avant la transformation des plantes.
REMARQUE : A. rhizogenes est fourni par le Dr Juan Antonio Lepez Ràez, EEZ-CSIC, Grenade, Espagne. Dans l’expérience décrite dans cet article, A. rhizogenes contenant pK7GWIWG2_II-RedRoot : ::CESA6 ou un vecteur vide, comme contrôle, ont été utilisés. pK7GWIWG2_II-RedRoot contient un gène reporter, DsRed, entraîné par le promoteur Arabidopsis thaliana ubiquitin (pAtUBQ10), et confère une résistance à la spectinomycine (50 g/mL). Il est possible d’utiliser d’autres vecteurs pour la surexpression génétique, tel que rapporté avant5. Dans ce travail, l’amplification du fragment spécifique pour le silence SlCESA6 a été obtenue par transcription inverse (RT) PCR à l’aide d’ARN isolé de la tomate (S. lycopersicum cv. Moneymaker) et ligated en p-ENTR/D-TOPO vector (tableau 1). Par la suite, le fragment SlCESA6-RNAi a été cloné dans le vecteur binaire pK7GWIWG2_II-RedRoot.
2. Transformation et sélection des plantes
- À l’aide d’un scalpel stérile, couper le radicle et le fond de l’hypocotyl des semis de tomates(figure 1C,D).
- RécolteZ la biomasse de rhizogenes de la surface du milieu LB à l’aide de pointes en plastique ou d’une lame de scalpel et trempez soigneusement les semis coupés de tomates dans la biomasse bactérienne(figure 1E).
- Après l’inoculation avec A. rhizogenes, couvrir les semis de tomates avec un papier filtre semi-circulaire de 2 cm x 4 cm(figure 1F), afin de maintenir une humidité élevée et de faciliter la survie et le développement de nouvelles racines.
- Conserver les semis transformés de tomates pendant 6-7 jours. Ensuite, utilisez un scalpel stérile pour couper les nouvelles racines poilues émergentes(figure 1G,H; à cette étape, les racines ne sont pas encore transformées) et permettre aux semis de produire de nouvelles racines poilues.
- Une fois que la deuxième génération de nouvelles racines poilues apparaissent (figure 1I), retirez le papier filtre sur les semis, et scellez la plaque avec du ruban adhésif micropore à nouveau.
REMARQUE : À ce stade, la présence du marqueur fluorescent DsRed dans le vecteur de transformation permet de visualiser l’efficacité de transformation dans les nouvelles racines. - Pour visualiser la fluorescence DsRed, utilisez un stéréomicroscope ou tout autre équipement pour l’imagerie in vivo végétale(figure 1J). Marquez les racines positives (fluorescence rouge) transformées et enlevez les racines négatives non transformées (pas de fluorescence rouge) à l’aide d’un scalpel stérile.
- Transférer les semis montrant la fluorescence rouge dans une nouvelle plaque contenant un milieu de la SP 1/2, afin de faciliter le développement de la racine transformée comme racine principale(figure 1K). Conservez les semis qui ne montrent pas de fluorescence rouge dans la même plaque pour vérifier l’émergence de racines fluorescentes(figure 1L) dans les points de temps ultérieurs.
- Méthode alternative basée sur la sélection des antibiotiques
- Alternative à l’étape 2.5, préparer des plaques carrées demi-remplies de 9 cm2 contenant un milieu de 1/2 MS avec l’antibiotique approprié. Incliner les plaques à environ 5 degrés pendant le processus de préparation pour générer un espace vide sans milieu(figure 2A), permettant aux pousses de croître en évitant tout contact avec l’antibiotique.
- Alternative à l’étape 2.6, après avoir coupé les premières racines poilues non transformées émergé (étape 2.4), transférer les semis sans racines sur les plaques à moitié remplies à l’aide de papiers filtres avec la taille appropriée (figure 2B).
REMARQUE : En tant que contrôle positif, il est recommandé de transformer plusieurs semis avec un plasmide contenant la même résistance aux antibiotiques et un gène reporter (dans ce protocole, pK7GWIWG2_II-RedRoot; kanamycine 50 g/mL). - Alternative à l’étape 2.7, laissez les semis développer de nouvelles racines poilues et couper les racines qui ne sont pas en contact direct avec la surface des papiers de sandwich filtre, puisque ces racines peuvent éviter la sélection d’antibiotiques.
REMARQUE : En raison de l’effet antibiotique, le développement des racines peut être plus lent que dans les plaques sans antibiotiques. De nouvelles racines poilues transformées apparaissent dans les 14 à 18 jours suivant le transfert des semis sans racines dans les assiettes à moitié remplies (étape 2.8.2) (figure 2C-E).
- Couvrir les semis d’un papier filtre semi-cercle de 2 cm x 4 cm, sceller la plaque et incuber les semis pour les laisser développer de nouvelles racines poilues.
REMARQUE : Il n’est pas nécessaire d’éliminer les rhizogenes A. à l’aide d’antibiotiques. Le papier filtre sur le dessus du milieu de la SP et le manque de saccharose inhibent la propagation des rhizogenes A. sur la plaque5. - Cinq à sept jours après la première sélection des racines, répétez le processus de sélection pour sélectionner de nouvelles racines transformées et enlever les racines non transformées. Transférer les semis contenant des racines transformées en une nouvelle plaque contenant un milieu de 1/2 MS.
3. Transfert aux pots d’inoculation
- Préparer des pots d’inoculation où la surface des racines sera exposée à l’inoculum bactérien : tremper les pots d’inoculation avec de l’eau, verser tout excès d’eau et les placer dans un plateau de plantation en plastique. Transférer les semis sélectionnés avec des racines transformées en pots d’inoculation à l’aide de pincettes (figure 3A).
- Couvrir le plateau d’une pellicule plastique ou d’un couvercle transparent et de les conserver à 25 à 28 oC et à 65 % d’humidité (16 h/8 h de lumière/obscurité; 130 photons demol m-2s-1 lumière), pour maintenir un niveau élevé d’humidité Figure 3B). Retirer le couvercle après cinq ou six jours.
REMARQUE : Les plants de tomates transformés sont prêts pour l’inoculation deux à trois semaines après leur transfert dans le sol(figure 3C). Pendant la croissance sur le sol, les plants de tomates peuvent produire de nouvelles racines qui ne sont pas transformées. Pour déterminer l’étendue de ce phénomène, la fluorescence rouge a été visualisée dans les racines des plants transformés de tomate de 3 semaines. La plupart des racines (80%-100%) a montré la fluorescence rouge, indiquant qu’ils sont effectivement transformés (figure 3D,E).
4. Inoculation d’arrosage des sols
- Cultivez R. solancearum (souche GMI1000 dans ce protocole) en milieu liquide phi(tableau 211) dans un shaker orbital (200 tr/min) à 28 oC jusqu’à la phase stationnaire.
- Déterminer les nombres bactériens en mesurant la densité optique de la culture bactérienne à 600 nm (OD600). Diluer la culture bactérienne avec de l’eau à un OD600 de 0,1 (dans des conditions utilisées ici, cela correspond à environ10 8 unités de formation de colonies [CFU]/mL).
- Placer les pots d’inoculation 16-20 contenant des plants de tomates transformés dans un plateau d’inoculation (29 cm x 20 cm; Figure 4A).
- Verser 300 ml (15 ml par plante) d’inoculum bactérien(OD 600 de 0,1) dans le plateau contenant les pots d’inoculation. Laissez-les tremper dans l’inoculum pendant 20 min (figure 4B).
- Préparer un nouveau plateau avec une couche de terreau. Déplacez les pots inoculés dans le nouveau plateau(figure 4C) et placez les plateaux dans une chambre de croissance avec 75% d’humidité, 26 à 28 oC, et un photoperiod de 12 h de lumière et 12 h d’obscurité (130 photons demol m-2s-1 lumière).
5. Détermination des paramètres d’infection et analyse statistique
- 12 ,13,13en utilisant une échelle allant de 0 (pas de symptômes) à 4 (flétrissement complet)(figure 4D-H), chaque jour après l’inoculation de Ralstonia pendant deux semaines.
REMARQUE : Les données de l’indice de la maladie sont recueillies à partir de la même unité expérimentale (chaque plante) au fil du temps.
6. Analyse de l’expression génique
REMARQUE : L’expression du transgène ou le silence du gène cible peut être déterminée par RT-PCR ou par RT-PCR quantitatif (qRT-PCR).
- Recueillir des échantillons et extraire l’ARN d’une partie représentative du système racinaire transformé (pour évaluer l’effet sur le gène cible) et les feuilles (comme contrôle interne).
- Synthèse cDNA à l’aide de 1 g d’ARN traité par DNase.
- Analyser l’expression génique des gènes cibles par qRT-PCR. Calculez les niveaux de transcription relatifs à l’aide de la méthode 2-CT 14, en utilisant SlEF-1 comme gène d’entretienménager 15.
REMARQUE : Les séquences d’introduction sont répertoriées dans le tableau 1.
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Résultats
La figure 5 montre le développement des symptômes de la maladie des plants de tomates avec des racines transformées avec un vecteur vide (EV), et les plantes avec des racines transformées avec une construction d’ARNi ciblant SlCESA6 (Solyc02g072240). Les données de l’indice de la maladie(figure 5A) sont recueillies à partir de la même unité expérimentale (chaque plante) au fil du temps selon une...
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Discussion
Ralstonia solanacearum représente une menace importante pour l’agriculture; cependant, son interaction avec les hôtes naturels d’importance agricole est encore mal comprise par rapport à d’autres agents pathogènes bactériens, en particulier chez les espèces végétales. Dans la plupart des cas, l’analyse génétique est entravée par le temps et les dépenses nécessaires pour modifier génétiquement les plantes hôtes. Pour résoudre ce problème et faciliter l’analyse génétique de l’infection à R. solanacearum d...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous remercions tous les membres du laboratoire Macho pour des discussions utiles, Alvaro Lopez-Garcia pour des conseils statistiques, et Xinyu Jian pour l’assistance technique et administrative pendant ce travail. Nous remercions l’installation de base de biologie cellulaire de la CFP pour son aide à l’imagerie par fluorescence Ce travail a été soutenu par le Programme de recherche prioritaire stratégique de l’Académie chinoise des sciences (subvention XDB27040204), le Shanghai Center for Plant Stress Biology (Chinois) Académie des sciences) et le programme chinois 1000 Talents.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Boîtes de Pétri | |||
| Poudre | d’agar Sigma-Aldrich | ||
| Bacto peptone | BD (Becton et Dickinson) | ||
| Acides aminés | Sigma-Aldrich | ||
| Papier | |||
| Système d’imagerie végétale In Vivo NightShade LB 985 | Berthold Technologies | ||
| Pots Jiffy | Jiffy Products International A.S. | ||
| Ruban microporeux | 3M | ||
| Murashige et Skoog medium (M519) | Phytotechlab | ||
| Substrat Pindstrup | Mosebrug A/S | ||
| Scalpel et lame | |||
| Hypochlorite de sodium | Sigma-Aldrich | ||
| Banc | |||
| Pince à épiler | |||
| Wahtman paper | Wahtman International Ltd. Extrait de levure Maldstone | ||
| OXOID |
Références
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Réimpressions et autorisations
