Article de méthode
Le but de cette méthode est d'obtenir des matrices 3D dérivées du fibroblaste comme échafaudage naturel pour les essais cellulaires ultérieurs. Les fibroblastes sont enseventdanss dans une plaque de culture prétraitée et stimulés avec de l'acide ascorbique pour la génération de matrices. Les matrices sont décellularisées et bloquées aux cellules pertinentes à la culture (p. ex., les cellules endothéliales).
La matrice extracellulaire (ECM) est un échafaudage tridimensionnel qui agit comme principal support pour les cellules dans les tissus. Outre sa fonction structurelle, l'ECM participe également à la migration cellulaire, à la prolifération et à la différenciation. Les fibroblastes sont le principal type de cellules modifiant l'arrangement et la production de fibres ECM. Dans le cancer, les CAF (fibroblastes associés au cancer) sont dans le statut permanent d'activation, participant au remodelage d'ECM, facilitant la migration de cellules de tumeur, et stimulant l'angiogenèse tumeur-associée, entre autres rôles pro-tumorigenic. L'objectif de cette méthode est de créer une matrice tridimensionnelle avec une composition de fibres qui est similaire aux matrices in vivo, en utilisant des fibroblastes immortalisés ou des CAF primaires humaines. Les fibroblastes sont cultivés dans des plaques de culture cellulaire prétraitées et cultivés sous stimulation acide ascorbique. Ensuite, les fibroblastes sont enlevés et les matrices sont bloquées pour l'ensemencement des cellules. Dans ce modèle ECM, les fibroblastes peuvent être activés ou modifiés pour générer différents types de matrice, dont les effets peuvent être étudiés dans la culture cellulaire. Les matrices 3D sont également façonnées par des signaux cellulaires, comme la dégradation ou les enzymes de liaison croisée qui pourraient modifier la distribution des fibres. Dans ce contexte, l'angiogenèse peut être étudiée, avec d'autres types de cellules telles que les cellules épithéliales.
La matrice extracellulaire (ECM) est une structure dynamique présente dans tous les types de tissus. Il se compose de protéines et de polysaccharides qui créent un filet de fibres cruciales pour l'adhérence cellulaire, la migration et la communication1. La composition de l'ECM varie selon le tissu. Tandis que le collagène de type I est la protéine structurale la plus répandue, les types de collagène II, III, V et XI peuvent également être trouvés dans divers tissus2. La fibronectine générée par les fibroblastes est nécessaire pour l'adhérence cellulaire2. En outre, il existe d'autres molécules str....
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Des échantillons de tissus humains ont été obtenus avec l'approbation du Comité d'éthique de la recherche de l'hôpital Ramon y Cajal, Madrid.
1. Préparation de solutions
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Les fibroblastes stimulés PAR LE PDGF-BB créent un ECM plus épais. Herrera et coll. ont montré comment les fibroblastes stimulés par le PDGF ont généré une matrice plus épaisse ainsi qu'une orientation plus élevée en fibres7. Les fibroblastes BJ-hTERT ont été incubés avec ou sans PDGF et les zones représentatives observées ont montré une distribution cellulaire plus alignée dans des matrices produites par le fibroblaste stimulé par le PDGF(figu.......
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Les matrices peuvent être générées avec des fibroblastes immortalisés ou des cultures primaires de fibroblastes. Les fibroblastes sont faciles à maintenir dans la culture in vitro avec un taux de croissance élevé et une résistance au stress. Ils peuvent même être isolés du tissu post-mortem3, bien que la contamination pourrait être une restriction, selon l'origine du tissu.
Le modèle de matrice 3D offre ici un système nouveau et efficace pour étudier avec succès la comp.......
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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.
L'élaboration de ce protocole a été soutenue par PI12/02037, PI15/02101, PI17/01847, PI18/01034 et RD12/0036/0041 de l'Instituto de Salud Carlos III; par le Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER); par "CIBER de Câncer", CB16/12/00273 et CB16/12/00446, de l'Instituto de Salud Carlos III-FEDER; et par la Fondation Cient-fica AECC (une approche multiforme pour cibler le cancer du pancréas). Cristina Pesa est récipiendaire d'un contrat Miguel Servet de l'Instituto de Salud Carlos III. M. Eaude a aidé avec le texte anglais. Nous remercions les membres du laboratoire pour leur aide et leurs conseils tout au long de cette recherche.
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Hydroxyde d’ammonium (NH4OH) | Roth | A990.1 | |
| Amphotéricine-B | Corning | 30-003-CF | |
| Albumine sérique bovine (BSA) | Sigma | A7906-50G | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-014-CVR | |
| Milieu endothélial basal (EBM) | Lonza | CC-3121 | ajouter des suppléments avant utilisation |
| Cellules endothéliales Medium Basal Supplements (EGM-2) | Lonza | CC-4176 | |
| Ethanolamine | Sigma | 411000-100ML | |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Biowest | S181B-500 | inactivé par la chaleur avant utilisation |
| Fibroblast Growth Basal Medium (FBM) | Lonza | CC-3131 | ajouter des suppléments avant utilisation |
| Milieu de croissance des fibroblastes Suppléments et facteurs de croissance (FGM-2) | Lonza | CC-4126 | |
| Gélatine de peau bovine | Sigma | G9391-100G | |
| Glutaraldéhyde | Sigma | g5882 | |
| Acide L-ascorbique | Sigma | A92902-100G | sensible à la lumière |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| Normocin | Invivogen | 3ANT-NR-2 | |
| Crayonline/Streptomycine (Pen/Strep) | Gibco | 15140122 | |
| Saline tamponnée au phosphate (PBS) | Corning | 21-040-CVR | |
| Triton X100 | Roth | 3051 | |
| Télomérase recombinante transfectée fibroblastes de prépuce humain immortalisés (BJ-hTERT) | ATCC | ATCC CRL-4001 | |
| Veine ombilicale humaine cellules endothéliales (HUVEC) | ATCC | PCS-100-013 |
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