Article de méthode

Fibroblast-Dérivé 3D Matrix System Applicable à Endothelial Tube Formation D'Assay

7.2K vues

⸱

DOI :

10.3791/60304

⸱

26 décembre 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Medical Oncology Department, Instituto Ramón y Cajal de Investigación Sanitaria (IRYCIS), CIBERONC, 2Department of Medical Oncology, Hospital Universitario Puerta de Hierro de Majadahonda, 3Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols, Consejo Superior de Investigaciones Científicas - Universidad Autónoma de Madrid, CIBERONC, 4Department of Oncology & Pathology, Karolinska Institutet

Dans cet article

Résumé

Le but de cette méthode est d'obtenir des matrices 3D dérivées du fibroblaste comme échafaudage naturel pour les essais cellulaires ultérieurs. Les fibroblastes sont enseventdanss dans une plaque de culture prétraitée et stimulés avec de l'acide ascorbique pour la génération de matrices. Les matrices sont décellularisées et bloquées aux cellules pertinentes à la culture (p. ex., les cellules endothéliales).

Résumé

La matrice extracellulaire (ECM) est un échafaudage tridimensionnel qui agit comme principal support pour les cellules dans les tissus. Outre sa fonction structurelle, l'ECM participe également à la migration cellulaire, à la prolifération et à la différenciation. Les fibroblastes sont le principal type de cellules modifiant l'arrangement et la production de fibres ECM. Dans le cancer, les CAF (fibroblastes associés au cancer) sont dans le statut permanent d'activation, participant au remodelage d'ECM, facilitant la migration de cellules de tumeur, et stimulant l'angiogenèse tumeur-associée, entre autres rôles pro-tumorigenic. L'objectif de cette méthode est de créer une matrice tridimensionnelle avec une composition de fibres qui est similaire aux matrices in vivo, en utilisant des fibroblastes immortalisés ou des CAF primaires humaines. Les fibroblastes sont cultivés dans des plaques de culture cellulaire prétraitées et cultivés sous stimulation acide ascorbique. Ensuite, les fibroblastes sont enlevés et les matrices sont bloquées pour l'ensemencement des cellules. Dans ce modèle ECM, les fibroblastes peuvent être activés ou modifiés pour générer différents types de matrice, dont les effets peuvent être étudiés dans la culture cellulaire. Les matrices 3D sont également façonnées par des signaux cellulaires, comme la dégradation ou les enzymes de liaison croisée qui pourraient modifier la distribution des fibres. Dans ce contexte, l'angiogenèse peut être étudiée, avec d'autres types de cellules telles que les cellules épithéliales.

Introduction

La matrice extracellulaire (ECM) est une structure dynamique présente dans tous les types de tissus. Il se compose de protéines et de polysaccharides qui créent un filet de fibres cruciales pour l'adhérence cellulaire, la migration et la communication1. La composition de l'ECM varie selon le tissu. Tandis que le collagène de type I est la protéine structurale la plus répandue, les types de collagène II, III, V et XI peuvent également être trouvés dans divers tissus2. La fibronectine générée par les fibroblastes est nécessaire pour l'adhérence cellulaire2. En outre, il existe d'autres molécules structurelles comme l'élastine, la laminine et les récepteurs de surface appelés integrins qui médiateur assemblage de fibres et sont spécifiques aux différents tissus ECM2. L'ECM joue un rôle important en tant qu'échafaudage cellulaire et peut également être impliqué dans les processus physiologiques et pathologiques1. Des anomalies dans l'ECM sont observées dans des pathologies telles que le cancer, qui modifie la composition de l'ECM et/ou son organisation. Dans les tumeurs, l'ECM représente la composante non cellulaire du microenvironnement tumoral (TME), un milieu complexe de composants cellulaires tels que les fibroblastes, les cellules immunitaires, les cellules endothéliales, les péricytes et une variété de facteurs solubles. On sait que le TME favorise la progression du cancer et la métastes; les fibroblastes cancéreux-associés, en tant que type de cellule prédominant dans le stroma de tumeur, prennent part à ce processus3. Contrairement aux fibroblastes normaux, les CAC sont en activation permanente, montrant une sécrétion accrue de protéines ECM et de facteurs de croissance (p. ex., Transforming Growth Factor-MD, TGF-MD), ainsi qu'une expression plus élevée de certains marqueurs, tels que l'actine musculaire lisse (-SMA) et la protéine d'activation du fibroblaste (FAP)4. Cependant, les CAT sont une population cellulaire hétérogène, montrant différents niveaux d'activation ou d'expression de marqueur5. On peut alors supposer que la composition et la structure des matrices dérivées du fibroblaste dépendront de l'état et des caractéristiques du fibroblaste.

Dans ce contexte, l'objectif de cette méthodologie est d'établir un modèle in vitro approprié pour la génération d'ECM par des fibroblastes équivalents au réglage In vivo ECM. Nous proposons cette approche comme méthodologie translationnelle in vitro pour d'autres études des fonctions de cellules tumorales, comme la chimiorésistance ou la migration, négociées par ECM. Comme notre groupe l'a publié ailleurs, les FCA peuvent être obtenus à partir d'échantillons de tissus frais, mais il faut noter que la survie des CAF en culture est limitée et leur nombre de passages cellulairesréduit6 . En outre, les cultures primaires des FAC établies à partir d'échantillons de patients peuvent être utilisées pour la génération de matrices. La manipulation de l'expression génique dans les fibroblastes est également une façon intéressante de produire des matrices in vitro variées pour évaluer les effets possibles sur la composition de la matrice, l'orientation des fibres, etc. Dans ce sens, notre groupe a récemment signalé le rôle des fibroblastes exprimant des escargots dans la composition et l'orientation des fibres de diverses matrices dérivées7.

En outre, les CAF et eCM sont impliqués dans le système vasculaire, à la fois dans la génération de navires et dans le cadre de la couche externe de vase8. Le remodelage d'ECM induit l'angiogenèse ; metalloproteinases matrice (MMP) semblent être le type d'enzyme le plus important contribuant à ce processus9,10. La vascularisation tissulaire des cellules primaires qui génèrent les ECM, les macromolécules ECM, les facteurs de croissance résiduels inclus dans l'ECM, l'élasticité de matrice, et l'épaisseur de matrice sont décrits comme facteurs impliqués dans l'activation endothéliale de cellules11. Dans les tumeurs, l'hypoxie augmente la rigidité eCM et la génération de germes endothéliales12. En outre, les CAF sécrètent le facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF) et le facteur de croissance plaquettaire-dérivé (PDGF) qui stimulent l'angiogenèse dans le stroma de tumeur13. Dans ce domaine, la génération de matrice in vitro pourrait être utilisée pour étudier les processus d'angiogenèse ou l'action MMP dans différentes conditions expérimentales. Ainsi, la reproduction in vitro de la matrice in vivo la plus analogue pourrait être un outil précieux pour étudier le rôle de l'ECM dans l'angiogenèse ou les interactions cellulaires micro-environnementales.

La stimulation des fibroblastes cultivés avec de l'acide ascorbique pour améliorer le dépôt de matrice et générer un ECM est un moyen accepté de produire des matrices in vivo analogues. Les lignées cellulaires de fibroblaste immortalisées sont facilement cultivées et sont activées par divers facteurs de croissance, comme PDGF-BB, Tumor Necrosis Factor-MD (TNF-MD) ouTGF-14. Au sein du TME, les CAF synthétisent le collagène de type I et la fibronectine comme principaux composants de l'ECM4. De même, ces composants sont trouvés comme des composants majeurs des matrices dérivées du fibroblaste générées in vitro (figure 1).

Il existe différentes méthodologies in vitro pour simuler in vivo ECM. L'utilisation de plats de culture enrobés avec des mélanges de fibres ECM a été étendue au cours des dernières années, mais cette approche 2D a nécessité une amélioration des structures 3D, telles que les gels interconnectés (par exemple, Matrigel)1. La configuration matrigel-like est devenu la méthode standard pour simuler une matrice 3D. La fibrine est également une alternative lors de la génération de matrices, mais échoue en termes de force et de durabilité de l'ECM1. Le collagène utilisé en combinaison avec d'autres composants ECM modifie certains des problèmes mentionnés ci-dessus. Cependant, ces gels de collagène forment un réseau fort avec des fibres qui peuvent être orientées, mais sont très hétérogènes, qui peuvent être un problème dans les répétitions d'expérience1. Néanmoins, il faut supposer que, selon l'objectif des expériences, l'utilisation de Matrigel ou d'autres hydrogels est plus appropriée (par exemple, dans les études de contraction matricielle dans lesquelles la contraction du gel peut être facilement détectée).

L'immunogénicité potentielle des matrices générées pourrait être un problème dans les expériences avec certains types de cellules. Par conséquent, pour réduire la possibilité de réponses immunitaires dues aux cellules génératrices d'ECM lors de l'utilisation de notre méthode, les matrices sont décellularisées et lavées, bien que l'ablation des fragments cellulaires ne puisse pas être totale15. L'ECM idéal doit être compatible avec la culture cellulaire et capable de communiquer et de réagir aux signaux cellulaires. Notre procédure permet l'introduction de changements sans difficulté pendant la production d'ECM (par exemple, l'ajout de facteurs de croissance stimulant le fibroblaste).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Des échantillons de tissus humains ont été obtenus avec l'approbation du Comité d'éthique de la recherche de l'hôpital Ramon y Cajal, Madrid.

1. Préparation de solutions

  1. Préparer une solution de gélatine de 0,2 % : ajouter 1 g de gélatine à 500 ml de PBS. Autoclave la solution et garder à 4 oC. Filtrer à l'utilisation d'un filtre de 0,22 m avant utilisation.
  2. Préparer 1% de glutaraldéhyde: Ajouter 1 ml de 25% de solution de stock de glutaraldéhyde à 24 ml de PBS. Filtrer à l'utilisation d'un filtre de 0,22 m avant utilisation.
  3. Préparer 1 M d'éthanolamine : préparer la solution d'éthanolamine avec un filtre stérile H2O. avec un filtre de 0,22 m avant utilisation.
    REMARQUE: Comme l'éthanolamine est muniamine avec un bouchon de sécurité, une aiguille et une seringue seront nécessaires.
  4. Préparer l'acide ascorbique : ajouter 0,1 ml de 50 mg/mL de récurage d'acide ascorbique (sensible à la lumière) à 100 ml de milieu.
  5. Préparer le tampon de lyse : préparez PBS 0.5% Triton 100X avec 20 nM de NH4OH. Ajouter NH4OH juste avant l'utilisation.
  6. Préparer PBS Pen/Strep : solution de stock Pen/Strep diluée à 100 U/mL Pen et 100 'g/mL Strep.
  7. Préparer DMEM avec 10% FBS: Ajouter 10% FBS à 500 ml de DMEM. Supplément avec 100 u/mL de pénicilline, 100 streptomycines g/mL, 0,1 mg/mL de normocine et 0,25 g/mL d'amphotericine B.
  8. Préparer 2% BSA de chaleur dénaturée: ajouter 2 g de BSA à 100 ml d'eau stérile. Chauffer à l'eau bouillante pendant 7 min.
  9. Préparer FBS avec des antibiotiques: supplément FBS avec 200 U/mL pénicilline, 200 g/mL de streptomycine, 100 g/mL de gentamicin et 2,5 g/mL d'amphotericine B.

2. Préparation de la culture cellulaire

  1. Ligne cellulaire immortalisée de fibroblastes
    1. Culture recombinante telomerase transfecté fibroblastes humains contrele (BJ-hTERT, ATCC CRL-4001) dans le DMEM avec 10% FBS et maintenir à 37 oC et 5% CO2.
  2. Cellules endothéliales
    1. Culture des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVECs, PCS-100-013 d'ATCC) dans le milieu EBM-2 contenant 2% de FBS et maintiennent à 37 oC et 5% de CO2.
  3. Culture primaire du fibroblaste
    REMARQUE: Pour l'établissement et la culture des FAC, le protocole précédemment publié par notre groupe a été suivi6.
    1. En bref, couper des échantillons de tissus en petits morceaux d'environ 2-3 mm3 et des graines dans FBS avec une forte concentration d'antibiotiques.
    2. Lorsque les premiers fibroblastes sont apparus, remplacer le milieu par le milieu FBM pour l'entretien cellulaire.
      REMARQUE: Selon l'origine des tissus, les cultures cellulaires peuvent être contaminées facilement. Laver les échantillons de PBS complétés avec des antibiotiques, avec des tissus hautement contaminés (p. ex., colon6) et secouer pendant 30-45 min.

3. Matrices 3D dérivées du fibroblaste (Adapté de Castello-Cros et Cukierman16)

  1. Ajouter 2 ml de solution de gélatine de 0,2 % à chaque puits d'une assiette de 6 puits et incuber pendant 1 h à 37 oC ou toute la nuit à 4 oC.
  2. Aspirez la gélatine et lavez-la dans 2 ml de PBS.
  3. Ajouter 2 ml de 1 % de glutaraldéhyde et incuber pendant 30 min à RT. Le glutaraldéhyde reliera la gélatine.
  4. Aspirez le glutaraldéhyde et lavez les puits dans 2 ml de PBS pendant 5 min. Répétez 3 fois.
  5. Ajouter 2 ml d'éthanolamine de 1 M et couver pendant 30 min à RT. L'éthanolamine agira pour bloquer le reste du glutaraldéhyde.
  6. Aspirez l'éthanolamine et lavez les puits dans 2 ml de PBS pendant 5 min. Répétez 3 fois.
  7. Ajouter 1 ml de DMEM avec 10% FBS. Si le milieu devient immédiatement rose, retirer le milieu, laver dans 2 ml de PBS et ajouter à nouveau 1 ml de DMEM avec 10% FBS.
  8. Graine 1 ml de suspension de fibroblaste, avec 5 x 105 cellules dans chaque puits. Le volume total dans chaque puits sera de 2 ml.
  9. Cellules de culture jusqu'à ce que la confluence à 100% soit atteinte. Ensuite, retirez le milieu et remplacez par DMEM avec 10% FBS avec 50 'g/mL acide ascorbique et un traitement supplémentaire si elle est utilisée.
  10. Remplacer le milieu par du DMEM frais par 10 % de FBS et 50 'g/mL d'acide ascorbique tous les 2 jours pendant 6 jours.
    REMARQUE: Si un traitement supplémentaire est utilisé (p. ex., PDGF-BB, TGF-MD et/ou d'autres facteurs de croissance), ajoutez-les les mêmes jours que le traitement à l'acide ascorbique.
  11. Deux jours après le dernier traitement à l'acide ascorbique, retirer le milieu et laver dans 2 ml de PBS.
  12. Ajouter lentement 1 ml de tampon de lyse, préchauffé à 37 oC, à chaque puits. Incuber de 5 à 10 min à RT jusqu'à ce que les fibroblastes soient lysés (observables sous le microscope).
  13. Soigneusement et sans enlever le tampon de lyse, ajouter 2 mL de PBS. Puis aspirer environ 2,5 ml de PBS. Répéter deux fois pour un total de trois lavages.
  14. Finalement, retirer 2,5 mL de PBS et ajouter 2 ml de PBS avec Pen/Strep (100 U/mL et 100 'g/mL, respectivement). Sceller avec le film et conserver à 4 oC jusqu'à 3 mois.
    REMARQUE: Selon l'expérience, le stockage à long terme des matrices générées peut affecter les résultats. Nous recommandons d'utiliser des matrices dès que possible, et encore plus si l'expérience implique l'ensemencement cellulaire, en raison de la dégradation possible des protéines. Si des matrices sont utilisées pour des analyses structurelles, comme l'observation du collagène, les matrices peuvent être fixées et stockées pendant de plus longues périodes. Ce protocole est indiqué pour une plaque de culture de 6 puits. D'autres plaques peuvent être utilisées, mais les volumes réactifs et la concentration de suspension cellulaire doivent être recalculés en fonction de la zone de puits.

4. Essai de formation de tube

  1. Cultivez des cellules HUVEC dans EBM-2 2% FBS jusqu'à la confluence maximale.
  2. Remplacer le milieu par EBM-2 sans FBS pendant 8 h.
  3. Préparer les matrices avant l'ensemencement des cellules.
    1. Retirer les matrices du réfrigérateur et les placer pendant 1 h à RT.
    2. Bloquer les matrices en ajoutant 2 ml de BSA dénaturé par la chaleur. Incuber 1 h à 37 oC.
    3. Aspirez BSA et lavez-vous 2 ml de PBS.
  4. Seed 2 x 105 HUVEC cellules dans le milieu FBS-appauvri sur chaque puits d'une plaque de 6 puits précédemment enduit avec des matrices 3D dérivées du fibroblaste.
  5. Incuber les cellules endothéliales à 37 oC pendant 16 h.
  6. Examiner la formation de la structure en tube sous un microscope de champ lumineux standard au grossissement 20-40x.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Les fibroblastes stimulés PAR LE PDGF-BB créent un ECM plus épais. Herrera et coll. ont montré comment les fibroblastes stimulés par le PDGF ont généré une matrice plus épaisse ainsi qu'une orientation plus élevée en fibres7. Les fibroblastes BJ-hTERT ont été incubés avec ou sans PDGF et les zones représentatives observées ont montré une distribution cellulaire plus alignée dans des matrices produites par le fibroblaste stimulé par le PDGF(figu...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Les matrices peuvent être générées avec des fibroblastes immortalisés ou des cultures primaires de fibroblastes. Les fibroblastes sont faciles à maintenir dans la culture in vitro avec un taux de croissance élevé et une résistance au stress. Ils peuvent même être isolés du tissu post-mortem3, bien que la contamination pourrait être une restriction, selon l'origine du tissu.

Le modèle de matrice 3D offre ici un système nouveau et efficace pour étudier avec succès la comp...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

Remerciements

L'élaboration de ce protocole a été soutenue par PI12/02037, PI15/02101, PI17/01847, PI18/01034 et RD12/0036/0041 de l'Instituto de Salud Carlos III; par le Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER); par "CIBER de Câncer", CB16/12/00273 et CB16/12/00446, de l'Instituto de Salud Carlos III-FEDER; et par la Fondation Cient-fica AECC (une approche multiforme pour cibler le cancer du pancréas). Cristina Pesa est récipiendaire d'un contrat Miguel Servet de l'Instituto de Salud Carlos III. M. Eaude a aidé avec le texte anglais. Nous remercions les membres du laboratoire pour leur aide et leurs conseils tout au long de cette recherche.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Hydroxyde d’ammonium (NH4OH)RothA990.1
Amphotéricine-BCorning30-003-CF
Albumine sérique bovine (BSA)SigmaA7906-50G
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Corning10-014-CVR
Milieu endothélial basal (EBM)LonzaCC-3121ajouter des suppléments avant utilisation
Cellules endothéliales Medium Basal Supplements (EGM-2)LonzaCC-4176
EthanolamineSigma411000-100ML
Sérum fœtal bovin (FBS)BiowestS181B-500inactivé par la chaleur avant utilisation
Fibroblast Growth Basal Medium (FBM)LonzaCC-3131ajouter des suppléments avant utilisation
Milieu de croissance des fibroblastes Suppléments et facteurs de croissance (FGM-2)LonzaCC-4126
Gélatine de peau bovineSigmaG9391-100G
GlutaraldéhydeSigmag5882
Acide L-ascorbiqueSigmaA92902-100Gsensible à la lumière
L-GlutamineLonzaBE17-605E
NormocinInvivogen3ANT-NR-2
Crayonline/Streptomycine (Pen/Strep)Gibco15140122
Saline tamponnée au phosphate (PBS)Corning21-040-CVR
Triton X100Roth3051
Télomérase recombinante transfectée fibroblastes de prépuce humain immortalisés (BJ-hTERT)ATCCATCC CRL-4001
Veine ombilicale humaine cellules endothéliales (HUVEC)ATCCPCS-100-013

Références

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  2. Kular, J. K., Basu, S., Sharma, R. I. The extracellular matrix: Structure, composition, age-related differences, tools for analysis and applications for tissue engineering. Journal of Tissue Engineering. 5, (2014).
  3. Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
  4. Erdogan, B., Webb, D. J. Cancer-associated fibroblasts modulate growth factor signaling and extracellular matrix remodeling to regulate tumor metastasis. Biochemical Society Transactions. 45 (1), 229-236 (2017).
  5. Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kB-Dependent Manner. Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).
  6. Herrera, M., et al. Colon Cancer-associated Fibroblast Establishment and Culture Growth. Bio-protocol. 6 (7), e1773(2016).
  7. Herrera, A., et al. Endothelial cell activation on 3D-matrices derived from PDGF-BB-stimulated fibroblasts is mediated by Snail1. Oncogenesis. 7 (9), 76(2018).
  8. MacColl, E., Khalil, R. A. Matrix Metalloproteinases as Regulators of Vein Structure and Function: Implications in Chronic Venous Disease. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 410-428 (2015).
  9. Shian, S. G., Kao, Y. R., Wu, F. Y. H., Wu, C. W. Inhibition of Invasion and Angiogenesis by Zinc-Chelating Agent Disulfiram. Molecular Pharmacology. 64 (5), 1076-1084 (2003).
  10. Neri, S., et al. Cancer cell invasion driven by extracellular matrix remodeling is dependent on the properties of cancer-associated fibroblasts. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 142 (2), 437-446 (2016).
  11. Du, P., Subbiah, R., Park, J. H., Park, K. Vascular morphogenesis of human umbilical vein endothelial cells on cell-derived macromolecular matrix microenvironment. Tissue Engineering. (Part A), (2014).
  12. Bignon, M., et al. Lysyl oxidase-like protein 2 regulates sprouting angiogenesis and type IV collagen assembly in the endothelial basement membrane. Blood. 118 (14), 3979-3989 (2011).
  13. Huang, L., Xu, A. M., Liu, S., Liu, W., Li, T. J. Cancer-associated fibroblasts in digestive tumors. World Journal of Gastroenterology. 20 (47), 17804-17818 (2014).
  14. Herrera, A., Herrera, M., Peña, C. The emerging role of Snail1 in the tumor stroma. Clinical and Translational Oncology. 18 (9), 872-877 (2016).
  15. Sheng, Y., Fei, D., Leiiei, G., Xiaosong, G. Extracellular Matrix Scaffolds for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Current Stem Cell Research & Therapy. 12 (3), 233-246 (2017).
  16. Castelló-Cros, R., Cukierman, E. Stromagenesis during tumorigenesis: characterization of tumor-associated fibroblasts and stroma-derived 3D matrices. Methods in Molecular Biology. 522, 275-305 (2009).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Matrice d riv e de fibroblastessyst me de matrice 3Dmatrice extracellulaireculture de fibroblastesstimulation l acide ascorbiqued cellularisation de la matriceensemencement de cellules HUVECmicroscopie en champ clairstimulation au PDGF

Articles connexes