Article de méthode

Comparaison Metastatic Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model Established in Mouse Kidney and on Chicken Chorioallantoic Membrane

8.6K vues

⸱

DOI :

10.3791/60314

⸱

8 février 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Medical Pharmacology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Department of Molecular, Cell, and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 3Department of Bioengineering, Hanyang University, 4Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California, Los Angeles, 5Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of California, Los Angeles, 6School of Life Sciences, Beijing Normal University, 7Department of Urology, West China Hospital, Sichuan University, 8Department of Urology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Le carcinome rénal métastatique de cellules claires est une maladie sans modèle animal complet pour l’investigation préclinique complète. Ce protocole illustre deux nouveaux modèles animaux pour la maladie : le modèle orthotopique ment implanté de souris et le modèle chorioallantoic de membrane de poulet, qui démontrent la métastasis de poumon ressemblant à des cas cliniques.

Résumé

Le carcinome rénal métastatique à cellules claires (ccRCC) est le sous-type le plus commun du cancer du rein. Le ccRCC localisé a des résultats chirurgicaux favorables. Cependant, un tiers des patients de ccRCC développeront des métastases au poumon, qui est liée à un résultat très pauvre pour des patients. Malheureusement, aucune thérapie n’est disponible pour ce stade mortel, parce que le mécanisme moléculaire de la métastes reste inconnu. Il a été connu pendant 25 années que la perte de fonction du gène suppresseur de tumeur de von Hippel-Lindau (VHL) est pathognomonic du ccRCC. Cependant, aucun modèle de souris transgénique médicalement pertinent de ccRCC n’a été produit. Le but de ce protocole est d’introduire et de comparer deux modèles animaux nouvellement établis pour le ccRCC métastatique. La première est l’implantation rénale dans le modèle de souris. Dans notre laboratoire, le système d’édition de gènes CRISPR a été utilisé pour assommer le gène VHL dans plusieurs lignées cellulaires du CCR. L’implantation orthotopique des populations hétérogènes de ccRCC à la capsule rénale a créé de nouveaux modèles de ccRCC qui développent des métastases pulmonaires robustes chez les souris immunocompétentes. Le deuxième modèle est le système de membrane chorioallantoïque de poulet (CAM). Par rapport au modèle de souris, ce modèle est plus de temps, de travail, et rentable. Ce modèle a également soutenu la formation et l’intravasation robustes de tumeur. En raison de la courte période de 10 jours de la croissance de tumeur dans LA MCA, aucune métaste manifeste n’a été observée par immunohistochemistry (IHC) dans les tissus embryonnaires rassemblés. Cependant, quand la croissance de tumeur a été prolongée de deux semaines dans le poulet éclos, les lésions micrométastatiques de ccRCC ont été observées par IHC dans les poumons. Ces deux nouveaux modèles précliniques seront utiles pour étudier davantage le mécanisme moléculaire derrière la métastase, ainsi que pour établir de nouveaux xénogreffes dérivés du patient (PDX) vers le développement de nouveaux traitements pour le ccRCC métastatique.

Introduction

Le carcinome rénal de cellules (RCC) est le7ème cancer le plus commun aux Etats-Unis. Chaque année, on estime que 74 000 Américains sont nouvellement diagnostiqués, ce qui représente plus de 14 000 décès (le sous-type histologique à cellules claires, ou ccRCC, est le sous-type le plus courant, représentant environ 80 % des cas de CCR. Les patients présentant la malignité localisée sont traités avec la néphrectomie et ont un taux de survie favorable de 5 ans de 73%1. Cependant, 25%-30% des patients développent des métastases lointaines aux organes vitaux tels que les poumons, ayant pour résultat une survie moyenne pauvre de 13 mois et le taux de survie de 5 ans de seulement 11%1,2,3. Une meilleure compréhension du mécanisme métastatique est nécessaire pour améliorer les résultats mortels pour le ccRCC métastatique.

La perte du gène suppresseur de tumeur de VHL est une lésion génétique caractéristique observée dans une majorité de cas humains de ccRCC4,5,6,7. Cependant, le mécanisme oncogène précis de la perte de VHL dans ccRCC est inconnu. En outre, le statut d’expression VHL n’est pas prédictif des résultats dans ccRCC8. Notamment, en dépit de nombreuses tentatives à l’élimination de VHL rénal-épithélial-ciblé, les scientifiques n’ont pas réussi à générer l’anomalie rénale au-delà des lésions cystiques preneoplastic observées chez les souris9,même lorsqu’elles sont combinées avec la suppression d’autres suppresseurs de tumeur tels que PTEN et p5310. Ces résultats soutiennent l’idée que la perte de VHL seule est insuffisante pour la tumorigenesis ou la métastasie spontanée suivante.

Récemment, notre laboratoire a créé une nouvelle ligne cellulaire VHL knock-out (VHL-KO) en utilisant CRISPR/Cas9 médiation suppression du gène VHL dans la lignée cellulaire de la murine VHLMD ccRCC (RENCA, ou VHL-WT)11,12. Nous avons montré que VHL-KO est non seulement mesenchymal, mais favorise également la transition épithéliale à la transition mésenchymale (EMT) des cellules DEVH-WT12. EMT est connu pour jouer un rôle important dans le processus métastatique13. Nos travaux ont en outre montré que la métaste pulmonaire éloignée se produit seulement avec la co-implantation des cellules VHL-KO et VHL-WT dans le rein, soutenant un mécanisme coopératif de métastes. Fait important, notre modèle VHL-KO et VHL-WT orthotopiquement implanté mène aux métastases robustes de poumon, récapitulant les cas cliniques de ccRCC. Ce modèle spontané de ccRCC métastatique compense l’absence d’un modèle métastatique transgénique de souris, particulièrement dans le développement de nouveaux médicaments anti-métastases. Ce protocole démontre l’implantation rénale de capsule des populations hétérogènes de cellules des cellules renCA génétiquement modifiées.

Les modèles de CAM de poulet ont une longue histoire dans la recherche pour l’angiogenèse et la biologie de tumeur due à leurs nombreux avantages, comme résumé dans le tableau 114,15,16,17,18. En bref, la fenêtre de temps pour la croissance de tumeur de CAM est courte, permettant un maximum de 11 jours jusqu’à ce que le CAM soit détruit à l’éclosion du poulet16. Malgré le court temps de croissance, l’approvisionnement nutritionnel riche et l’état immunodéficient de l’embryon de poulet permettent l’engraftment de tumeur très efficace16,19,20,21. Enfin, le coût de chaque œuf fécondé est de 1 $, comparativement à plus de 100 $ pour une souris SCID. Ensemble, le modèle CAM peut servir de modèle animal alternatif précieux dans l’établissement de nouveaux PDX à une grande économie de temps et de coût par rapport à la souris. Dans ce protocole, nous avons évalué si le modèle était capable de récapituler la biologie du ccRCC métastatique observé dans le modèle orthotopic de souris.

(SCID) SourisCamNote
Coût100 $ chacun1 $ chacunViabilité allant de 50 à 75 %
Besoin de logements barrièreOuinonRéduit davantage les coûts et simplifie la surveillance en série des tumeurs
Tumeur directement visiblenonOuiFigure 3A
Temps de premier engraftment (RENCA)2 semaines2-4 joursréf 14, 15
Point final de la croissance (RENCA)3-6 semaines10 joursréf 14, 15
Métastasie (RENCA) observéeOuiOui chez les poussinsFigure 3D
Passages en sérieOuiOuiréf 16-18
Passage aux souris (RENCA)OuiOuiHu, J., et coll. under review (2019)
Maintenir l’hétérogénéité tumoraleOuiOuiHu, J., et coll. under review (2019)

Tableau 1 : Avantages et limitations des modèles souris et CAM. Ce tableau compare les deux modèles pour leurs avantages et leurs limites en termes de temps requis, de coût, de main-d’œuvre, ainsi que de biologie. Le modèle CAM présente des avantages d’efficacité, mais il a aussi ses propres limites en raison de la morphologie différente entre les oiseaux et les mammifères. Par conséquent, il est important de confirmer que le modèle peut conserver la biologie des xénogreffes.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC), désigné comme comité de recherche animale du chancelier de l’UCLA (ARC) (ARC 2002-049-53 et ARC 2017-102-01A). Le protocole 2002-049-53 est optimisé pour l’implantation de cellules tumorales ccRCC dans la capsule rénale des souris nues ou BALB/c. Les expériences d’implantation tumorale dans les œufs de poulet fécondés avant l’éclosion ne nécessitent pas l’approbation de l’IACUC. Pour prolonger le temps d’établissement des métastes pulmonaires, les embryons atteints de tumeur CAM sont autorisés à éclore et à se développer en poulets. Le protocole 2017-102-01A couvre ces expériences animales.

1. Études orthotopiques de tumeur chez les souris

REMARQUE : La chronologie de cette expérience est indiquée dans la figure 1A. Ces procédures ont été adaptées des publications précédentes11,12.

  1. Préparation de la suspension à cellule unique pour la greffe
    1. Détachez les cellules RENCA VHL-WT et VHL-KO des plats de culture à l’aide de trypsine/EDTA.
    2. Comptez les cellules avec un hémocytomètre et resuspend dans un mélange pré-refroidi 1:1 de PBS et de solution de matrice extracellulaire à une concentration de 1 x 105 cellules/L.
      REMARQUE : Utilisez un rapport de 1:4 de cellules VHL-WT:VHL-KO pour les implants hétérogènes et VHL-WT seul pour les implants homogènes.
    3. Transférer les cellules en suspension dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml et conserver sur la glace jusqu’à l’implantation.
  2. Implantation à la capsule rénale
    1. Anesthésie : Préchauffer un tampon chaud à 37 oC et le recouvrir d’un morceau de drapé stérile épais. Anesthésiez la souris par inhalation d’isoflurane par l’intermédiaire d’une chambre d’induction ou par injection intrapéritonéale (IP) de 1 % de sodium pentobarbital à la dose de 10 ml/kg.
    2. Raser les cheveux du site chirurgical. Cette étape peut être ignorée pour les souris nues.
    3. Désinfection et drapage chirurgical : Désinfectez entièrement le dos de la souris à l’aide de povidone-iode 3x suivi de 70 % d’éthanol 1x et essuyez-le à l’aide d’écouvillons de coton stériles. Ensuite, appliquez trois pansements médicaux stériles séquentiellement, couvrant tout le dos afin de créer un champ chirurgical ainsi que d’immobiliser la souris.
    4. Incision et extériorisation des reins : Avant l’opération, désinfectez les doigts de l’opérateur avec de l’iode povidone ou utilisez une paire de gants stériles. Placez la souris en position couchée et utilisez les doigts pour localiser le rein gauche juste sous le flanc gauche. Utilisez une paire de forceps émoussés et de ciseaux pour couper la peau ouverte et la couche musculaire sous l’emplacement spécifié. Utilisez des cotons-tiges stériles et des forceps pour extérioriser partiellement le rein gauche de l’abdomen.
    5. Implantation de cellules tumorales : Chargez la suspension cellulaire préparée à l’étape 1.1 dans des seringues à insuline ou des seringues Hamilton personnalisées (voir tableau des matériaux pour les spécifications). Injecter 20 l de cellules resuspensionsous la capsule rénale.
      REMARQUE : L’injection réussie est déterminée par la formation d’un renflement translucide à la surface du rein. L’injection accidentelle dans le parenchyme rénal a comme conséquence le saignement et un taux de mortalité postopératoire aussi haut que 90% dû à l’hémorragie mortelle au site d’injection.
    6. Retirez lentement l’aiguille afin de permettre à la solution de matrice extracellulaire de se solidifier et d’éviter une hémorragie ou une fuite de cellules tumorales. Puis, à l’aide d’un coton-tige stérile, repoussez le rein dans l’abdomen.
    7. Couture de blessure : Utilisez une suture VICTRYL enduite de 5-0 pour coudre la couche musculaire. Désinfecter la peau avec de la povidone-iode une fois et fermer la peau avec des autoclips plaie.
    8. Récupération : Placez la souris sur le coussinet chaud jusqu’à ce qu’elle se réveille. Si la souris a été anesthésiée par inhalation, retirez l’isoflurane et gardez la souris sur le coussinet chaud jusqu’à ce qu’elle soit éveillée.
  3. Imagerie par bioluminescence (BLI) et collecte de tissus
    1. Six semaines après l’implantation de tumeur, prenez des images de BLI de firefly-luciferase-basées. Ensuite, euthanasiez les souris avec l’inhalation d’isoflurane suivie d’une luxation cervicale.
    2. Recueillir le sang pour la détection de cellules tumorales circulantes (CTC) par cytométrie de flux.
    3. Récolte zondez la tumeur et les organes d’intérêt (reins, poumons, foie, intestins et rate) en utilisant une technique stérile de récolte des tissus22. Fixez-les dans 4% de paraformaldéhyde pendant la nuit pour l’incorporation de cire de paraffine.

2. Modèle de xénogreffe de tumeur de CAM

REMARQUE : Ces procédures ont été adaptées et modifiées à partir des protocoles précédemment publiés23,24. Le calendrier de cette procédure est indiqué dans la figure 1B. Cet article ne présente que le protocole simplifié. Pour des protocoles détaillés, veuillez consulter un autre article de JoVE publié par notre groupe25.

  1. Préincubation : Incuber les œufs de poulet fraîchement pondus et fécondés dans un incubateur d’œufs rotatif à 37 oC et 55 à 65 % d’humidité pendant 7 jours.
  2. Laissez tomber le CAM et ouvrez la fenêtre (jour de développement 7) :
    1. Localiser et marquer le sac d’air et les veines.
      REMARQUE : Habituellement, 10 à 15 % des œufs sont enlevés parce qu’ils ne sont pas fécondés ou meurent dans les 7 jours suivant la fécondation.
    2. Créez un nouveau sac d’air sur une veine marquée.
    3. Délimiter le nouveau sac d’air, appliquer du ruban adhésif et remettre les œufs à l’incubateur.
      REMARQUE: La procédure peut être interrompue ici. Il est recommandé de reprendre les procédures dans la même journée parce que le sac d’air peut se déplacer.
    4. Ouvrez une fenêtre : À l’aide d’une paire de ciseaux microdissés incurvés et d’une paire de pinces à aiguilles, coupez une fenêtre circulaire de 1,5 x 1,5 cm dans la coquille.
      REMARQUE : La perturbation de la CAM est indiquée par le sang et un morceau de CAM présent sur la pièce de coquille coupée.
    5. Scellez le trou avec un pansement médical transparent et placez les œufs dans un incubateur stationnaire à 37 oC et 55 % à 65 % d’humidité.
      REMARQUE : Utilisez le même incubateur d’œufs que dans l’étape 2.1. Éteignez le rotateur pour le rendre immobile.
  3. Bilan de santé (jour de développement 9) : Enlevez les œufs morts et regroupez ensuite au hasard le reste des œufs pour l’implantation des cellules tumorales.
    REMARQUE : Idéalement, le taux de survie à ce stade est d’environ 80 % du jour de développement 0.
  4. Greffe des cellules tumorales sur le CAM nouvellement exposé (jour de développement 10)
    1. Diluer la solution de matrice extracellulaire dans le double du volume de RPMI 1640 pré-refroidi (avec L-glutamine). Détachez les cellules RENCA et suspendez-les dans la solution ci-dessus pour atteindre une concentration de 2 x 104 cellules/L.
      REMARQUE : Utilisez un rapport de 1:1 des cellules VHL-WT:VHL-KO pour les implants hétérogènes et VHL-WT seul pour l’implantation homogène.
    2. Pour présolidifier la suspension cellulaire, remplissez 100 L de chaque mélange cellulaire en pointes de pipette de 200 l et placez-les dans un incubateur cellulaire pendant 15 min.
    3. Implanter 100 l de suspension cellulaire pour chaque œuf sur la surface du CAM par la fenêtre.
      REMARQUE : Certains protocoles exigent de gratter le CAM avant l’implantation23. Ce n’est pas nécessaire pour les cellules RENCA, car elles se développent très rapidement.
  5. Cultivez des cellules sur le CAM pendant 10 jours et photographiez tous les 2 jours.
  6. Euthanasier et récolter la tumeur, le sang et les organes.
    1. Le jour du développement 20 (jour de tumeur 10), recueillir le sang par l’intermédiaire de la veine chorioallantoic avec une seringue héparinisée de 10 ml.
    2. Euthanasier les embryons en les mettant sur la glace pendant 15 min.
    3. Récolte et pesons les tumeurs. Disséquer les poumons et les foies à l’aide d’une technique de récolte de tissus stériles similaire à celle utilisée pour les souris22.
      REMARQUE: Les foies de poulets ont deux lobes, qui sont les premiers organes vus dans la cavité abdominale. Ne les confondez pas avec les poumons. Les poumons de poulet sont situés sous le cœur et septum26. La collecte réussie des poumons peut être confirmée par les côtes exposées.
    4. Fixer les tumeurs et les organes disséqués dans 4% de paraformaldéhyde pendant la nuit pour l’encastrement de cire de paraffine.
  7. Éclosez les poulets.
    1. Pour permettre une longue période de croissance tumorale, continuer l’incubation jusqu’au jour 21 et laisser les poulets éclore à 37 oC et au moins 60 % d’humidité.
      REMARQUE : Les poulets éclosent naturellement après le jour 21 sur une période de 24 heures, mais ont parfois de la difficulté à éclore par eux-mêmes. Dans ce cas, la fissuration des coquilles d’œufs certains aide. Il est important que les poulets terminent le processus d’éclosion dans les 24 heures parce qu’ils mourront par manque de nutriments après cette date.
    2. Cultivez les poulets dans un établissement animalier (2017-102-01A) pendant 2 semaines.
    3. Le jour de développement 34 (jour de tumeur 24), euthanasiez les poussins avec l’inhalation d’isoflurane suivie de la dislocation cervicale.
    4. Disséquer les poumons à l’aide d’une technique de récolte de tissus stériles similaire à celles utilisées pour les souris22. Ensuite, fixez-les dans 4% de paraformaldéhyde pendant la nuit pour l’encastrement de cire de paraffine.

3. Immunohistochimie

REMARQUE : Toutes les sections de tissus et les taches de H et E ont été faites par le laboratoire de base de pathologie translationnelle (TPCL) à l’université de la Californie, Los Angeles.

  1. Cuire les lames à 65 oC pendant 20 min et déparaffiiniser 3x à l’aide de xylène et réhydrater en série de 100 % d’éthanol à l’eau.
  2. Récupérer les antigènes dans un tampon de citrate bouilli dans un vapeur de légumes pendant 25 min.
  3. Appliquer 1% BSA pour le blocage. Appliquez ensuite les anticorps primaires (anti-VHL, anti-HA, anti-drapeau) préparés à un rapport de dilution de 1:200 dans pbS. Incuber toute la nuit à 4 oC.
  4. Après avoir lavé 3x avec TBST (7 min chacun), couver des glissières avec l’anticorps secondaire à 1:200 dilution. Laver 3x avec tBST (7 min chacun) et appliquer des réactifs DAB suivis d’une contre-staining à l’hématoxylin.

4. Cytométrie de flux

  1. Traiter le sang de souris ou de poulet avec un tampon de lyse (RBC) selon le protocole du fabricant.
    REMARQUE : Une lyse RBC suffisante est particulièrement importante lors de l’analyse du sang DE CAM parce que les RBC de poulet sont nucléements et ne peuvent pas être facilement distingués dans la cytométrie de flux utilisant la diffusion vers l’avant et latérale.
  2. Cytométrie de flux de course sur le lysate sanguin et d’analyser les données pour mStrawberry et egFP expression.
  3. Définir les portes primaires en fonction de la diffusion vers l’avant et latérale à l’exclusion des débris, des cellules mortes et des RBC non lysed.
  4. Définir les barrières de fluorescence en fonction des échantillons non tachés et des commandes tachées simples. Utilisez le lysate sanguin amorcé avec VHL-WT, VHL-KO, ou des cellules RENCA non étiquetées comme les contrôles tachés simples et les contrôles non tachés, respectivement.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Chaque expérience a été effectuée au moins 3x sauf indication contraire. Les données sont présentées comme une déviation moyenne et standard (DD). L’importance a été déterminée par un test T apparié de l’étudiant lorsqu’il y avait deux groupes ou par un ANOVA à sens unique lorsqu’il y avait trois groupes ou plus. Une limite de valeur p de 0,05 a été utilisée pour établir l’importance.

Les cellules RENCA orthotopiques implantées ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Pour beaucoup de patients présentant des malignités épithéliales, la métastasie aux organes vitaux est la cause primaire de la mortalité. Par conséquent, il est essentiel de trouver le mécanisme sous-jacent et une nouvelle avenue de thérapie pour la maladie métastatique. Malheureusement, il y a un manque de modèles animaux ccRCC métastatiques pertinents. Le défi est en grande partie dû à l’incapacité de recréer ccRCC chez la souris en dépit de la génération de nombreux rein transgénique épithélial-ciblé sourdeUR modèles ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Remerciements

Ces travaux ont été financés par la subvention de démarrage de l’UCLA JCCC, la subvention UCLA 3R, le CTSI de l’UCLA et l’UC TRDRP (LW). Nous remercions l’installation d’imagerie préclinique de l’Institut Crump, le TPCL et le Département de médecine animale de laboratoire (DLAM) de l’UCLA pour leur aide dans le traitement des méthodes expérimentales. La cytométrie de flux a été exécutée dans l’UCLA Johnson Comprehensive Cancer Center (JCCC) et le Center for AIDS Research Cytometry Core Facility, qui est soutenu par les prix P30 CA016042 et 5P30 AI028697 de l’UCLA, et par le JCCC, l’UCLA AIDS Institute, la David Geffen School of Medicine de l’UCLA, le Bureau du chancelier de l’UCLA et le Bureau de recherche du vice-chancelier de l’UCLA. Les services de consultation en statistique et d’analyse des données ont été fournis par le ucla CTSI Biostatistics, Epidemiology, and Research Design (BERD) Program qui est soutenu par NIH/National Center for Advancing Translational Science UCLA CTSI Grant Number UL1TR001881.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,25 % de trypsine, 0,1 % d’EDTA dans HBSS sans calcium, magnésium et bicarbonate de sodiumCorning25053CI
8050-N/18 Micro 8V Max Tool KitDremel8050-N/18
anticorps anti-VHLAbcamab135576
BD Lo-Dose U-100 Seringues à insulineBD Biosciences14-826-79
BD Pharm LyseBD Biosciences
BDGeneral Use et PrecisionGlide Aiguilles HypodermiquesFisher Scientific14-826-5D
DAB Chromogen KitBiocare MedicalDB801R
D-Luciferin Firefly, sel de potassiumGoldbioLUCK-1G
DPBS sans calcium ni magnésiumGibcoLS14190250
DYKDDDDK Tag Anticorps monoclonal (FG4R)eBioscience14-6681-82
Éthanol 200 ProofCylinders Management43196-11Préparer 70 % dans l’eau
Sérum de veau fœtal, qualifié, approuvé par l’USDA Régions FisherScientific10-437-028
Fisherbrand Ciseaux de dissection à pointes acéréesFisher Scientific08-940
Fisherbrand Boules de coton stérilesFisher Scientific22-456-885
FisherbrandPince/pince à épiler/pince à pointes ultra-fines, droites et effilées de haute précisionFisher Scientific12-000-122
FisherbrandTubes de microcentrifugation haut de gamme : 1,5 mlFisher Scientific05-408-129
Formaldéhyde Soln., 4 %, tamponné, pH 6,9 (environ 10 % sol de formol), pour histologieMilliporeSigma1.00496.5000
Seringue personnalisée Hamilton8040825 µ ; L, Modèle 702 SN, Echantillon : 30, Style de pointe : 4, Angle : 30, Longueur de l’aiguille : 17 mm
HA-probe Anticorps (Y-11)Santa Cruz Biotechnologysc805
HémocytomètreHausser Scientific3100
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo KitIncubateur EntrepôtHB1588D
Isothésie (Isoflurane) solutionHenry Schein Santé Animale1169567762
IVIS Lumina II Système d’imagerie in vivoPerkin Elmer
Matrigel GFR Membrane MatriceCorningC354230
Medline Instrument chirurgical Drapé, adhésif transparent, 24 po x 18 poMedex SupplyMED-DYNJSD2158
OmniPur BSA, Fraction V [albumine sérique bovine] Isolation des chocs thermiquesMilliporeSigma2910-25GM
Pénicilline-streptomycine Sollution, 100X, 10 000 UI Pénicilline, 10 000 ug/mL StreptomycineFisher ScientificMT-30-002-CI
Pentobarbital SodiumSigma Aldrich57-33-0Préparer 1 % dans une solution saline
Peroxydase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories115-035-062
Peroxydase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories111-035-045
Solution de povidone iodée USP, 10 % (p/v), 1 % (p/v) Iode disponible, pour usage en laboratoireRicca Chemical395516
pSicoRAddgene11579
Dichlorhydrate de puromycine, 99 %, ACROS OrganicsFisher ScientificAC227420500
RencaATCCCRL-2947
RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X avec L-GlutamineCorning10040CV
Scientific Plaques non à jupe à 96 puits, profil basFisher ScientificAB-0700
SHARP Pointes de barrière de précision, pour P-200, 200 et micro ; l, 960 (10 paniers de 96)Thomas Scientific1159M40
Ruban d’expédition, polyvalent, 1,89 » x 109,4 vg, beige, paquet de 6 rouleauxOffice Depot220717
SutureEthiconJ385H
Tegaderm Pansement transparent Original Frame Style 2 3/8 » x 2 3/4Moore Medical1634
Thermo-Chicken Heated PadK& H manufacturing1000
Tube de laboratoire transparent Tygon - 1/4 x 3/8 x 1/16 paroi (50 pieds)TygonAACUN017
VHL-KOCRISPR/Cas9-médié par KO de VHL, puis marqué lentiviralement avec EGFP marqué au drapeau & luciférase de luciole
VHL-WTMarqué lentiviralement avec protéine fluorescente mStrawberry marquée HA & luciférase
World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERRFisher Scientific50-822-331
Kit de clips automatiques de bobinageBraintree scientific, inc.ACS KIT
Xylènes (histologique), Fisher ChemicalFisher ScientificX3S-4
555899 »

Références

  1. Cohen, H. T., McGovern, F. J. Renal-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 353 (23), 2477-2490 (2005).
  2. Bianchi, M., et al. Distribution of metastatic sites in renal cell carcinoma: a population-based analysis. Annals of Oncology. 23 (4), 973-980 (2012).
  3. Hsieh, J. J., et al. Renal cell carcinoma. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17009(2017).
  4. Foster, K., et al. Somatic mutations of the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene in non-familial clear cell renal carcinoma. Human Molecular Genetics. 3, (1994).
  5. Young, A. C., et al. Analysis of VHL Gene Alterations and their Relationship to Clinical Parameters in Sporadic Conventional Renal Cell Carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (24), 7582-7592 (2009).
  6. Gossage, L., Eisen, T., Maher, E. R. VHL, the story of a tumour suppressor gene. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 55-64 (2015).
  7. Sato, Y., et al. Integrated molecular analysis of clear-cell renal cell carcinoma. Nature Genetics. 45 (8), 860-867 (2013).
  8. Choueiri, T. K., et al. The role of aberrant VHL/HIF pathway elements in predicting clinical outcome to pazopanib therapy in patients with metastatic clear-cell renal cell carcinoma. Clinical Cancer Research. 19 (18), 5218-5226 (2013).
  9. Hsu, T. Complex cellular functions of the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene: insights from model organisms. Oncogene. 31 (18), 2247-2257 (2012).
  10. Albers, J., et al. Combined mutation of Vhl and Trp53 causes renal cysts and tumours in mice. EMBO Molecular Medicine. 5 (6), 949-964 (2013).
  11. Schokrpur, S., et al. CRISPR-Mediated VHL Knockout Generates an Improved Model for Metastatic Renal Cell Carcinoma. Scientific Reports. 6, 29032(2016).
  12. Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
  13. Heerboth, S., et al. EMT and tumor metastasis. Clinical and Translational Medicine. 4, 6(2015).
  14. DeBord, L. C., et al. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research. American Journal of Cancer Research. 8 (8), 1642-1660 (2018).
  15. Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1643-1648 (2005).
  16. Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
  17. Ismail, M. S., et al. Photodynamic Therapy of Malignant Ovarian Tumours Cultivated on CAM. Lasers in Medical Science. 14 (2), 91-96 (1999).
  18. Kaufman, N., Kinney, T. D., Mason, E. J., Prieto, L. C. Maintenance of human neoplasm on the chick chorioallantoic membrane. The American Journal of Pathology. 32 (2), 271-285 (1956).
  19. Janse, E. M., Jeurissen, S. H. Ontogeny and function of two non-lymphoid cell populations in the chicken embryo. Immunobiology. 182 (5), 472-481 (1991).
  20. Leene, W., Duyzings, M. J., van Steeg, C. Lymphoid stem cell identification in the developing thymus and bursa of Fabricius of the chick. Zeitschrift fur Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 136 (4), 521-533 (1973).
  21. Solomon, J. B. Foetal and neonatal immunology (Frontiers of biology). 20, North-Holland Pub. Co. (1971).
  22. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. (2019).
  23. Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of Visualized Experiments. (51), e2815(2011).
  24. Fergelot, P., et al. The experimental renal cell carcinoma model in the chick embryo. Angiogenesis. 16 (1), 181-194 (2013).
  25. Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers. Journal of Visualized Experiments. , In Press (2019).
  26. Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 265-324 (2016).
  27. Hu, J., Ishihara, M., Chin, A. I., Wu, L. Establishment of xenografts of urological cancers on chicken chorioallantoic membrane (CAM) to study metastasis. Precision Clinical Medicine. 2 (3), 140-151 (2019).
  28. Casar, B., et al. In vivo cleaved CDCP1 promotes early tumor dissemination via complexing with activated beta1 integrin and induction of FAK/PI3K/Akt motility signaling. Oncogene. 33 (2), 255-268 (2014).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Implantation r nale chez la sourisinvalidation du g ne VHLimplantation tumorale orthotopiqueanalyse des m tastases pulmonairesnum ration des cellules tumorales circulantesd tection par immunohistochimiedition g nomique CRISPRx nogreffes d riv es de patients

Articles connexes