Article de méthode

Infection de Pneumococcus des cellules endothéliales humaines primaires dans le flux constant

DOI :

10.3791/60323

⸱

31 octobre 2019

 ,  ,  , 
1Institut für Mikrobiologie, Technische Universität Braunschweig, 2Devision of Infection Medicine, Department of Clinical Science, Lund University, 3Medical Microbiology and Hospital Epidemiology, Max von Pettenkofer Institute, Ludwig Maximilians University, 4Department of Molecular Infection Biology, Helmholtz Center for Infection Research

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude décrit la surveillance microscopique de l'adhérence au pneumocoque aux chaînes de facteur von Willebrand produites à la surface des cellules endothéliales primaires humaines différenciées sous l'effort de cisaillement dans des conditions définies d'écoulement. Ce protocole peut être étendu à la visualisation détaillée de structures cellulaires spécifiques et à la quantification des bactéries en appliquant des procédures d'immunostaining différentielles.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'interaction de Streptococcus pneumoniae avec la surface des cellules endothéliales est médiée dans le flux sanguin par l'intermédiaire de protéines mécanosensibles telles que le facteur Von Willebrand (VWF). Cette glycoprotéine modifie sa conformation moléculaire en réponse au stress de cisaillement, exposant ainsi les sites de liaison pour un large spectre d'interactions hôte-ligand. En général, la culture des cellules endothéliales primaires sous un flux de cisaillement défini est connue pour favoriser la différenciation cellulaire spécifique et la formation d'une couche endothéliale stable et étroitement liée ressemblant à la physiologie de la muqueuse interne d'un vaisseau sanguin . Ainsi, l'analyse fonctionnelle des interactions entre les agents pathogènes bactériens et la vascularisation hôte impliquant des protéines mécanosensibles nécessite l'établissement de systèmes de pompe qui peuvent simuler les forces physiologiques d'écoulement connues pour affecter la surface de cellules vasculaires.

Le dispositif microfluidique utilisé dans cette étude permet une recirculation continue et sans impulsion des fluides avec un débit défini. Le système de pompe à pression d'air contrôlé par ordinateur applique un stress de cisaillement défini sur les surfaces des cellules endothéliales en générant un flux moyen continu, unidirectionnel et contrôlé. Les changements morphologiques des cellules et l'attachement bactérien peuvent être surveillés et quantifiés au microscope en utilisant des glissières de canal spéciales conçues pour la visualisation microscopique. Contrairement à l'infection de culture cellulaire statique, qui nécessite en général une fixation de l'échantillon avant l'étiquetage immunitaire et les analyses microscopiques, les diapositives microfluidiques permettent à la fois la détection à base de fluorescence des protéines, des bactéries et des composants cellulaires après fixation de l'échantillon; coloration d'immunofluorescence sérielle; et la détection directe à base de fluorescence en temps réel. En combinaison avec des bactéries fluorescentes et des anticorps spécifiques étiquetés fluorescence, cette procédure d'infection fournit un système efficace de visualisation à composants multiples pour un large éventail d'applications scientifiques liées aux processus vasculaires.

Introduction

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La pathogénie des infections à pneumocoques est caractérisée par une interaction multiforme avec une diversité de composés et composants de la matrice extracellulaire de l'hémostasie humaine, tels que le plasminogène et le VWF1,2, 3,4,5,6,7,8. Le multidomaine glycoprotéine VWF sert de régulateur clé d'une hémostase équilibrée en médiatisant le recrutement de thrombocytes et l'incorporation de fibrine sur le site de la formation vasculaire de thrombus9. L'importance de LA VWF fonctionnelle et active pour le contrôle des saignements et la cicatrisation des plaies est démontrée par la maladie de von Willebrand, un trouble héréditaire commun de la coagulation10.

Globular VWF circule dans le système sanguin humain à une concentration allant jusqu'à 14,0 g/mL11,10. En réponse à des lésions vasculaires, la libération locale de VWF par endothélial Weibel Palade Bodies (WBP) est nettement augmenté11,12. Des études antérieures montrent que l'adhésion au pneumocoque aux cellules endothéliales humaines et sa production de la pneumolysine de toxine de pore-formation stimule de manière significative la sécrétion lumineuse de VWF13. Les forces hydrodynamiques du flux sanguin induisent une ouverture structurelle des domaines VWF mécanoresponsive. À des débits de 10 dyn/cm2, la VWF se multimerise à de longues chaînes protéiques allant jusqu'à plusieurs centaines de micromètres de longueur qui restent attachées au sous-endothélium10,12.

Pour comprendre la fonction des chaînes VWF multimerized générées sous l'effort de cisaillement dans l'interaction du pneumocoque avec la surface endothéliale, une approche microfluidique d'infection de culture de cellules a été établie. Un dispositif microfluidique équipé d'un système de pompe à air contrôlé par logiciel a été utilisé. Cela a permis une recirculation continue et unidirectionnelle du milieu de culture cellulaire avec un débit défini. Par conséquent, le système a appliqué un stress de cisaillement défini sur la surface des cellules endothéliales, qui sont restés attachés à l'intérieur des diapositives de canal spécialisées. Cette approche a permis la simulation de la force de cisaillement dans le flux sanguin du système vasculaire humain, dans lequel les chaînes DE VWF sont générées sur des cellules endothéliales différenciées dans des conditions de flux constants définies. À cette fin, les cellules endothéliales ont été cultivées dans des glissements de canal spécifiques (voir Tableau des matériaux), qui ont été adaptés pour des analyses microscopiques pendant le flux. Le système de pompe microfluidique a fourni la situation de stress de cisaillement fortement définie et commandée requise pour la formation des chaînes prolongées de VWF sur la couche endothéliale de cellules confluentes. Après la stimulation de VWF-sécrétion des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine confluently cultivées (HUVEC) par la supplémentation d'histamine, la formation de corde a été induite en appliquant un effort de cisaillement () de 10 dyn/cm2. Le stress de cisaillement est défini comme la force agissant sur la couche cellulaire. Il est calculé approximativement selon Cornish et. al.14 avec l'équation 1:
figure-introduction-1

Où le stress de cisaillement en dyn/cm2, la viscosité dans (dyn)/cm2, h la moitié de la hauteur du canal, w - la moitié de la largeur du canal, et le débit en mL/min.

Le résultat de l'équation 1 dépend des différentes hauteurs et largeurs des différentes diapositives utilisées (voir Tableau des matériaux). Dans cette étude, une glissière de canal Luer de 0,4 m, ce qui a donné lieu à un facteur de glissement de chambre de 131,6, a été utilisée (voir la formule 2).
figure-introduction-2

La viscosité du milieu à 37 oC est de 0,0072 dyn/cm2 et un stress de cisaillement de 10 dyn/cm2 a été utilisé. Il en est résulté un débit de 10,5 ml/min (voir la formule 3).
figure-introduction-3

Ici, l'adaptation et l'avancement d'une procédure de culture de cellules microfluidiques utilisant un système unidirectionnel de flux laminaire pour l'étude et la visualisation des mécanismes d'infection bactérienne dans la vascularisation d'hôte est décrite en détail. La génération de chaînes VWF sur les couches endothéliales peut également être stimulée par l'utilisation d'autres systèmes de pompe qui sont capables d'appliquer un stress continu et régulier de cisaillement15.

Après la culture des cellules endothéliales primaires à la confluence dans le flux et la stimulation de la formation de chaîne de VWF, les pneumocoques exprimant la protéine rouge de fluorescence (RP)16 ont été ajoutés à la couche de cellules endothéliales sous le contrôle microscopique constant. L'attachement des bactéries aux chaînes VWF à la surface des cellules endothéliales a été visualisé et surveillé au microscope pendant jusqu'à trois heures en temps réel en utilisant des anticorps étiquetés fluorescents spécifiques à la VWF. Avec cette approche, le rôle de VWF en tant que cofactor d'adhérence favorisant l'attachement bactérien à l'endothélium vasculaire a été déterminé8.

En plus de la visualisation microscopique de la sécrétion de protéines et des changements conformationnels, cette méthode pourrait être utilisée pour surveiller les étapes individuelles des processus d'infection bactérienne en temps réel et pour quantifier la quantité de bactéries attachées à différents moments de infection. Le système de pompe spécifique contrôlé par logiciel offre également la possibilité de culture des cellules endothéliales dans des conditions de flux constants définies pour un temps allant jusqu'à plusieurs jours et permet une incubation à débit moyen pulsé défini. En outre, cette méthode peut être appliquée en utilisant différents types de cellules. L'adaptation du protocole de coloration permet également la détection et la visualisation des bactéries intériorisées dans les cellules eucaryotes.

Ce manuscrit décrit ce protocole expérimental avancé qui peut être utilisé comme une approche définie, fiable et reproductible pour une caractérisation efficace et polyvalente des processus pathophysiologiques.

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Protocole

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La culture microfluidique de cellules a été exécutée avec les cellules endothéliales humaines primaires commerciales de veine (HUVEC). L'entreprise a isolé les cellules avec le consentement éclairé du donneur. Cette étude a été approuvée par le Comité d'éthique de la Chambre des médecins de l'Etat fédéral du Bade-Wurtemberg avec le numéro de référence 219-04.

REMARQUE: Voir Tableau des matériaux pour les fournitures de protocole.

1. Précultivation des cellules endothéliales primaires

  1. Décongeler un flacon de glycérol congelé contenant 1 x 105 HUVEC primaire de trois donneurs différents doucement à 37 oC et ensemencer les cellules dans 7 ml de milieu de croissance des cellules endothéliales préchauffées (ECGM, prêt à l'emploi avec des suppléments) dans un flacon de 25 cm2 cellules.
    REMARQUE: Les cellules endothéliales primaires perdent la capacité de différenciation après plus de 5 cycles de prolifération. Par conséquent, seules les cellules de moins de 5 passages peuvent être utilisées si des niveaux élevés de différenciation cellulaire sont nécessaires.
  2. Cultiver les cellules à 37 oC dans une atmosphère de CO2 à 5 % pendant 60 min pour permettre l'attachement de surface et échanger le milieu de culture cellulaire ECGM pour se débarrasser des résidus de la cryoconservation.
  3. Continuer à cultiver les cellules à 37 oC dans une atmosphère de CO2 à 5 % jusqu'à ce qu'elles forment une couche cellulaire sous-confluente.
    REMARQUE: Le HUVEC ne doit pas se développer à une couche de confluent puisque les contacts cellulaires serrés empêchent la formation d'une couche cellulaire stable plus tard dans le flux.

2. Précultivation de Streptococcus pneumoniae

CAUTION: Streptococcus pneumoniae est un agent de biosécurité de niveau 2 et n'est autorisé à être cultivé dans les laboratoires de niveau 2 de biosécurité. Utilisez un banc propre classé pour le niveau de sécurité 2 pour tous les traitements bactériens, évitez strictement la formation d'aérosols et utilisez une centrifugeuse avec protection antiaérosol pour la sédimentation des bactéries.

  1. Inoculer une plaque d'agar de sang De Columbia avec Streptococcus pneumoniae isolat clinique ATCC11733 dérivé d'un stock de glycérol constamment stocké à -80 oC et cultiver la plaque d'agar pendant la nuit à 37 oC et 5 % CO2.
  2. Préparer 40 ml de bouillon liquide Todd Hewitt complété par 1 % d'extrait de levure (THY) et 15 ml de salin stérilisé par phosphate (PBS) pH 7,4, pour la culture bactérienne et les étapes de lavage.
  3. Utilisez un tube stérile pour la culture bactérienne et inoculer le bouillon de culture liquide avec la masse bactérienne. Contrôlez la quantité d'inoculation par mesure photométrique de 1 ml d'aliquots à 600 nm contre le bouillon liquide non inoculé comme référence. Remplissez la masse bactérienne dans le bouillon liquide jusqu'à ce qu'il atteigne une densité optique à 600 nm (OD600) de 0,15.
  4. Incuber le bouillon liquide inoculé sans trembler à 37 oC et 5 % de CO2 et déterminer l'OD600 toutes les 30 min en mesurant 1 ml d'aliquots à l'aide de cuvettes en plastique.
  5. Dès que la culture bactérienne a atteint un OD600 de 0,4, ce qui correspond à la phase de croissance exponentielle, centrifuge la suspension de culture bactérienne pendant 10 min à 1000 x g à température ambiante (RT).
    REMARQUE: Ne laissez pas une culture de pneumocoque atteindre un OD600 de plus de 1.0, parce qu'une densité élevée de culture de pneumocoque est connue pour déclencher l'autolyse bactérienne, qui pourrait affecter la forme physique bactérienne globale.
  6. Resuspendre doucement les sédiments bactériens avec 10 ml de PBS et les sédiments à nouveau pendant 10 min à 1 000 x g à RT.
  7. Resuspendre doucement les sédiments bactériens lavés dans un PBS de 1 ml et déterminer l'OD600 de 10 oL de la suspension bactérienne en utilisant 1 ml de PBS comme référence.
  8. Ajuster la quantité de bactéries dans le PBS à un OD600 de 2,0. Selon le comptage bactérien précédemment déterminé, un OD600 de 2.0 correspond à 2 x 109 unités de formation de colonie (CFU). Immédiatement procéder à la procédure d'infection pour prévenir l'autolyse bactérienne.

3. Cultivation cellulaire endothéliale de HUVEC dans des conditions microfluidiques

  1. Détachez les cellules endothéliales primaires du flacon de culture cellulaire par la protéolyse commandée. Effectuer les étapes suivantes dans un environnement stérile à l'aide d'un banc propre. Préparer un volume de 15 ml de PBS stérile pour les étapes de lavage.
    1. Retirez l'ECGM d'une couche HUVEC cultivée sous-confluently et lavez la couche cellulaire à l'aide d'une pipette sérologique de 10 ml à l'aide d'une pipette sérologique pour se débarrasser du milieu de culture cellulaire.
    2. Incuber le HUVEC lavé avec 3 ml de solution de dissociation préchauffée de cellules de 37 oC pour le détachement cellulaire pendant 5 min à 37 oC. Observez le détachement des cellules protéolytiques par surveillance microscopique chaque minute.
    3. Pipette la suspension de cellules détachées dans un tube contenant 7 ml d'ECGM complété par 2% de sérum fœtal de veau (FCS) pour arrêter la protéolyse et sédimenter les cellules pendant 3 min à 220 x g à RT.
    4. Retirez le supernatant et resuspendre le HUVEC en 250 'L d'ECGM complété par 5% FCS et 1 mM MgSO4. Utilisez 10 L de la suspension cellulaire pour le comptage cellulaire à l'aide d'une chambre de comptage des cellules Neubauer et ajuster le nombre de cellules à 4 x 106 cellules/mL ECGM complété par 5% FCS et 1 mM MgSO4.
      REMARQUE: Pour chaque expérience de débit, 30 mL de milieu ECGM complété s'ajouteront à 5 % de FCS et à 1 mM MgSO4 seront nécessaires. A partir de là, cette composition moyenne est nommée ECGMS-medium. L'augmentation de la concentration de FCS dans le milieu de culture de 2% à 5% soutient l'attachement cellulaire et la viabilité cellulaire de HUVEC ensevais dans la glissière de canal. Le milieu complète FCS et MgSO4 stabiliser sensiblement l'attachement cellulaire de HUVEC dans des conditions de stress de cisaillement.
  2. Semencer et cultiver le HUVEC dans une glissière de canal. Travaillez dans un environnement stérile à l'aide d'un banc propre. Les cellules seront cultivées sous le stress de cisaillement pendant 2 jours suivis par l'infection par des bactéries et la surveillance microscopique pendant un autre 2 h.
    1. Équilibrez une glissière de canal, une perfusion de 1,6 mm de diamètre et 50 cm de longueur, un aliquot du milieu ECGMS, et un canal Luer glissent de 0,4 m de hauteur, pendant 24 h dans un incubateur avec 5% d'atmosphère co2 à 37 oC pour réduire le nombre de bulles d'air.
      REMARQUE: Cette procédure est recommandée pour dégazer l'équipement en plastique et pour préréchauffer le milieu, les tubes de perfusion et les réservoirs. Si des matériaux ou des liquides ont été entreposés à RT ou dans le réfrigérateur, les gaz dissous dans le plastique et les liquides seront libérés lorsqu'ils seront chauffés dans l'incubateur pendant l'expérience. Des bulles de gaz apparaîtront alors. Le dégazage de tous les composants en plastique avant l'expérience éliminera cet effet. Chaque fois que le système est retiré de l'incubateur, le processus d'absorption du gaz recommence. Par conséquent, travaillez rapidement à RT et ne laissez jamais l'unité fluide à l'extérieur de l'incubateur pendant de plus longues périodes de temps.
    2. Utilisez une pipette pour injecter 100 l d'une solution de gélatine porcine filtrée stérile de 2 % dans la solution PBS dans l'un des réservoirs d'une glissière de canal à température. Incuber la gélatine-solution pendant 1 h à 37 oC et rincer le canal de la glissière avec 1 mL de PBS dans des conditions stériles à l'aide d'une seringue Luer de 1 ml.
    3. Placez la glissière enduite de gélatine sur une mince plaque de polystyrène ou de polystyrène pour éviter une baisse de la température de la glissière. Ajouter 100 l de la suspension HUVEC de 4 x 106/mL avec une seringue Luer de 1 ml dans la glissière.
      REMARQUE: Placer la glissière du canal sur la surface métallique froide du banc propre pourrait diminuer la température du fond de la glissière, générant ainsi un stress dû au froid pour les cellules endothéliales. Pendant le tuyauterie de cellules tenir la diapositive un peu vers le haut pour laisser les bulles d'air monter et disparaître de l'intérieur de la diapositive.
    4. Incuber la glissière du chenal avec le HUVEC pendant 60 min à 37 oC et 5 % de CO2 et remplir les réservoirs moyens aux deux extrémités de la glissière du chenal avec 60 ECGMS-moyen de 60 l chacun. Incuber pendant 1 h à 37 oC et 5 % de CO2.
  3. Ajuster la pompe microfluidique et les paramètres du logiciel.
    1. Connectez la perfusion liboudée à l'unité de pompe, remplissez avec 13,6 ml d'ECGMS-medium, et démarrez le logiciel de commande de pompe. Sélectionnez l'ensemble de perfusion adéquat et le type de glissière de chambre en utilisant les fenêtres de défilement vers le bas dans le menu de l'unité fluide mis en place. Choisissez 0,007 (dyns/cm2) dans le logiciel pour la viscosité moyenne. (Référez-vous aux paramètres du logiciel de pompe à pression marqués de flèches rouges dans la figure supplémentaire 1).
    2. À l'extérieur de l'incubateur, connectez une bouteille en verre remplie de perles de silice sèches au tube de pression d'air (voir figure 1, Enset 3). L'air de la pompe à pression circule entre les réservoirs de perfusion et la pompe et doit être sec avant de rentrer dans le dispositif de pompe. Sélectionnez paramètres de débit dans le menu logiciel, définiz la pression à 40 mbar, et rincer les tubes de pompe avec le milieu liquide en commençant le flux moyen continu. (Ces paramètres sont également indiqués par des flèches rouges dans la figure 1 supplémentaire).
    3. Programmez les cycles de stress de cisaillement souhaités de la culture d'écoulement. Commencez par 5 dyn/cm2, contrôlez le pumpinng équilibré de réservoir et assurez-vous qu'aucune bulle d'air ne circule dans le système de pompe.
      REMARQUE: Le stress de cisaillement de mur dans une glissière de canal dépend du débit et de la viscosité du milieu de perfusion. Si vous utilisez un autre système de pompe, veuillez consulter les équations décrites dans l'introduction pour définir un débit générant le niveau de stress de cisaillement souhaité. Les paramètres décrits correspondent à un débit de 5,42 ml/min. (Une capture d'écran exemplaire montrant les paramètres de débit adéquats dans le logiciel de pompe à pression est indiquéedans la figure supplémentaire 2 ).
    4. Arrêtez la circulation du débit dans le logiciel de commande de la pompe et maintenez le flux moyen dans le tube de perfusion en serrant les tubes près des connexions Luer. Connectez la glissière du canal, évitant ainsi les bulles d'air, et placez l'unité fluide avec la glissière de canal connectée dans un incubateur de CO2 à 37 oC et 5 % co2. Démarrer le stress de cisaillement à 5 dyn/cm2 pendant 30 min pour adapter en douceur les cellules aux forces générées par le stress de cisaillement avant d'accélérer le niveau de stress de cisaillement (voir la figure supplémentaire 3).
      REMARQUE: Veillez à ce qu'aucune bulle d'air ne reste dans le système de tube ou dans la glissière après la connexion au système de tube parce que le mouvement des bulles d'air dans le flux pourrait mener au détachement de cellules.
    5. Accélérer le stress de cisaillement à 10 dyn/cm2 (qui correspondent à 10,86 ml/min dans ce réglage d'écoulement) et incuber la glissière du canal en stress continu de cisaillement pendant 48 h dans un petit incubateur co2 à 37 oC et 5 % de CO2 pour permettre la différenciation cellulaire ( les settinngs logiciels respectifs sont indiqués avec des flèches rouges dans la figure supplémentaire 4).
      REMARQUE: Les cellules HUVEC ont tendance à se détacher de la surface du chenal si la culture du débit est directement commencée à 10 dyn/cm2. Les cellules restent attachées à la surface de la chambre si la culture du débit est commencée avec moins de stress de cisaillement en utilisant 5 dyn/cm2 pendant un minimum de 30 min suivi par l'augmentation de l'effort de cisaillement lentement jusqu'à la désirée 10 dyn/cm2. Un stress de cisaillement de 10 dyn/cm2 est la valeur minimale dans ce réglage de perfusion requis pour la formation de chaîne DE VWF.
    6. Après 24 h de culture de cellules microfluidiques, arrêter le flux moyen avec le logiciel de contrôle de la pompe exactement quand un niveau moyen équilibré est atteint dans les deux réservoirs moyens. Placer l'unité fluide dans un banc propre et retirer 10 ml du milieu de culture distribué des réservoirs de perfusion à l'aide d'une pipette sérologique de 10 ml. Ajouter 10 ml d'ECGMS-moyen dans les réservoirs pour renouveler le milieu, remettre l'unité fluide dans l'incubateur de CO2 à 37 oC et 5 % de CO2,et redémarrer la culture fluide à l'aide du logiciel de commande de la pompe.
      REMARQUE: La fonction de la pompe à pression peut soudainement être perturbée par des machines de laboratoire telles que de grandes centrifugeuses, ce qui pourrait créer une forte perturbation du champ magnétique. Cette perturbation soudaine pourrait mener au détachement cellulaire. Veillez à ce que ces machines ne soient pas actives près de la pompe à pression pendant l'expérience.
    7. Démarrer le préchauffage de la chambre d'incubation de température couvrant le stade du microscope à fluorescence à 37 oC pour l'équilibre de température 24 h avant la visualisation microscopique. Une fois le microscope préchauffé, commencez le contrôle logiciel du microscope et ajustez les principaux paramètres de la surveillance microscopique de fluorescence en sélectionnant les paramètres de filtre appropriés (540 nm/590 nm pour la détection des bactéries exprimant la DP et 470 nm/515 nm pour la détection de l'émission de fluorescéine des anticorps spécifiques À la VWF conjugués au FITC). Prééptuez une chambre de chauffage supplémentaire pour l'incubation de l'unité fluide à 37 oC.
      REMARQUE: Pendant les analyses d'infection et la surveillance microscopique la température de la glissière du canal et du milieu circulant ne devrait pas diminuer sensiblement, parce que ceci produirait le stress froid sur les cellules. En général, la taille des chambres de température couvrant le stade du microscope n'est pas suffisante pour couvrir l'ensemble de l'unité fluide. Par conséquent, l'utilisation d'une chambre de chauffage supplémentaire préchauffée à 37 oC est recommandée.
    8. Pour une visualisation microscopique, placez l'unité fluide dans la chambre de chauffage préchauffée de 37 oC et placez la glissière du canal sur une scène du microscope préchauffé de 37 oC.
      REMARQUE: Pour la visualisation microscopique, l'unité fluide et la glissière du canal devaient être retirées de l'incubateur CO2 en raison de la longueur limitée du tube de perfusion. Si des temps d'infection et une surveillance microscopique de plus de 180 min sont nécessaires en dehors de l'atmosphère de 5 % de CO2 pour la mise en mémoire tampon du pH, un milieu pH-tamponné devrait être utilisé pour la culture microfluidique.
    9. Contrôler la morphologie cellulaire et l'intégrité de la couche HUVEC avant l'injection d'histamine et de bactéries dans la circulation d'écoulement tout au long de l'expérience d'écoulement et après avoir terminé l'expérience d'écoulement en utilisant le mode champ lumineux du microscope.

4. Induction de VWF-libération et visualisation des cordes multimerized de VWF

  1. Maintenir le réglage du débit, car un stress de cisaillement de 10 dyn/cm2 est nécessaire pour déclencher la multimerisation de VWF à de longues chaînes allant jusqu'à 200 MDa. Induire la libération de VWF de WPB endothéliale en injectant 136 L d'une solution de stock d'histamine de 100 mM dans le milieu ECGMS circulant dans le tube de perfusion à l'aide d'un port d'injection. La concentration finale d'histamine dans le milieu d'écoulement sera de 1 mM. Si aucun port d'injection n'est disponible, l'histamine peut être ajoutée alternativement par pipetting dans le milieu des réservoirs de pompe.
  2. Pour la détection de l'immunofluorescence des chaînes VWF multimerisées, arrêtez le débit lorsqu'un niveau moyen équilibré dans les réservoirs est atteint, et injectez 20 g d'anticorps conjugués À la FITC spécifique à la VWF dans un volume de 200 PBS L (pH 7,4) dans les 13,6 ml de circulation ECGMS-moyen à l'aide d'un port d'injection. Si aucun port d'injection n'est disponible, l'anticorps peut être ajouté alternativement par pipetting dans le milieu des réservoirs de pompe. Il en résulte une concentration finale d'anticorps de 1,3 g/mL.
  3. Pour la numérisation microscopique de plusieurs champs de vision en peu de temps, utilisez l'unité de fluorescence du microscope avec un dispositif de fluorescence xénon à 30% de puissance et une caméra d'épifluorescence. Surveillez la forme et la morphologie de la couche HUVEC avec le mode champ lumineux pour sélectionner les cellules représentatives adaptées à la visualisation des cordes VWF.
  4. Pour la visualisation des cordes VWF fluorescentes vertes, sélectionnez un objectif d'huile 63x/1.40 et un filtre de détection de 470 nm dans le menu unitaire de fluorescence du logiciel de microscope (LasX). Créez des instantanés de z-stacks d'au moins 50 vues représentatives sur le terrain, chacune contenant environ 10 HUVEC morphologiquement intacts. Pour quantifier les cordes VWF fluorescentes vertes à différents moments, scannez plusieurs champs de vision.

5. Évaluation microscopique de l'attachement bactérien aux cordes DE VWF dans le flux en temps réel

  1. Quantifier l'attachement pneumococcique aux cordes VWF générées sur les surfaces cellulaires HUVEC par détection d'immunofluorescence.
    1. Maintenez le débit et injectez 1,35 x 108 pneumocoques exprimant la DP CFU/mL dans un volume maximum de 1 ml dans le milieu ECGMS à l'aide du port d'injection. Alternativement, pipette les bactéries dans le milieu dans le réservoir de la pompe. Redémarrez le stress de cisaillement à 10 dyn/cm2 pour laisser les bactéries circuler dans le système de pompe.
    2. Sélectionnez un objectif d'immersion d'huile 63x pour le grossissement au microscope et ajustez les paramètres du filtre à fluorescence du logiciel microscope au canal De la DP (filtre de détection de 540 nm) pour la détection des pneumocoques exprimant la DP.
    3. Pour quantifier l'attachement bactérien aux chaînes VWF, arrêtez le flux et créez des instantanés de piles Z d'au moins 30 vues représentatives sur le terrain, chacune contenant environ 10 HUVEC morphologiquement intacts, et comptez la quantité de pneumocoques.
    4. Utilisez l'algorithme de statistiques un factorielle ANOVA pour évaluer les données, suivi d'un test d'échantillon non apparié post hoc à deux queues pour une comparaison statistique détaillée. Les valeurs De P de l'ilt;0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.

6. Évaluation microscopique de l'attachement bactérien aux cordes VWF après fixation d'échantillon

  1. Échantillonnez la fixation avant la coloration d'immunofluorescence.
    1. Arrêter le débit, retirer 10 ml d'ECGMS-moyen des réservoirs de la pompe, et ajouter 10 ml de PBS complété par 5% de paraformaldéhyde (PFA). Laissez la solution PFA circuler pendant 10 min à un stress de cisaillement de 10 dyn/cm2.
    2. Débranchez la glissière du canal de l'unité de pompe.
  2. Bloquez les sites de liaison non spécifiques à la surface des cellules et effectuez l'immunodétection des chaînes VWF et des bactéries attachées.
    1. Préparer 4 ml d'une solution de lavage contenant 100 mM Na2CO3 (pH 9,2) complétée par un saccharose de 4 % pour toutes les étapes de lavage. Préparer 1 mL d'une solution de blocage contenant 100 mM Na2CO3 (pH 9,2) complétée par 4 % de saccharose et 2 % d'albumine bovine (BSA) pour bloquer des sites de liaison non spécifiques.
    2. Laver la glissière 3x du canal incubé par PFA à l'aide d'une seringue Luer de 1 ml pour injecter 200 ll de la solution de lavage et incuber la glissière pendant 120 min à RT avec une solution de blocage de 200 lL.
    3. Préparer 4 mL d'une autre solution de blocage contenant 100 mM Na2CO3, (pH 9,2) complétée par 4% de saccharose et 0,5% de BSA pour la dilution des anticorps. Utilisez 200 L de cette solution de blocage pour diluer l'antisérum lapin spécifique au pneumocoque 1:100. Utilisez 200 L de cette solution de blocage pour diluer l'anticorps de souris spécifique à la VWF 1:50 pour faire une concentration d'anticorps spécifique à la VWF de 4 g/mL. Diluer l'anticorps secondaire conjugué AlexaFluor488 d'une solution de stock de 2 mg/mL 1:100 dans 200 OL de PBS (pH 7,4) pour générer une concentration finale de 20 g/mL.
      REMARQUE: Dans les paramètres d'immunofluorescence décrits, la détection d'anticorps a livré des résultats optimaux quand les anticorps ont été dilués dans le tampon alcalin mentionné ci-dessus de carbonate. Sur la base des résultats précédents, les solutions de blocage recommandées et la quantité d'anticorps conviennent à de nombreuses applications. Cependant, différentes expériences peuvent nécessiter l'optimisation individuelle de la combinaison d'anticorps, la concentration d'anticorps, le temps d'incubation, et la constitution du tampon de blocage. Comme alternative, un système tamponné de phosphate avec une plage de pH neutre pourrait être approprié ou même préféré comme tampon d'incubation. En cas de faible fluorescence, la concentration d'anticorps secondaires devrait être augmentée. Si trop de bruit de fond de fluorescence non spécifique est détecté, la quantité de substances de blocage devrait être augmentée.
    4. Pour la coloration VWF-immunofluorescence, lavez la lame de canal à l'aide d'une seringue Luer de 1 ml en injectant 200 ll de la solution de lavage 3x et incubez la glissière avec l'anticorps spécifique VWF dilué de 1:50 pendant 30 min à RT. Ensuite, lavez la glissière du canal à nouveau 3x avec 200 L de la solution de lavage et couver la diapositive avec l'anticorps AlexaFluor488 dilué AlexaFluor488-spécifique à la souris pendant 30 min à RT. Enfin, lavez la glissière du canal à nouveau 3x avec 200 l de la solution de lavage.
      REMARQUE: Les AlexaFluor-fluorophores sont sensibles au blanchiment. Par conséquent, la glissière doit être protégée en la gardant dans une chambre sombre pendant les étapes d'incubation avec les anticorps conjugués au fluorophore.
    5. Pour l'immunodétection des pneumocoques, couver la glissière avec un anticorps de lapin spécifique au pneumocoque dilué de 1:100 pendant 30 min à RT. Ensuite, lavez la glissière de canal 3x avec 200 l de la solution de lavage et couvez la glissière avec 1:100 dilué AlexaFluor568-conjugué lapin-spécifique anticorps pendant 30 min à RT. Laver la glissière de canal à nouveau 3x avec 200 l de la solution de lavage.
    6. Pour tacher le cytosquelette d'actine cellulaire avec la phalloidin fluorescente, perméabiliser le HUVEC par incubation avec 120 L de 0,1 % Triton X-100 pendant 5 min à RT. Laver la glissière du canal 3x avec 200 l de la solution de lavage et couver la glissière avec 120 'L de 1:1,000 dilué Phalloidin AlexaFluor350-conjugué. Cette étape d'incubation permettra de visualiser le cytosquelette d'actine polymérisé et de surveiller la forme des cellules et d'éventuels changements morphologiques induits par le stress.
    7. Laver la glissière de canal 3x avec 200 l de la solution de lavage. Enfin, lavez la diapositive 4x avec 200 L ddH2O et visualisez les cordes fluorescentes vertes de VWF, les bactéries fluorescentes rouges, et le cytosquelette fluorescent bleu d'actine utilisant les arrangements appropriés de filtre sur le microscope de fluorescence.

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Résultats

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La culture primaire HUVEC dans un flux unidirectionnel constant a comme conséquence la formation d'une couche cellulaire confluente et étroitement emballée qui favorise la génération des WPB s'empaquetent avec le VWF mécanosensible13,14. Ce protocole décrit l'utilisation d'un système de recirculation à base de pompe à pression d'air et sans impulsions pour l'analyse des infections qui nécessite d'imiter la situation de stress de cisaillement dans le flux sanguin ...

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Discussion

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La simulation de l'interaction bactérienne avec les protéines hôtes mécanosensibles telles que VWF nécessite un système de culture cellulaire perfusable qui permet la génération d'un flux défini, unidirectionnel et continu de liquides, générant ainsi un stress de cisaillement fiable . Plusieurs systèmes de pompe microfluidique ont déjà été décrits. Un examen complet de Bergmann et coll. résume les aspects clés des différents modèles de culture cellulaire en deux et trois dimensions17.

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

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Le projet a été financé par le DFG (BE 4570/4-1) à S.B.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Seringue LuerScientific 10303002 de 1 mL d’unvolume de 1 mL pour l’injection de gélatine à l’aide de la connexion Luer des lames
Seringue Luer de 2 mLSarstedt9077136Pour perforation/injection de fluides dans les raccords Luer des lames de la chambre du canal
AccutaseeBioscience now thermo fisher00-4555-56Mélange de protéase utilisé pour le détachement en douceur des cellules endothéliales
Phalloïdine conjuguée à AlexaFluor350Abcamab176751aucune concentration disponible auprès du fabricant, la solution mère est suffisante pour 300 tets, la société recommande d’utiliser 100 µ ; L d’une dilution de 1:1 000, fluorescence bleue (paramètres du filtre DAPI)
Anticorps anti-souris dérivé de la chèvre conjugué AlexaFluor488Thermo Fisher SientificA11001concentration du stock : 2 mg/mL pour l’immunocoloration du VWF humain dans une lame microfluidique après fixation PFA, fluorescence verte
Anticorps anti-lapin dérivé de la chèvre conjugué AlexaFluor568Thermo Fisher ScientificA-11011concentration stock : 2 mg/mL pour l’immunomarquage des pneumocoques dans une lame microfluidique après fixation des pFA, fluorescence rouge
Bacto Todd-Hewitt-BrothBecton Dickinson GmbHBD 249210milieu de culture bactérienne complexe
Albumine sérique bovine (BSA)Sigma AldrichA2153-25Gsolubilisé, pour la préparation d’un tampon de blocage
Fioles de culture cellulaire avec filtreTPP90026sous-culture de HUVEC dans des flacons de culture cellulaire non enrobés de 25 cm2
surface Centrifugeuse Allegra X-12RBeckman Coulter Life Sciences392304essorage des bactéries (volumes de >2 ml)
Centrifugeuse Allegra X-30Beckman Coulter Life SciencesB06314Centrifugation des cellules eucaryotes
Centrifugeuse Z 216 MKHermle305.00 V05 - Z 216 Messorage des bactéries (volumes inférieurs à 2 ml)
ChloramphénicolCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe3886.2utilisé à une concentration de 0,2 mg/mL pour la culture de pneumocoques transformés avec une construction génétique portant une protéine fluorescente rouge et une cassette de résistance au chloramphénicol
Pince pour tube de perfusionibidi10821pour maintenir le liquide dans le tube avant de relier la lame au système de pompe
MIDI 402a été utilisée pour la culture en flux à 37 ° ; C et 5 % CO2
>CO2-IncubateurSanyoMCO-18 AICpour l’incubation de bactéries et de cellules dans une atmosphère définie à 5 % de CO2 et 37 ° ; C
Colombie Plaques de gélose au sangBecton Dickinson GmbHPA-254005.06Milieu de culture complexe à base de gélose pour S. pneumoniae complété par 7 % de sang de mouton
Ordinateur DellLatitude 3440Comuter avec logiciel de pompe à pression
Microscope confocal à balayage laser (CLSM)LeicaDMi8Un microscope inversé avec une platine recouverte d’une chambre chauffante et avec une unité de fluorescence équipée d’un filtre de fluorescence, d’une source lumineuse au xénon (SP8, DMi8) et d’un DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1,4 mégapixel)
Di Hydrogénophosphate de potassium (KH2PO4)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe3904.1utilisé pour le tampon PBS
Matériau de séchageMerck101969des billes de silice orange pour le séchage utilisées dans une bouteille en verre avec un adaptateur de tubulure
Supplément ECGM MixPromocellC-39215mélange pour ECGM -moyen, nécessaire pour la pré-culture des cellules endothéliales : 0,02 mL/mL de sérum de veau fœtal, 0,004 mL/mL de supplément de croissance des cellules endothéliales, 0,1 ng/mL de facteur de croissance épidermique, 1 ng/mL de facteur de croissance des fibroblastes basiques, 90 & micro ; g/mL d’héparine, 1 & micro ; g/mL Hydrocortisone
ECGMSPromocellC-22010ECGM complété par 5 % [p/p] de FCS et 1 mM de MgSO4 pour augmenter l’adhésion cellulaire
Milieu de croissance cellulaire endothéliale (ECGM, prêt à l’emploi)PromocellC-22010de HUVEC, déjà complété par tous les composants du mélange de suppléments
Sérum de veau fœtal (FCS)biochrome maintenant MerckS 0415supplément pour la culture cellulaire, utilisé pour les analyses d’infections
Anticorps anti-VWF de chèvre conjugué FITCAbcamab8822concentration du stock : 10 mg/mL, pour l’immunodétection du VWF globulaire et multimérisé en flux
Unité fluidiqueibidi10903Unité fluidique pour la culture en flux
Gélatine (porcine)Sigma AldrichG-1890-100gpour le pré-revêtement de la surface du canal de microlames
Chlorhydrate d’histamineSigma AldrichH-7250-10MGpour l’induction de la sécrétion de VWF à partir de l’endothélium Corps de Palade de Weibel
Cellule endothéliale de la veine ombilicale humaine (HUVEC)PromocellC-12203 Lot-Nr. 396Z042cellules endothéliales primaires d’un donneur groupé, stockées dans de l’azote liquide
Anticorps humain spécifique du VWF dérivé de souris (monoclonal)Santa Cruzsc73268Concentration du stock : 200 & micro ; g/mL pour l’immunocoloration du VWF dans une lame microfluidique après fixation par PFA
Port d’injectionibidi10820pour l’injection d’histamine ou de bactéries dans la tubulure du réservoir pendant la circulation de l’écoulement
Microscope optiqueZeissAxiovert 35Mpour le contrôle du décollement des cellules eucaryotes et le comptage des cellules à l’aide d’un objectif à eau 40x permettant un grossissement
400xLuer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides)ibidi80176lames physiquement modifiées pour la culture fludique (&mu ; &ndash ; Diapositive I0.4Luer avec une hauteur de canal de 0,4 mm, un volume de canal de 100 &mu ; L, une surface de croissance de 2,5 cm et une surface de revêtement de 25,4 cm2) Adapté à tous les types de tests d’écoulement, le traitement physique génère une surface hydrophile et adhésive.
Sulfate de magnésium (MgSO4, non hydraté)Sigma AldrichM7506-500GPour la préparation du milieu ECGMS
Pompe microfluidiqueibidi10905Pompe à pression d’air
Neubauer Chambre de comptage de cellulesKarl Hecht GmbH& Co KG40442002chambre de comptage microscopique pour HUVECs
Paraformaldéhyde 16 % (PFA)Microscopie électronique Sciences15710-Spour la réticulation d’échantillons Kit de
perfusionibidi10964Kit de perfusion jaune/vert a un diamètre de tube de 1,6 mm, une longueur de tube de 50 cm, un volume de travail total de 13,6 mL, un volume de tube mort de 2,8 mL et une taille de réservoir de 10 mL. combiné avec le µ ;-slide L0.4Luer, à 37 ° ; C et une viscosité de 0,0072 dyn x s/cm2 une plage de débit de 3,8 mL/min à 33,9 mL/min et une contrainte de cisaillement comprise entre 3,5 dyn/cm2 et 31,2 dyn/cm2 peuvent être atteintes. d’une longueur de 50 cm pour
solution saline microfluidique tamponnée au phosphate (PBS),la solution a été préparée à l’aide des produits chimiques suivants : 0,2 g/L de KCl, 1,44 g/L de Na2HPO4, 0,24 g/L de KH2PO4 pH 7,4
Cuvettes en plastiqueSarstedt67,741(2 x optique) pour la mesure de la DO à 600 nm
Antisérum spécifique du pneumocoquePinedalapin à l’aide de Streptococcus pneumoniae NCTC10319 inactivé thermiquement et D39, purifié en IgG à l’aide d’une colonne de protéineA-sépharose.
polystyrène ou en polystyrène: il s’agit d’une mesure de précaution pour éviter le stress dû au froid sur les cellules ensemencées dans les lames de canaux. Tout type de polystyrène tel que le matériau de boîte d’emballage peut être utilisé. L’assiette peut avoir une épaisseur de 0,5 cm et doit avoir une taille de 20 cm2.
Chlorure de potassium (KCl)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe6781.1utilisé pour le tampon PBS
Logiciel de commande de pompe (PumpControl v1.5.4)ibidiv1.5.4Logiciel informatique pour la commande de la pompe sous pression, le réglage des conditions d’écoulement et le début/fin de l’écoulement
Tubes de réaction 1,5/2,0 mLSarstedt72.706/ 72.695.500nécessaire pour les dilutions d’anticorps
Tubes de réaction de 50 mL volumeSarstedt6,25,48,004
Pneumocoques exprimant la RFPCollection nationale des cultures types, Public Health England10 319Streptococcus pneumoniae sérotype 47 exprimant la RFP fusionnée à une protéine de type ahitone intégrée dans le génome
Pipettes sérologiques 5, 10 mLSarstedt86.1253.025/ 86.1254.025pour la pipetage de plus grands volumes
Carbonate de sodium (Na2CO3, sans eau)Sigma Aldrich451614-25Gpour la préparation de 100 mM Tampon de carbonate de sodium
Dihydrogénophosphate de sodium (NaH2PO4)Carl Roth GmbH + Co. KG, KarlsruheP030.2utilisé pour le tampon PBS
Photomètre spectral Libra S22Biochrom80-2115-20mesure de la densité optique (DO) d’une suspension bactérienne à 600 nm
SaccharoseSigma AldrichS0389-500Gpour la préparation d’un tampon de blocage
Triton X-100Sigma AldrichT9284-500MLUtilisé à 0,1 % de concentration finale dilué dans dH20 pour la perméabilisation des cellules eucaryotes après fixation PFA
Extrait de levureoxoïdeLP0021les bactéries sont cultivées dans un supplément de THB avec 1 % [p/p] d’extrait de levure = milieu de culture bactérienne complet THY
Fisher La taille de l’incubateur Fisher Scientific est parfaitement adaptée à la taille de l’incubateur CO et Milieu de culture inverse une élevé chez le Plaque en

Références

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Dispositif microfluidiqueContrainte de cisaillementFacteur de von WillebrandCulture de HUVECMicroscopie fluorescenceAdh rence bact rienneFils de VWF

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