Quantification absolue du métabolisme de synthèse des protéines sans cellules par spectrométrie de chromatographie liquide à phase inversée

Michael Vilkhovoy; David Dai; Sandra Vadhin; Abhinav Adhikari; Jeffrey D. Varner

doi:10.3791/60329

Article de méthode

Quantification absolue du métabolisme de synthèse des protéines sans cellules par spectrométrie de chromatographie liquide à phase inversée

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DOI :

10.3791/60329

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25 octobre 2019

Michael Vilkhovoy¹ , David Dai¹ , Sandra Vadhin^*¹ , Abhinav Adhikari^*¹ , Jeffrey D. Varner¹

¹Robert Frederick Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering, Cornell University

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole robuste pour quantifier 40 composés impliqués dans le métabolisme central de carbone et d'énergie dans les réactions de synthèse de protéine sans cellules. Le mélange de synthèse sans cellules est dérivé avec de l'aniline pour une séparation efficace à l'aide d'une chromatographie liquide en phase inversée, puis quantifié par spectrométrie de masse à l'aide de normes internes étiquetées isotopiques.

Résumé

La synthèse des protéines sans cellules (CFPS) est une technologie émergente dans les systèmes et la biologie synthétique pour la production in vitro de protéines. Toutefois, si le SCFP veut aller au-delà du laboratoire et devenir une technologie de fabrication répandue et standard juste à temps, nous devons comprendre les limites de performance de ces systèmes. Vers cette question, nous avons développé un protocole robuste pour quantifier 40 composés impliqués dans la glycolyse, la voie de phosphate de pentose, le cycle d'acide tricarboxylique, le métabolisme énergétique et la régénération de cofactor dans les réactions de CFPS. La méthode utilise des normes internes étiquetées avec ¹³C-aniline, tandis que les composés de l'échantillon sont dérivés de ¹²C-aniline. Les normes internes et l'échantillon ont été mélangés et analysés par spectrométrie de masse de chromatographie liquide de phase inversée (LC/MS). La co-élution des composés a éliminé la suppression d'ion, permettant la quantification précise des concentrations de métabolites au-dessus de 2-3 ordres de grandeur où le coefficient moyen de corrélation était 0.988. Cinq des quarante composés n'ont pas été étiquetés avec de l'aniline, cependant, ils ont été encore détectés dans l'échantillon DEPFC et quantifiés avec une méthode standard de courbe. La course chromatographique prend environ 10 minutes à compléter. Pris ensemble, nous avons mis au point une méthode rapide et robuste pour séparer et quantifier avec précision 40 composés impliqués dans le SPFC en un seul lcl/MS. La méthode est une approche complète et précise pour caractériser le métabolisme sans cellules, de sorte qu'en fin de compte, nous pouvons comprendre et améliorer le rendement, la productivité et l'efficacité énergétique des systèmes sans cellules.

Introduction

La synthèse des protéines sans cellules (CFPS) est une plate-forme prometteuse pour la fabrication de protéines et de produits chimiques, une application traditionnellement réservée aux cellules vivantes. Les systèmes sans cellules sont dérivés d'extraits de cellules brutes et éliminent les complications associées à la croissance cellulaire¹. En outre, le SCFP permet un accès direct aux métabolites et aux machines biosynthétiques sans interférence d'une paroi cellulaire. Cependant, il n'y a pas eu de compréhension fondamentale des limites de rendement des processus sans cellules. Les méthodes à haut débit pour la quantification des métabolites ....