Quantification absolue du métabolisme de synthèse des protéines sans cellules par spectrométrie de chromatographie liquide à phase inversée

La synthèse des protéines sans cellules (CFPS) est une plate-forme prometteuse pour la fabrication de protéines et de produits chimiques, une application traditionnellement réservée aux cellules vivantes. Les systèmes sans cellules sont dérivés d'extraits de cellules brutes et éliminent les complications associées à la croissance cellulaire¹. En outre, le SCFP permet un accès direct aux métabolites et aux machines biosynthétiques sans interférence d'une paroi cellulaire. Cependant, il n'y a pas eu de compréhension fondamentale des limites de rendement des processus sans cellules. Les méthodes à haut débit pour la quantification des métabolites sont précieuses pour la caractérisation du métabolisme et sont essentielles pour la construction de modèles de calcul^{métaboliques 2,3,4}. Les méthodes courantes utilisées pour déterminer les concentrations de métabolites comprennent la résonance magnétique nucléaire (RMN), la spectroscopie à infrarouge transformateur (FT-IR) de Fourier, les essais à base d'enzymes et la spectrométrie de masse (MS)^{5,6,7 ,8}. Cependant, ces méthodes sont souvent limitées par leur incapacité à mesurer efficacement plusieurs composés à la fois et nécessitent souvent une taille d'échantillon supérieure aux réactions typiques sans cellules. Par exemple, les essais à base d'enzymes ne peuvent souvent être utilisés que pour quantifier un seul composé dans une course, et sont limités lorsque la taille de l'échantillon est petite, comme dans les réactions de synthèse des protéines sans cellules (généralement exécuté sur une échelle de 10-15 L). Pendant ce temps, la RMN exige une forte abondance de métabolites pour la détection et la quantification⁵.  À l'égard de ces lacunes, les méthodes de chromatographie en tandem avec la spectrométrie de masse (LC/MS) offrent plusieurs avantages, y compris une sensibilité élevée et la capacité de mesurer plusieurs espèces simultanément^9; cependant, la complexité analytique augmente considérablement avec le nombre et la diversité des espèces mesurées. Il est donc important de développer des méthodes qui réalisent pleinement le potentiel de haut débit des systèmes LC/MS. Les composés d'un échantillon sont séparés par chromatographie liquide et identifiés par spectrométrie de masse. Le signal du composé dépend de sa concentration et de son efficacité d'ionisation, où l'ionisation peut varier d'un composé à l'autre et peut également dépendre de la matrice de l'échantillon.

Atteindre la même efficacité d'ionisation entre l'échantillon et les normes est un défi lorsque vous utilisez LC/MS pour quantifier les analytes. En outre, la quantification devient plus difficile avec la diversité des métabolites en raison de la division du signal et de l'hétérogénéité dans l'affinité des protons et la polarité¹⁰. Enfin, la matrice de co-élutation de l'échantillon peut également affecter l'efficacité de l'ionisation des composés. Pour résoudre ces problèmes, les métabolites peuvent être dérivés chimiquement, ce qui augmente la résolution et la sensibilité de séparation par les systèmes LC/MS, tout en diminuant simultanément le fractionnement du signal dans certains cas^10,11. La dérivation chimique fonctionne en étiquetant des groupes fonctionnels spécifiques de métabolites pour ajuster leurs propriétés physiques comme la charge ou l'hydrophobicité pour augmenter l'efficacité de l'ionisation¹¹. Divers agents de marquage peuvent être utilisés pour cibler différents groupes fonctionnels (p. ex. amines, hydroxyles, phosphates, acides carboxyliques, etc.). L'aniline, l'un de ces agents de dérivation, cible plusieurs groupes fonctionnels à la fois, et ajoute un composant hydrophobe dans les molécules hydrophiles, augmentant ainsi leur résolution de séparation et le signal¹². Pour faire face à l'effet de suppression des ions de la matrice co-étui, Yang et ses collègues ont mis au point une technique basée sur l'étiquetage de la technologie standard interne spécifique au groupe (GSIST) lorsque les normes sont étiquetées avec des isotopes aniin de ¹³C et mélangées à l'échantillon. ^12,13. Le métabolite et la norme interne correspondante ont la même efficacité d'ionisation puisqu'ils co-éliment, et leur rapport d'intensité peut être utilisé pour quantifier la concentration dans l'échantillon expérimental.

Dans cette étude, nous avons développé un protocole pour détecter et quantifier 40 composés impliqués dans la glycolyse, la voie de phosphate de pentose, le cycle d'acide tricarboxylique, le métabolisme énergétique et la régénération cofactorielle dans les réactions de CFPS. La méthode est basée sur l'approche GSIST, où nous avons utilisé ¹²C-aniline et ¹³C-aniline pour étiqueter, détecter et quantifier les métabolites à l'aide de LC/MS en phase inversée. La plage linéaire de tous les composés s'étendait sur 2-3 ordres de grandeur avec un coefficient de corrélation moyen de 0,988. Ainsi, la méthode est une approche robuste et précise pour interroger le métabolisme sans cellules, et peut-être des extraits de cellules entières.

1. Préparation des réactifs pour le marquage aniline

1. Préparer une solution d'aniline de 6 M au pH 4.5. En travaillant dans une hotte, combiner 550 l d'aniline avec 337,5 l d'eau de qualité LCMS et 112,5 l d'acide chlorhydrique (HCl) de 12 M dans un tube de centrifugeuse. Bien Vortex et conserver à 4 oC.
   REMARQUE : L'aniline peut être stockée à 4 oC pendant 2 mois.
   CAUTION: L'aniline est très toxique et doit être travaillé avec dans un capot de fumée. L'acide chlorhydrique est très corrosif
2. Préparer une solution d'aniline 6 M ¹³C au pH 4.5. Mélanger 250 mg de ¹³C₆-aniline avec 132 l d'eau et 44 oL de 12 M HCl. Vortex bien et stocker à 4 oC.
3. Préparer 200 mg/mL N-(3-dimethylaminopropyl)-N-éthylcarbodiimide hydrochlorure (EDC). Dissoudre 2 mg d'EDC dans 10 l'eau pour chaque échantillon à étiqueter et vortex bien.
   REMARQUE : La solution EDC doit être préparée le jour même de la réaction. EDC agit comme catalyseur pour la dérivation des composés à l'aniline¹².

2. Préparation des normes

1. Faire des solutions de stock séparées de tous les composés dissous dans l'eau de qualité LC/MS (tableau 1).
2. Préparation de la solution de stock standard interne
   1. Combinez tous les composés à l'exception du dinucleotide de nicotinamide adenine (NAD), de la nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP), du dinucleotide d'adénine de flavine (FAD), de la coenzyme acétyle A (ACA) et du glycérol 3-phosphate (Gly3P), avec les volumes appropriés à créer une solution de stock de 2 mM de tous les composés.
3. Combinez NAD, NADP, FAD, ACA et Gly3P avec les volumes appropriés pour créer une solution de stock de 2 mM.

3. Préparation de l'échantillon (Figure 1)

1. Étancher et précipiter les protéines dans une réaction de synthèse des protéines sans cellules en ajoutant un volume égal d'éthanol à 100% glacé à la réaction. Centrifuger l'échantillon à 12 000 x g pendant 15 min à 4 oC. Transférer le supernatant dans un nouveau tube de centrifugeuse.
   REMARQUE : Les échantillons peuvent être stockés à -80 oC à ce stade et analysés ultérieurement

4. Réaction d'étiquetage

1. Échantillon d'étiquetage avec ¹²solutions C-aniline
   1. Transférer 6 lL d'échantillon dans un nouveau tube de centrifugeuse et porter le volume à 50 l avec del'eau.
      REMARQUE : La taille de l'échantillon de volume peut dépendre de la réaction spécifique du SPFC.
   2. Ajouter une solution EDC de 5 ll de 200 mg/mL.
   3. Ajouter 5 ll de ¹²c-aniline solution.
      REMARQUE : La solution d'aniline se sépare en deux phases. Bien mélanger avant d'ajouter à la réaction.
   4. Vortex la réaction avec des secousses douces pendant 2 h à température ambiante.
   5. Après 2 h, retirer les tubes du shaker et ajouter 1,5 l de triéthylamine (TEA) à la réaction dans un capot de fumée.
      REMARQUE : La triéthylamine soulève le pH de la solution qui arrête la réaction de marquage aniline et stabilise les composés.
      CAUTION: La triéthylamine est toxique et provoque une irritation des yeux et des voies respiratoires.
   6. Centrifugeuse à 13 500 x g pendant 3 min.
2. Étiquetage des normes internes avec une solution ¹³C-aniline
   1. Diluer la solution de stock interne à 80 M avec un volume final de 50 L.
      REMARQUE : La concentration des normes internes peut être ajustée aux niveaux proches de l'échantillon expérimental.
   2. Ajouter une solution EDC de 5 ll de 200 mg/mL.
   3. Ajouter 5 ll de ¹³c-aniline solution.
   4. Vortex la réaction avec des secousses douces pendant 2 h à température ambiante.
   5. Après 2 h, retirer les tubes du shaker et ajouter 1,5 l de TEA à la réaction dans un capot de fumée.
   6. Centrifugeuse à 13 500 x g pendant 3 min.
3. Combinaison de normes internes étiquetées et d'échantillons étiquetés
   1. Mélanger 25 'L de ¹²échantillons étiquetés C-aniline avec 25 'L de ¹³C-aniline étiquetés standard.
   2. Transférer dans une fiole auto-échantillonneuse et analyser par la procédure LC/MS.
4. Création d'une courbe standard pour les métabolites non étiquetés
   1. Solution de stock diluée de métabolites non étiquetés (NAD, NADP, FAD, ACA et Gly3P) à des concentrations finales de 320 M, 80 M, 20 et 5 M avec un volume de 50 L.
   2. Ajouter une solution EDC de 5 ll de 200 mg/mL.
   3. Ajouter 5 ll de ¹²c-aniline solution.
   4. Vortex la réaction avec des secousses douces pendant 2 h à température ambiante.
   5. Après 2 h, retirer les tubes du shaker et ajouter 1,5 l de TEA à la réaction dans un capot de fumée.
   6. Centrifugeuse à 13 500 x g pendant 3 min.
   7. Transférer le supernatant sur une fiole auto-échantillonneuse et analyser par la procédure LC/MS.
      REMARQUE : Les métabolites non étiquetés suivent la même procédure que l'échantillon pour reproduire la matrice d'échantillon afin de maintenir l'efficacité similaire d'ionisation.

5. Configuration de la procédure LC/MS

1. Préparation des solvants
   1. Préparer une solution aqueuse tri-butylamine (TBA) de 5 mM ajustée au pH 4,75 avec de l'acide acétique.
      REMARQUE: TBA dans la phase mobile aide les analytes à atteindre une bonne résolution et la séparation¹⁴.
   2. Préparer 5 mM TBA en acetonitrile (ACN).
   3. Préparer le solvant de lavage avec 5% d'eau et 95% D'ACN.
   4. Préparer le solvant de purge avec 95% d'eau et 5% D'ACN.
2. Configuration des conditions de SP
   1. Régler le spectromètre de masse en mode ion négatif avec une température de sonde de 520 oC, une tension capillaire négative de -0,8 kV, une tension capillaire positive de 0,8 kV, et régler le logiciel pour acquérir des données à 5 points/s.
   2. Définir des enregistrements d'ions sélectionnés (SIR) pour chaque métabolite avec des tensions de cône spécifiées et des valeurs de masse sur charge (m/z). Voir tableau 1.
3. Initialisation de LC/MS selon les instructions du fabricant
   1. Lignes de solvant de premier ordre dans le gestionnaire de solvant pendant 3 min.
   2. Solvant de lavage de premier choix (5 % d'eau, 95 % D'ACN) et solvant de purge (95 % d'eau, 5 % D'ACN) pendant 15 s pendant 5 cycles.
   3. Définir le gestionnaire de l'échantillon à 10 oC.
   4. Installez une colonne C18 (1,7 m, 2,1 mm x 150 mm) et initialisez la colonne avec 100 % ACN à 0,3 ml/min pendant 10 min.
   5. Conditionner la colonne à 95 % d'eau et 5 % d'ACN à 0,3 ml/min pendant 10 min avant d'introduire des solvants munis de tampons.
   6. Conditionner la colonne à 95 % de solvant A (5 mM TBA aqueuse, pH 4,75) et 5 % de solvant B (5 mM TBA en ACN) à 0,3 ml/min pendant 10 min.
   7. Mettre en place un protocole de gradient avec l'élution à partir de 95% solvant A et 5% solvant B, porté à 70% solvant B en 10 min, porté à 100% solvant B en 2 min et maintenu à 100% solvant B pendant 3 min. Retour aux conditions initiales (95% solvant A , 5% solvant B) sur 1 min et maintenez pendant 9 min pour rééquilibrer la colonne.
   8. Conditionner la colonne avec le protocole de gradient 3 fois avant toute injection sur la colonne.
4. Échantillon d'injection et normes
   1. Injecter 5 ll de l'échantillon dans la colonne et acquérir les intensités ionnées m/z appropriées pour l'échantillon marqué ^{par 12}C-aniline.
   2. Injectez à nouveau 5 ll d'un même échantillon, mais cette fois-ci acquièrent les intensités ionm/z pour les ¹³normes étiquetées C-aniline.
      REMARQUE : Notre système LC/MS n'est pas en mesure d'acquérir des intensités de ¹²C et ¹³C m/z aux fenêtres de temps SIR spécifiées, car il y a trop de données à acquérir dans la fenêtre de temps spécifiée. Par conséquent, nous injectons le même échantillon deux fois.
   3. Injectez des normes de métabolites non étiquetées de la plus faible concentration à la plus élevée et enregistrez les intensités d'ion m/z appropriées.

6. Quantification

1. Création de la méthode Export
   1. Dans le logiciel d'acquisition de données, sélectionnez Fichier 'gt; Nouvelle Méthode 'gt; Méthode d'exportation.
   2. Spécifiez un nom de fichier, tel que AnilineTagging-Date.
   3. Vérifiez le fichier EXPORT ASCII et choisissez un répertoire pour exporter le fichier texte à.
   4. Dans le typede rapport , sélectionnez Résumé par tous.
   5. Dans Delimiters, pour Colonne sélectionnez un ,. Pour Row, sélectionnez [cr][si].
   6. Dans le tableau, sélectionnez Export, puis Modifier table pour inclure SampleName, Area, Hauteur, Montant et Unités.
   7. Enregistrer la méthode d'exportation.
2. Quantifier les métabolites avec des normes internes à l'aide d'un logiciel d'acquisition de données
   1. Sous l'onglet Ensembles d'échantillons, cliquez à droite sur l'exécution LC/MS correspondante et sélectionnez Afficher sous le titre de 'gt; Channels.
   2. Sélectionnez tous les canaux SIR pour les ¹³normes internes C-aniline d'une injection, clic droit et sélectionnez Examen.
   3. Si la fenêtre de mise en page de la méthode de traitement LC n'apparaît pas automatiquement, allez voir la mise en pagede la méthode de traitement .
   4. Dans Processing Method Layout, allez à l'onglet Intégration et configurez ApexTrack comme algorithme.
   5. Aller à l'onglet de lissage et définir le type à moyen et le niveau de lissage à 13.
      REMARQUE : Tout niveau de lissage peut être sélectionné, à la fois qu'il est uniforme sur tous les échantillons.
   6. Dans l'onglet MS Channel, désiblisez le traitement MS 3D .
   7. Dans la fenêtre du canal SIR, intégrer chaque pic, un canal à la fois. Une fois qu'un pic est intégré, rendez-vous sur Options et les détails du pic seront remplis dans l'onglet Composants. Changez le nom de pointe pour le nom composé correspondant.
   8. Une fois que tous les canaux SIR ont été évalués, enregistrez la méthode de traitement et fermez la fenêtre.
   9. Sélectionnez tous les canaux SIR de l'échantillon ¹³C-aniline et ¹²C-aniline étiquetés, cliquez à droite et sélectionnez Process.
   10. Cochez la case Processus, sélectionnez Utilisez la méthode de traitement spécifiéeet choisissez la méthode de traitement qui vient d'être enregistrée. Cochez également la case Export, sélectionnez Utilisez la méthode d'exportation spécifiée et choisissez la méthode d'exportation enregistrée créée plus tôt. Cliquez sur OK.
   11. Ouvrez le fichier texte exporté avec Excel et calculez la concentration du composé inconnu à l'aide de :
       
       où C_x,i est la concentration de l'échantillon inconnu pour le métabolite i, A_x,i est la zone intégrée du métabolite inconnu i, Un_std,i est la zone intégrée de la norme interne de métabolite i, C_{std, est} le concentration de la norme interne de métabolite i, et D est le facteur de dilution.
3. Quantifier les métabolites non étiquetés avec courbe standard
   1. Sous l'onglet Ensembles d'échantillons, cliquez à droite sur l'exécution LC/MS correspondante et sélectionnez Afficher sous le titre de 'gt; Channels.
   2. Sélectionnez tous les canaux SIR pour les normes non étiquetées d'une injection, clic droit et sélectionnez Examen.
   3. Si la fenêtre de mise en page de la méthode de traitement LC n'apparaît pas automatiquement, allez voir la mise en pagede la méthode de traitement .
   4. Dans La mise en page des méthodes de traitement, allez à l'onglet Intégration et configurez ApexTrack comme algorithme.
   5. Aller à l'onglet de lissage et définir le type à moyen et le niveau de lissage à 13.
      REMARQUE : Tout niveau de lissage peut être sélectionné, à la fois qu'il est uniforme sur tous les échantillons.
   6. Dans l'onglet MS Channel, désiblisez le traitement MS 3D .
   7. Dans la fenêtre du canal SIR, intégrer chaque pic, un canal à la fois. Une fois qu'un pic est intégré, rendez-vous sur Options et les détails du pic seront remplis dans l'onglet Composants. Changez le nom de pointe pour le nom composé correspondant.
   8. Une fois que tous les canaux SIR ont été évalués, enregistrez la méthode de traitement et fermez la fenêtre.
   9. Sous l'onglet Ensembles d'échantillons, cliquez à droite sur l'ensemble d'échantillons et sélectionnez L'échantillon Alter.
   10. Sélectionnez Montant dans la nouvelle fenêtre.
   11. Sélectionnez la copie de la méthode Processus et choisissez la méthode de processus qui vient d'être enregistrée.
   12. Entrez la concentration de chaque métabolite pour chaque flacon et entrez l'unité comme 'lt;M pour chaque composant (ou l'unité correspondante) et sélectionnez OK.
   13. Sélectionnez l'ensemble d'échantillons à nouveau, cliquez à droite, Afficher comme 'gt; Canaux.
   14. Sélectionnez tous les canaux SIR des métabolites non étiquetés pour les normes, cliquez à droite et sélectionnez Processus.
   15. Cochez la case Processus et choisissez La méthode de traitement spécifiée . Sélectionnez la méthode de traitement appropriée et cliquez sur OK.
   16. Sélectionnez les canaux SIR pour tous les métabolites non étiquetés pour les échantillons, cliquez à droite et sélectionnez Processus.
   17. Cochez la case Processus, sélectionnez Utilisez la méthode de traitement spécifiée et choisissez la méthode de traitement qui vient d'être enregistrée. Cochez également la case Export, sélectionnez Utilisez la méthode d'exportation spécifiée et choisissez la méthode d'exportation enregistrée créée plus tôt. Cliquez OK.
   18. Quantifier les métabolites non étiquetés avec la courbe standard et exporter les résultats vers un fichier texte vers l'annuaire spécifié.

Comme preuve de concept, nous avons utilisé le protocole pour quantifier les métabolites dans un système CFPS basé sur E. coli exprimant la protéine fluorescente verte (GFP).  La réaction du SPFC (14 L) a été éteinte et déprotéinée avec de l'éthanol. L'échantillon du SPFC a ensuite été étiqueté avec 12C-aniline, tandis que les normes ont été étiquetées avec 13C-aniline. L'échantillon et les normes étiquetés ont ensuite été combinés et injectés dans le LC/MS (figure 1). Le protocole a détecté et quantifié 40 métabolites impliqués dans le métabolisme central du carbone et de l'énergie en utilisant des normes internes, tandis qu'une courbe standard pour 5 des métabolites qui n'ont pas été étiquetés avec de l'aniline a également été développée (figure 2). Les métabolites divers impliqués dans ces voies étaient une classe des sucres phosphorylés, des acides phosphocarboxyliques, des acides carboxyliques, des nucléotides, et des cofactors. La dérivatisation avec l'aniline a introduit une moiétoy hydrophobe dans les molécules hydrophiles qui a facilité une séparation plus efficace utilisant la chromatographie de phase inversée12. En outre, la méthode a permis la séparation des paires structurales d'isomère telles que le glucose 6-phosphate et le fructose 6-phosphate dans une seule course de LC/MS. Le rapport de masse sur charge (m/z) de chaque composé et le temps de rétention ont été identifiés avant l'expérience en injectant 1 mM d'un composé à la fois et en comparant le spectre de masse au blanc (tableau 1).

La limite de détection et l'étendue de la linéarité pour tous les composés ont été estimées en produisant une courbe standard qui variait de 0,10 m à 400 M(tableau 2). Le coefficient de corrélation moyen (R2) pour tous les composés était de 0,988 et la plupart des composés avaient une plage linéaire de 3 ordres de magnitude. Trois composés ont eu des effets notables de saturation, particulièrement l'alpha-ketoglutarate qui a eu une gamme linéaire de 0.1 à 25 -M. L'isocitrate et le citrate ont également eu des effets de saturation au-dessus de 100 'M.

Figure 1 : Schéma de flux de travail pour le marquage aniline. La réaction de synthèse des protéines sans cellules est déprotéinée et étiquetée avec 12C-aniline, tandis qu'un mélange de stock standard est étiqueté avec 13C-aniline. Les deux mélanges sont ensuite mélangés à un rapport volumétrique 1:1 et analysés par LC/MS. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Chromatogrammes d'ion sélectionnés superposés pour 40 métabolites. Chromatogramme de masse à partir d'une seule course LC/MS d'un mélange standard de 40 m de 40 métabolites. Les pics ont été identifiés par leur temps de rétention et leurs valeurs m/z pour chaque composé. Les noms composés complets et leurs abréviations sont énumérés dans le tableau 1. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Tableau 1 : Résultats d'identification et d'étiquetage des métabolites. Le nombre de pointe correspondant de chaque composé, le temps de rétention, la valeur m/z pour les espèces non étiquetées, 12C et 13C, et les espèces de SP. MS Species, A signifie Aniline tag.

Tableau 2 : Quantification des métabolites dans un échantillon représentatif du SPFC. La concentration de chaque métabolite et l'écart type. Limite de détection, gamme de linéarité et coefficient de corrélation identifié à partir des courbes standard.

Les auteurs n'ont rien à révéler.