Quantification absolue du métabolisme de synthèse des protéines sans cellules par spectrométrie de chromatographie liquide à phase inversée

Résumé

Ici, nous présentons un protocole robuste pour quantifier 40 composés impliqués dans le métabolisme central de carbone et d'énergie dans les réactions de synthèse de protéine sans cellules. Le mélange de synthèse sans cellules est dérivé avec de l'aniline pour une séparation efficace à l'aide d'une chromatographie liquide en phase inversée, puis quantifié par spectrométrie de masse à l'aide de normes internes étiquetées isotopiques.

Résumé

La synthèse des protéines sans cellules (CFPS) est une technologie émergente dans les systèmes et la biologie synthétique pour la production in vitro de protéines. Toutefois, si le SCFP veut aller au-delà du laboratoire et devenir une technologie de fabrication répandue et standard juste à temps, nous devons comprendre les limites de performance de ces systèmes. Vers cette question, nous avons développé un protocole robuste pour quantifier 40 composés impliqués dans la glycolyse, la voie de phosphate de pentose, le cycle d'acide tricarboxylique, le métabolisme énergétique et la régénération de cofactor dans les réactions de CFPS. La méthode utilise des normes internes étiquetées avec ¹³C-aniline, tandis que les composés de l'échantillon sont dérivés de ¹²C-aniline. Les normes internes et l'échantillon ont été mélangés et analysés par spectrométrie de masse de chromatographie liquide de phase inversée (LC/MS). La co-élution des composés a éliminé la suppression d'ion, permettant la quantification précise des concentrations de métabolites au-dessus de 2-3 ordres de grandeur où le coefficient moyen de corrélation était 0.988. Cinq des quarante composés n'ont pas été étiquetés avec de l'aniline, cependant, ils ont été encore détectés dans l'échantillon DEPFC et quantifiés avec une méthode standard de courbe. La course chromatographique prend environ 10 minutes à compléter. Pris ensemble, nous avons mis au point une méthode rapide et robuste pour séparer et quantifier avec précision 40 composés impliqués dans le SPFC en un seul lcl/MS. La méthode est une approche complète et précise pour caractériser le métabolisme sans cellules, de sorte qu'en fin de compte, nous pouvons comprendre et améliorer le rendement, la productivité et l'efficacité énergétique des systèmes sans cellules.

Introduction

La synthèse des protéines sans cellules (CFPS) est une plate-forme prometteuse pour la fabrication de protéines et de produits chimiques, une application traditionnellement réservée aux cellules vivantes. Les systèmes sans cellules sont dérivés d'extraits de cellules brutes et éliminent les complications associées à la croissance cellulaire¹. En outre, le SCFP permet un accès direct aux métabolites et aux machines biosynthétiques sans interférence d'une paroi cellulaire. Cependant, il n'y a pas eu de compréhension fondamentale des limites de rendement des processus sans cellules. Les méthodes à haut débit pour la quantification des métabolites sont précieuses pour la caractérisation du métabolisme et sont essentielles pour la construction de modèles de calcul^{métaboliques 2,3,4}. Les méthodes courantes utilisées pour déterminer les concentrations de métabolites comprennent la résonance magnétique nucléaire (RMN), la spectroscopie à infrarouge transformateur (FT-IR) de Fourier, les essais à base d'enzymes et la spectrométrie de masse (MS)^{5,6,7 ,8}. Cependant, ces méthodes sont souvent limitées par leur incapacité à mesurer efficacement plusieurs composés à la fois et nécessitent souvent une taille d'échantillon supérieure aux réactions typiques sans cellules. Par exemple, les essais à base d'enzymes ne peuvent souvent être utilisés que pour quantifier un seul composé dans une course, et sont limités lorsque la taille de l'échantillon est petite, comme dans les réactions de synthèse des protéines sans cellules (généralement exécuté sur une échelle de 10-15 L). Pendant ce temps, la RMN exige une forte abondance de métabolites pour la détection et la quantification⁵.  À l'égard de ces lacunes, les méthodes de chromatographie en tandem avec la spectrométrie de masse (LC/MS) offrent plusieurs avantages, y compris une sensibilité élevée et la capacité de mesurer plusieurs espèces simultanément^9; cependant, la complexité analytique augmente considérablement avec le nombre et la diversité des espèces mesurées. Il est donc important de développer des méthodes qui réalisent pleinement le potentiel de haut débit des systèmes LC/MS. Les composés d'un échantillon sont séparés par chromatographie liquide et identifiés par spectrométrie de masse. Le signal du composé dépend de sa concentration et de son efficacité d'ionisation, où l'ionisation peut varier d'un composé à l'autre et peut également dépendre de la matrice de l'échantillon.

Atteindre la même efficacité d'ionisation entre l'échantillon et les normes est un défi lorsque vous utilisez LC/MS pour quantifier les analytes. En outre, la quantification devient plus difficile avec la diversité des métabolites en raison de la division du signal et de l'hétérogénéité dans l'affinité des protons et la polarité¹⁰. Enfin, la matrice de co-élutation de l'échantillon peut également affecter l'efficacité de l'ionisation des composés. Pour résoudre ces problèmes, les métabolites peuvent être dérivés chimiquement, ce qui augmente la résolution et la sensibilité de séparation par les systèmes LC/MS, tout en diminuant simultanément le fractionnement du signal dans certains cas^10,11. La dérivation chimique fonctionne en étiquetant des groupes fonctionnels spécifiques de métabolites pour ajuster leurs propriétés physiques comme la charge ou l'hydrophobicité pour augmenter l'efficacité de l'ionisation¹¹. Divers agents de marquage peuvent être utilisés pour cibler différents groupes fonctionnels (p. ex. amines, hydroxyles, phosphates, acides carboxyliques, etc.). L'aniline, l'un de ces agents de dérivation, cible plusieurs groupes fonctionnels à la fois, et ajoute un composant hydrophobe dans les molécules hydrophiles, augmentant ainsi leur résolution de séparation et le signal¹². Pour faire face à l'effet de suppression des ions de la matrice co-étui, Yang et ses collègues ont mis au point une technique basée sur l'étiquetage de la technologie standard interne spécifique au groupe (GSIST) lorsque les normes sont étiquetées avec des isotopes aniin de ¹³C et mélangées à l'échantillon. ^12,13. Le métabolite et la norme interne correspondante ont la même efficacité d'ionisation puisqu'ils co-éliment, et leur rapport d'intensité peut être utilisé pour quantifier la concentration dans l'échantillon expérimental.

Dans cette étude, nous avons développé un protocole pour détecter et quantifier 40 composés impliqués dans la glycolyse, la voie de phosphate de pentose, le cycle d'acide tricarboxylique, le métabolisme énergétique et la régénération cofactorielle dans les réactions de CFPS. La méthode est basée sur l'approche GSIST, où nous avons utilisé ¹²C-aniline et ¹³C-aniline pour étiqueter, détecter et quantifier les métabolites à l'aide de LC/MS en phase inversée. La plage linéaire de tous les composés s'étendait sur 2-3 ordres de grandeur avec un coefficient de corrélation moyen de 0,988. Ainsi, la méthode est une approche robuste et précise pour interroger le métabolisme sans cellules, et peut-être des extraits de cellules entières.

Protocole

1. Préparation des réactifs pour le marquage aniline

1. Préparer une solution d'aniline de 6 M au pH 4.5. En travaillant dans une hotte, combiner 550 l d'aniline avec 337,5 l d'eau de qualité LCMS et 112,5 l d'acide chlorhydrique (HCl) de 12 M dans un tube de centrifugeuse. Bien Vortex et conserver à 4 oC.
   REMARQUE : L'aniline peut être stockée à 4 oC pendant 2 mois.
   CAUTION: L'aniline est très toxique et doit être travaillé avec dans un capot de fumée. L'acide chlorhydrique est très corrosif
2. Préparer une solution d'aniline 6 M ¹³C au pH 4.5. Mélanger 250 mg de ¹³C₆-aniline avec 132 l d'eau et 44 oL de 12 M HCl. Vortex bien et stocker à 4 oC.
3. Préparer 200 mg/mL N-(3-dimethylaminopropyl)-N-éthylcarbodiimide hydrochlorure (EDC). Dissoudre 2 mg d'EDC dans 10 l'eau pour chaque échantillon à étiqueter et vortex bien.
   REMARQUE : La solution EDC doit être préparée le jour même de la réaction. EDC agit comme catalyseur pour la dérivation des composés à l'aniline¹².

2. Préparation des normes

1. Faire des solutions de stock séparées de tous les composés dissous dans l'eau de qualité LC/MS (tableau 1).
2. Préparation de la solution de stock standard interne
   1. Combinez tous les composés à l'exception du dinucleotide de nicotinamide adenine (NAD), de la nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP), du dinucleotide d'adénine de flavine (FAD), de la coenzyme acétyle A (ACA) et du glycérol 3-phosphate (Gly3P), avec les volumes appropriés à créer une solution de stock de 2 mM de tous les composés.
3. Combinez NAD, NADP, FAD, ACA et Gly3P avec les volumes appropriés pour créer une solution de stock de 2 mM.

3. Préparation de l'échantillon (Figure 1)

1. Étancher et précipiter les protéines dans une réaction de synthèse des protéines sans cellules en ajoutant un volume égal d'éthanol à 100% glacé à la réaction. Centrifuger l'échantillon à 12 000 x g pendant 15 min à 4 oC. Transférer le supernatant dans un nouveau tube de centrifugeuse.
   REMARQUE : Les échantillons peuvent être stockés à -80 oC à ce stade et analysés ultérieurement

4. Réaction d'étiquetage

1. Échantillon d'étiquetage avec ¹²solutions C-aniline
   1. Transférer 6 lL d'échantillon dans un nouveau tube de centrifugeuse et porter le volume à 50 l avec del'eau.
      REMARQUE : La taille de l'échantillon de volume peut dépendre de la réaction spécifique du SPFC.
   2. Ajouter une solution EDC de 5 ll de 200 mg/mL.
   3. Ajouter 5 ll de ¹²c-aniline solution.
      REMARQUE : La solution d'aniline se sépare en deux phases. Bien mélanger avant d'ajouter à la réaction.
   4. Vortex la réaction avec des secousses douces pendant 2 h à température ambiante.
   5. Après 2 h, retirer les tubes du shaker et ajouter 1,5 l de triéthylamine (TEA) à la réaction dans un capot de fumée.
      REMARQUE : La triéthylamine soulève le pH de la solution qui arrête la réaction de marquage aniline et stabilise les composés.
      CAUTION: La triéthylamine est toxique et provoque une irritation des yeux et des voies respiratoires.
   6. Centrifugeuse à 13 500 x g pendant 3 min.
2. Étiquetage des normes internes avec une solution ¹³C-aniline
   1. Diluer la solution de stock interne à 80 M avec un volume final de 50 L.
      REMARQUE : La concentration des normes internes peut être ajustée aux niveaux proches de l'échantillon expérimental.
   2. Ajouter une solution EDC de 5 ll de 200 mg/mL.
   3. Ajouter 5 ll de ¹³c-aniline solution.
   4. Vortex la réaction avec des secousses douces pendant 2 h à température ambiante.
   5. Après 2 h, retirer les tubes du shaker et ajouter 1,5 l de TEA à la réaction dans un capot de fumée.
   6. Centrifugeuse à 13 500 x g pendant 3 min.
3. Combinaison de normes internes étiquetées et d'échantillons étiquetés
   1. Mélanger 25 'L de ¹²échantillons étiquetés C-aniline avec 25 'L de ¹³C-aniline étiquetés standard.
   2. Transférer dans une fiole auto-échantillonneuse et analyser par la procédure LC/MS.
4. Création d'une courbe standard pour les métabolites non étiquetés
   1. Solution de stock diluée de métabolites non étiquetés (NAD, NADP, FAD, ACA et Gly3P) à des concentrations finales de 320 M, 80 M, 20 et 5 M avec un volume de 50 L.
   2. Ajouter une solution EDC de 5 ll de 200 mg/mL.
   3. Ajouter 5 ll de ¹²c-aniline solution.
   4. Vortex la réaction avec des secousses douces pendant 2 h à température ambiante.
   5. Après 2 h, retirer les tubes du shaker et ajouter 1,5 l de TEA à la réaction dans un capot de fumée.
   6. Centrifugeuse à 13 500 x g pendant 3 min.
   7. Transférer le supernatant sur une fiole auto-échantillonneuse et analyser par la procédure LC/MS.
      REMARQUE : Les métabolites non étiquetés suivent la même procédure que l'échantillon pour reproduire la matrice d'échantillon afin de maintenir l'efficacité similaire d'ionisation.

5. Configuration de la procédure LC/MS

1. Préparation des solvants
   1. Préparer une solution aqueuse tri-butylamine (TBA) de 5 mM ajustée au pH 4,75 avec de l'acide acétique.
      REMARQUE: TBA dans la phase mobile aide les analytes à atteindre une bonne résolution et la séparation¹⁴.
   2. Préparer 5 mM TBA en acetonitrile (ACN).
   3. Préparer le solvant de lavage avec 5% d'eau et 95% D'ACN.
   4. Préparer le solvant de purge avec 95% d'eau et 5% D'ACN.
2. Configuration des conditions de SP
   1. Régler le spectromètre de masse en mode ion négatif avec une température de sonde de 520 oC, une tension capillaire négative de -0,8 kV, une tension capillaire positive de 0,8 kV, et régler le logiciel pour acquérir des données à 5 points/s.
   2. Définir des enregistrements d'ions sélectionnés (SIR) pour chaque métabolite avec des tensions de cône spécifiées et des valeurs de masse sur charge (m/z). Voir tableau 1.
3. Initialisation de LC/MS selon les instructions du fabricant
   1. Lignes de solvant de premier ordre dans le gestionnaire de solvant pendant 3 min.
   2. Solvant de lavage de premier choix (5 % d'eau, 95 % D'ACN) et solvant de purge (95 % d'eau, 5 % D'ACN) pendant 15 s pendant 5 cycles.
   3. Définir le gestionnaire de l'échantillon à 10 oC.
   4. Installez une colonne C18 (1,7 m, 2,1 mm x 150 mm) et initialisez la colonne avec 100 % ACN à 0,3 ml/min pendant 10 min.
   5. Conditionner la colonne à 95 % d'eau et 5 % d'ACN à 0,3 ml/min pendant 10 min avant d'introduire des solvants munis de tampons.
   6. Conditionner la colonne à 95 % de solvant A (5 mM TBA aqueuse, pH 4,75) et 5 % de solvant B (5 mM TBA en ACN) à 0,3 ml/min pendant 10 min.
   7. Mettre en place un protocole de gradient avec l'élution à partir de 95% solvant A et 5% solvant B, porté à 70% solvant B en 10 min, porté à 100% solvant B en 2 min et maintenu à 100% solvant B pendant 3 min. Retour aux conditions initiales (95% solvant A , 5% solvant B) sur 1 min et maintenez pendant 9 min pour rééquilibrer la colonne.
   8. Conditionner la colonne avec le protocole de gradient 3 fois avant toute injection sur la colonne.
4. Échantillon d'injection et normes
   1. Injecter 5 ll de l'échantillon dans la colonne et acquérir les intensités ionnées m/z appropriées pour l'échantillon marqué ^{par 12}C-aniline.
   2. Injectez à nouveau 5 ll d'un même échantillon, mais cette fois-ci acquièrent les intensités ionm/z pour les ¹³normes étiquetées C-aniline.
      REMARQUE : Notre système LC/MS n'est pas en mesure d'acquérir des intensités de ¹²C et ¹³C m/z aux fenêtres de temps SIR spécifiées, car il y a trop de données à acquérir dans la fenêtre de temps spécifiée. Par conséquent, nous injectons le même échantillon deux fois.
   3. Injectez des normes de métabolites non étiquetées de la plus faible concentration à la plus élevée et enregistrez les intensités d'ion m/z appropriées.

6. Quantification

1. Création de la méthode Export
   1. Dans le logiciel d'acquisition de données, sélectionnez Fichier 'gt; Nouvelle Méthode 'gt; Méthode d'exportation.
   2. Spécifiez un nom de fichier, tel que AnilineTagging-Date.
   3. Vérifiez le fichier EXPORT ASCII et choisissez un répertoire pour exporter le fichier texte à.
   4. Dans le typede rapport , sélectionnez Résumé par tous.
   5. Dans Delimiters, pour Colonne sélectionnez un ,. Pour Row, sélectionnez [cr][si].
   6. Dans le tableau, sélectionnez Export, puis Modifier table pour inclure SampleName, Area, Hauteur, Montant et Unités.
   7. Enregistrer la méthode d'exportation.
2. Quantifier les métabolites avec des normes internes à l'aide d'un logiciel d'acquisition de données
   1. Sous l'onglet Ensembles d'échantillons, cliquez à droite sur l'exécution LC/MS correspondante et sélectionnez Afficher sous le titre de 'gt; Channels.
   2. Sélectionnez tous les canaux SIR pour les ¹³normes internes C-aniline d'une injection, clic droit et sélectionnez Examen.
   3. Si la fenêtre de mise en page de la méthode de traitement LC n'apparaît pas automatiquement, allez voir la mise en pagede la méthode de traitement .
   4. Dans Processing Method Layout, allez à l'onglet Intégration et configurez ApexTrack comme algorithme.
   5. Aller à l'onglet de lissage et définir le type à moyen et le niveau de lissage à 13.
      REMARQUE : Tout niveau de lissage peut être sélectionné, à la fois qu'il est uniforme sur tous les échantillons.
   6. Dans l'onglet MS Channel, désiblisez le traitement MS 3D .
   7. Dans la fenêtre du canal SIR, intégrer chaque pic, un canal à la fois. Une fois qu'un pic est intégré, rendez-vous sur Options et les détails du pic seront remplis dans l'onglet Composants. Changez le nom de pointe pour le nom composé correspondant.
   8. Une fois que tous les canaux SIR ont été évalués, enregistrez la méthode de traitement et fermez la fenêtre.
   9. Sélectionnez tous les canaux SIR de l'échantillon ¹³C-aniline et ¹²C-aniline étiquetés, cliquez à droite et sélectionnez Process.
   10. Cochez la case Processus, sélectionnez Utilisez la méthode de traitement spécifiéeet choisissez la méthode de traitement qui vient d'être enregistrée. Cochez également la case Export, sélectionnez Utilisez la méthode d'exportation spécifiée et choisissez la méthode d'exportation enregistrée créée plus tôt. Cliquez sur OK.
   11. Ouvrez le fichier texte exporté avec Excel et calculez la concentration du composé inconnu à l'aide de :
       
       où C_x,i est la concentration de l'échantillon inconnu pour le métabolite i, A_x,i est la zone intégrée du métabolite inconnu i, Un_std,i est la zone intégrée de la norme interne de métabolite i, C_{std, est} le concentration de la norme interne de métabolite i, et D est le facteur de dilution.
3. Quantifier les métabolites non étiquetés avec courbe standard
   1. Sous l'onglet Ensembles d'échantillons, cliquez à droite sur l'exécution LC/MS correspondante et sélectionnez Afficher sous le titre de 'gt; Channels.
   2. Sélectionnez tous les canaux SIR pour les normes non étiquetées d'une injection, clic droit et sélectionnez Examen.
   3. Si la fenêtre de mise en page de la méthode de traitement LC n'apparaît pas automatiquement, allez voir la mise en pagede la méthode de traitement .
   4. Dans La mise en page des méthodes de traitement, allez à l'onglet Intégration et configurez ApexTrack comme algorithme.
   5. Aller à l'onglet de lissage et définir le type à moyen et le niveau de lissage à 13.
      REMARQUE : Tout niveau de lissage peut être sélectionné, à la fois qu'il est uniforme sur tous les échantillons.
   6. Dans l'onglet MS Channel, désiblisez le traitement MS 3D .
   7. Dans la fenêtre du canal SIR, intégrer chaque pic, un canal à la fois. Une fois qu'un pic est intégré, rendez-vous sur Options et les détails du pic seront remplis dans l'onglet Composants. Changez le nom de pointe pour le nom composé correspondant.
   8. Une fois que tous les canaux SIR ont été évalués, enregistrez la méthode de traitement et fermez la fenêtre.
   9. Sous l'onglet Ensembles d'échantillons, cliquez à droite sur l'ensemble d'échantillons et sélectionnez L'échantillon Alter.
   10. Sélectionnez Montant dans la nouvelle fenêtre.
   11. Sélectionnez la copie de la méthode Processus et choisissez la méthode de processus qui vient d'être enregistrée.
   12. Entrez la concentration de chaque métabolite pour chaque flacon et entrez l'unité comme 'lt;M pour chaque composant (ou l'unité correspondante) et sélectionnez OK.
   13. Sélectionnez l'ensemble d'échantillons à nouveau, cliquez à droite, Afficher comme 'gt; Canaux.
   14. Sélectionnez tous les canaux SIR des métabolites non étiquetés pour les normes, cliquez à droite et sélectionnez Processus.
   15. Cochez la case Processus et choisissez La méthode de traitement spécifiée . Sélectionnez la méthode de traitement appropriée et cliquez sur OK.
   16. Sélectionnez les canaux SIR pour tous les métabolites non étiquetés pour les échantillons, cliquez à droite et sélectionnez Processus.
   17. Cochez la case Processus, sélectionnez Utilisez la méthode de traitement spécifiée et choisissez la méthode de traitement qui vient d'être enregistrée. Cochez également la case Export, sélectionnez Utilisez la méthode d'exportation spécifiée et choisissez la méthode d'exportation enregistrée créée plus tôt. Cliquez OK.
   18. Quantifier les métabolites non étiquetés avec la courbe standard et exporter les résultats vers un fichier texte vers l'annuaire spécifié.

Résultats

Comme preuve de concept, nous avons utilisé le protocole pour quantifier les métabolites dans un système CFPS basé sur E. coli exprimant la protéine fluorescente verte (GFP).  La réaction du SPFC (14 L) a été éteinte et déprotéinée avec de l'éthanol. L'échantillon du SPFC a ensuite été étiqueté avec ¹²C-aniline, tandis que les normes ont été étiquetées avec ¹³C-aniline. L'échantillon et les normes étiquetés ont ensuite été combinés et injectés dans le LC/MS (figure 1

Discussion

Les systèmes sans cellules n'ont pas de paroi cellulaire, il y a donc un accès direct aux métabolites et aux machines biosynthétiques sans avoir besoin d'une préparation complexe de l'échantillon. Cependant, très peu de travail a été fait pour développer des protocoles complets et robustes pour interroger quantitativement les systèmes de réaction sans cellules. Dans cette étude, nous avons développé une méthode rapide et robuste pour quantifier les métabolites dans les mélanges de réaction sans cellules et potentiellemen...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Aniline 12C	Sigma-Aldrich	242284	Aniline 12C Aniline
13C Aniline		485797	Aniline 13C6
Acide 3-phosphoglycérique	Sigma-Aldrich	P8877	3PG
Acide acétique	FisherScientific	AC222140010	ACE
Acetonitrile, LCMS	JT BAKER	9829-03	ACN
Acétyl-coenzyme A	Sigma-Aldrich	A2056	ACA
Acquity UPLC BEH C18 1.7 &mu ; M, 2,1 x 150 mm Colonne	Eaux	186002353	Colonne
Adénosine diphosphate	Sigma-Aldrich	A2754	ADP
Adénosine monophosphate	Sigma-Aldrich	A1752	AMP
Adénosine triphosphate	Sigma-Aldrich	A2383	ATP
Alpha-cétoglutarate	Sigma-Aldrich	K1128	aKG
Citrate	Sigma-Aldrich	251275	CIT
Cytidine diphosphate	Sigma-Aldrich	C9755	CDP
Cytidine monophosphate	Sigma-Aldrich	C1006	CMP
Cytidine triphosphate	Sigma-Aldrich	C9274	CTP
D-glycéraldéhyde 3-phosphate	Sigma-Aldrich	39705	GAP
Érythrose 4-phosphate	Sigma-Aldrich	E0377	E4P
Éthanol	Sigma-Aldrich	EX0276	EtOH
Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifugeuse	FisherScientific
Flavin adénine dinucléotide	Sigma-Aldrich	F6625	FAD
Fructose 1,6-bisphosphate	Sigma-Aldrich	F6803	F16P
Fructose 6-phosphate	Sigma-Aldrich	F3627	F6P
	Fumarate Sigma-Aldrich	F8509	FUM
Gluconate 6-phosphate	Sigma-Aldrich	P7877	6PG
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	GLC
Glucose 6-phosphate	Sigma-Aldrich	G7879	G6P
Glycérol 3-phosphate	Sigma-Aldrich	G7886	Gly3P
Guanosine diphosphate	Sigma-Aldrich	G7127	GDP
Guanosine monophosphate	Sigma-Aldrich	G8377	GMP
Guanosine triphosphate	Sigma-Aldrich	G8877	GTP
Acide chlorhydrique	Sigma-Aldrich	258148	HCl
Isocitrate	Sigma-Aldrich	I1252	ICIT
Lactate	Sigma-Aldrich	L1750	LAC
Malate	Sigma-Aldrich	02288	MAL
myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit	ArborBiosciences	507024	Synthèse acellulaire des protéines
N-(3-diméthylaminopropyl)-N&prime ;-chlorhydrate d’éthylcarbodiimide	Sigma-Aldrich	03449	EDC
Nicotinamide adénine dinucléotide	Sigma-Aldrich	43410	NAD
Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate	Sigma-Aldrich	N5755	NADP
Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate réduit	Sigma-Aldrich	481973	NADPH
Nicotinamide adénine dinucléotide réduit	Sigma-Aldrich	N8129	NADH
Oxalacétate	Sigma-Aldrich	O4126	OAA
Phosphoénolpyruvate	Sigma-Aldrich	P0564	PEP
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280	PYR
Ribose 5-phosphate	Sigma-Aldrich	R7750	R5P
Ribulose 5-phosphate	CarboSynth	MR45852	RL5P
Sedoheptulose 7-phosphate	CarboSynth	MS07457	S7P
Succinate	Sigma-Aldrich	S3674	SUCC
Tributylamine	Sigma-Aldrich	90780	TBA
Triéthylamine	FisherScientific	O4884	TEA
eau ultrapure	FisherScientific	10977-015
eau Uridine diphosphate	Sigma-Aldrich	U4125	UDP
Uridine monophosphate	Sigma-Aldrich	U6375	UMP
Uridine triphosphate	Sigma-Aldrich	U6625	UTP
VWR Heavy Duty Vortex VWR			Vortex
Water, LCMS	JT BAKER	9831-03	EAU
Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager	Waters		LCMS
Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN	Waters		LCMS
Waters Acquity Détecteur Qda	Waters LCMS
Waters Empower 3	Waters		Software
Waters LCMS Total Recovery Vial	Waters	186000384c	LCMS Vial