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Article de méthode

Les cultures organoïdes de la prostate comme outils pour traduire les génotypes et les profils mutationnels en réponses pharmacologiques

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DOI :

10.3791/60346

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24 octobre 2019

 ,  ,  , 
1Human Oncology and Pathogenesis Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Howard Hughes Medical Institute

Dans cet article

Résumé

Présenté ici est un protocole pour étudier des réponses pharmacologiques dans les organoïdes épithélial de prostate. Les organoïdes ressemblent beaucoup à la biologie in vivo et récapitulent la génétique des patients, ce qui en fait des systèmes modèles attrayants. Les organoïdes de prostate peuvent être établis à partir des prostates sauvages de type, des modèles génétiquement modifiés de souris, du tissu humain bénin, et du cancer de la prostate avancé.

Résumé

Présenté ici est un protocole pour étudier la pharmacodynamique, le potentiel de cellules souches, et la différenciation de cancer dans les organoïdes épithélial de prostate. Les organoïdes de prostate sont des cultures réactives d'androgène, tridimensionnelles (3D) cultivées dans un milieu défini qui ressemble à l'épithélium prostatique. Les organoïdes de prostate peuvent être établis à partir des modèles sauvages-type et génétiquement modifiés de souris, du tissu humain bénin, et du cancer de la prostate avancé. Fait important, les organoïdes dérivés du patient ressemblent étroitement aux tumeurs en génétique et en biologie tumorale in vivo. En outre, les organoïdes peuvent être manipulés génétiquement à l'aide de systèmes CRISPR/Cas9 et shRNA. Ces génétiques contrôlées rendent la culture organoïde attrayante en tant que plate-forme pour tester rapidement les effets des génotypes et des profils mutationnels sur les réponses pharmacologiques. Cependant, les protocoles expérimentaux doivent être spécifiquement adaptés à la nature 3D des cultures organoïdes pour obtenir des résultats reproductibles. Décrits ici sont des protocoles détaillés pour effectuer des essais d'ensemencement pour déterminer la capacité de formation d'organoïdes. Par la suite, ce rapport montre comment effectuer des traitements médicamenteux et analyser la réponse pharmacologique par des mesures de viabilité, l'isolement des protéines et l'isolement de l'ARN. Enfin, le protocole décrit comment préparer des organoïdes pour le xénogreffe et les essais de croissance in vivo subséquents utilisant la greffe sous-cutanée. Ces protocoles produisent des données hautement reproductibles et sont largement applicables aux systèmes de culture 3D.

Introduction

La résistance aux médicaments est l'un des principaux problèmes cliniques dans le traitement du cancer. Le traitement du cancer de la prostate métastatique (PCa) est principalement dirigé vers l'axe de signalisation des androgènes. Les thérapies antiandrogènes de prochaine génération (par exemple, enzalutamide et abiraterone) ont montré le grand succès clinique, mais pratiquement tous les PCa progressent par-même vers un état androgène-indépendant, ou cancer de la prostate résistant à la castration (CRPC).

Le profilage génomique et transcriptomique récent du CRPC a indiqué qu'il y a trois mécanismes généraux de résistance dans le cancer de la prostate : 1) activant des mutations ayant pour résultat la restauration du récepteur d'androgène (AR) signalant1; 2) activation de la signalisation de pontage, comme illustré dans un modèle préclinique pour la résistance de thérapie anti-androgène de prochaine génération dans laquelle l'activation du récepteur de glucocorticoid (GR) peut compenser la perte de signalisation d'AR2; et 3) le processus récemment identifié de plasticité de lignée, dans lequel les cellules de tumeur acquièrent la résistance en changeant des lignées d'un type de cellule dépendant de la cible de drogue à un autre type de cellule qui n'est pas dépendant de ceci (qui, dans PCa, est représenté en tant que AR-négatif et/ou maladie neuroendocrine [NEPC])3,4. Cependant, les mécanismes moléculaires qui causent la résistance aux médicaments ne sont pas compris. En outre, la résistance anti-androgène acquise peut mener aux vulnérabilités thérapeutiques qui peuvent être exploitées. Par conséquent, il est essentiel d'évaluer les réponses des médicaments dans les systèmes modèles qui imitent les phénotypes et les génotypes des patients.

Les organoïdes de la prostate sont des cultures organotypiques cultivées dans une matrice de protéines 3D avec un milieu défini. Fait important, les organoïdes de la prostate peuvent être établis à partir de tissus bénins et cancéreux d'origine murine ou humaine, et ils conservent des caractéristiques phénotypiques et génotypiques trouvées in vivo5,6. Fait important, les cellules sensibles aux anti-androgènes PCa et CRPC sont représentées dans le recueil actuel des organoïdes. En outre, les organoïdes de prostate sont facilement génétiquement manipulés utilisant CRISPR/Cas9 et shRNA5. Ainsi, les organoïdes de prostate sont un système modèle approprié pour tester des réponses de drogue et élucider des mécanismes de résistance. Ici, un protocole détaillé est décrit pour effectuer des essais de drogue et analyser des réponses pharmacologiques utilisant des organoïdes de prostate.

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Protocole

Tous les travaux décrits dans ce protocole ont été exécutés avec des organoïdes murines précédemment établis et des organoïdes patient-dérivés. Tous les travaux sur les animaux ont été effectués conformément aux lignes directrices du Research Animal Resource Center of Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IACUC: 06-07-012). Tous les tissus dérivés du patient ont été recueillis conformément aux règles et règlements du Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IRB : 12001).

1. Préparation moyenne et tampon

  1. Décongeler la matrice de membrane du sous-sol (p. ex. Matrigel) à 4 oC pendant la nuit avant de commencer l'expérience. Gardez-le sur la glace pendant l'utilisation.
  2. Placer les plaques de culture à 37 oC pendant 24 h avant les expériences. Cela aidera le dôme de matrice de membrane de sous-sol (ci-après désigné sous le nom de dôme de matrice) pour polymériser. Les organoïdes de placage sont décrits à l'étape 2.1.2.
  3. Préparer le milieu organoïde selon le protocole établi5.
  4. Préparer le milieu organoïde sans l'ajout du facteur de croissance épidermique (EGF; voir Tableau des matériaux pour les composants). EGF supprime la sortie transcriptionnelle AR et confère une résistance anti-androgène5.
  5. Préparer le milieu d'aigle modifié (DMEM) de Dulbecco avec 10 % de sérum bovin fœtal (SGF).
    REMARQUE: Ce support est utilisé pour inhiber la digestion enzymatique avec le remplacement de la trypsine dans les sections 2-4.
  6. Préparer des solutions médicamenteuses selon le protocole du fabricant. Pour l'enzalutamide/mdv3100 (ci-après appelé anti-androgène de deuxième génération), préparez une solution de stock de 100 M en sulfoxide de diméthyle (DMSO). Le stock peut être stocké à -20 oC pendant jusqu'à 6 mois et n'a pas besoin d'être frais.

2. Isolement, digestion enzymatique, et établissement des organoïdes

  1. Isoler les organoïdes de la prostate de la souris ou des tissus humains selon les protocoles précédemment établis5,7. Une brève description est fournie ci-dessous.
    1. Mince et enzymatiquement digérer le tissu de la prostate pour produire une suspension à cellule unique. Dans cette expérience, 1 mL de 5 mg/mL de collagène de type II dans ADMEM/F12 a été utilisé pour la digestion de 50 mg de tissu prostatique.
    2. Recueillir les cellules par centrifugation à 300 x g pendant 5 min, compter les cellules, les resuspendre dans la matrice membranaire du sous-sol, et la plaque à la densité appropriée5,7 dans les dômes de matrice sur les plaques de culture organoïde pré-chauffées (plaquage est indiquée dans la figure 1A).
    3. Laisser les dômes se solidifier et ajouter des supports sur le dessus des dômes afin qu'ils soient complètement recouverts.
  2. Cultivez des organoïdes à la quantité désirée pour les applications en aval. Le nombre de cellules peut être déterminé par des méthodes de comptage standard. Consultez la section spécifique à l'application du protocole pour plus de détails sur la densité.
  3. À l'aide d'une pipette P1000, dessiner le médium et la pipette de haut en bas pour perturber. Lorsque la matrice de membrane du sous-sol est complètement perturbée, transférer la suspension à un tube conique de 15 ml. Ne placez pas plus de 10 dômes par tube conique unique de 15 ml. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min.
  4. Retirer le supernatant et laver la pastille cellulaire avec 5 ml de PBS. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min.
  5. Retirer le supernatant et resuspendre la pastille dans 4 ml de remplacement de trypsine. Digérer de 5 à 10 min en secouant à 37 oC. Ajouter un volume égal de milieu organoïde - 10% FBS pour inhiber le remplacement de la trypsine. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min.
  6. Retirer le supernatant et le suspendre dans 1 ml de PBS.
  7. Filtrer la suspension à l'air d'un filtre de 40 m pour assurer une suspension à cellule unique. Quantifier le numéro de cellule à l'aide d'un hémocytomètre ou d'un dispositif de comptage équivalent.
    REMARQUE : Si l'obtention de cellules individuelles viables est difficile, utilisez le tri du débit pour obtenir une solution cellulaire unique.

3. Évaluer la capacité de formation des organoïdes

REMARQUE : Pour déterminer le pourcentage de cellules qui peuvent générer un organoïde, un analyse d'ensemencement peut être effectué comme un proxy pour le potentiel de tige/progéniteur. La capacité de formation d'organoïdes est également importante pour définir un nombre d'ensemencement de cellules pour les essais de viabilité.

  1. Diluer la suspension cellulaire obtenue à l'étape 2,7 à 100 cellules par 10 L de la suspension à l'aide du milieu organoïde contenant 10 'M Rho kinase inhibiteur Y-27632.
  2. Transférer 1 100 cellules (110 l de suspension) dans un nouveau tube conique.
  3. Ajouter 285 l de matrice de membrane de sous-sol et resuspendre les cellules. Cela se traduira par une concentration de matrice de 70 %.
    REMARQUE : La dilution de la matrice de membrane de sous-sol pendant l'ensemencement réduit considérablement la variation de la taille du dôme, causée par la viscosité de la matrice protéique.
  4. Cellules de graines dans 35 l de dômes de matrice dans une plaque de puits préréchauffée de 24, résultant en 200 cellules/puits. La plaque 3-5 se reproduit par échantillon (voir également la méthode de placage à la figure 1A et à l'étape 2.1.2).
  5. Pour s'assurer que les cellules restent dans le dôme de matrice, retournez la plaque et placez-la dans un incubateur de cellules pour solidifier la matrice de membrane de sous-sol.
  6. Après 10 min, retirer la plaque de l'incubateur et ajouter le milieu contenant l'inhibiteur de la kinase Rho.
  7. Rafraîchir le milieu tous les 2 jours. Après 7 jours, quantifier le nombre d'organoïdes. Gardez l'inhibiteur de la kinase Rho dans les médias tout au long de l'expérience.
  8. Comptez le nombre d'organoïdes établis par dôme et calculez le pourcentage d'organoïdes formés sur le nombre total de cellules plaquées (200 cellules).
    REMARQUE : Les ratios d'établissement organoïde varient de 3 % à 60 % selon le type de cellule et le génotype.

4. Détermination des réponses pharmacologiques des organoïdes

  1. Poursuivant à partir de l'étape 2.7, graines 1.000-10.000 cellules dans un dôme de matrice. Utilisez l'efficacité de formation des organoïdes et la vitesse de croissance comme un proxy pour déterminer le nombre final de la cellule.
    REMARQUE : Les numéros de cellulaire recommandés sont fournis dans le tableau 1. Utilisez trois à cinq répliques par condition par analyse. Utilisez une concentration finale de 70% de matrice de membrane de sous-sol pour réduire les erreurs de tuyauterie induites par la viscosité.
  2. Graine 35 'L de dômes de matrice dans une plaque de 24 puits et laisser les dômes se solidifier comme fait dans la section 3 (voir également la méthode de placage dans la figure 1A et l'étape 2.1.2). Ajouter le milieu contenant l'inhibiteur de la kinase Rho et le médicament de choix. Cette méthode peut être appliquée à tous les médicaments, mais dans ce protocole, un anti-androgène de deuxième génération est utilisé à 10 M pour un exemple. Pour déterminer la demi-concentration inhibitrice maximale (IC50), effectuer un journal10 incrémental, et comme un contrôle, utiliser le véhicule dans lequel le médicament a été dissous.
  3. Rafraîchissez le milieu tous les deux ou trois jours et analysez les organoïdes le jour 7 pour déterminer la réponse pharmacologique du médicament. Les critères temporels peuvent varier entre le choix de l'expérience et de la drogue.
    REMARQUE : Les organoïdes n'ont pas besoin d'être trypsinisés pour effectuer ces essais.
  4. Pour garder les organoïdes intacts, à l'aide d'une pipette P1000, dessinez le médium et la pipette de haut en bas pour perturber la matrice de membrane du sous-sol.
  5. Lorsque la matrice de membrane du sous-sol est complètement perturbée, transférer la suspension à un tube conique de 15 ml. Ne transférez pas plus de 10 dômes matriciels par tube conique de 15 ml.
  6. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min. Tirer le supernatant et laver avec 5 ml de PBS.
  7. Resuspendre les organoïdes dans 1 ml de PBS et perturber les organoïdes à l'aide de trituration et d'une pipette Pasteur en verre.
  8. Quantifier le nombre de fragments d'organoïdes. Les graines 5 se reproduisent contenant 100 fragments d'organoïdes tels que décrits à l'étape 2.1.2.
  9. Effectuer l'exemple de viabilité cellulaire tel que décrit ci-dessous à la section 7.

5. Isolement d'ARN des organoïdes

REMARQUE : Les méthodes à base de colonnes disponibles dans le commerce donnent une bonne quantité et une bonne qualité d'ARN. Pour assurer une bonne quantité d'ARN, utilisez un minimum d'un dôme par échantillon; cependant, l'utilisation de trois dômes est recommandée, qui peut être ensemencée dans un seul puits d'une plaque de 12 puits.

  1. Ajouter le mercaptoéthanol (1 %) au tampon de lyse de glutathion dans le kit d'isolement d'ARN.
  2. Retirez le milieu des dômes de membrane du sous-sol contenant des organoïdes et ajoutez 750 l de ce tampon. Pipette de haut en bas à l'aide d'une pipette P1000. Vérifiez que toute la matrice de membrane du sous-sol a été dissoute.
  3. Ajouter 750 l d'éthanol à 70 % et mélanger par pipetting. Transférer par la suite 700 l du mélange à la colonne, centrifugeuse à 12 000 x g pendant 1 min, et répéter avec le reste du lysate.
  4. Effectuer les lavages et le traitement DNase sur colonne selon les instructions du fabricant. L'ARN d'Elute dans 30-50 'L d'eau RNAse-free.
  5. Mesurer les concentrations à l'aide d'un fluoromètre à l'OD à 260 nm et 280 nm et entreposer à -80 oC ou continuer avec des applications en aval.

6. Isolement des protéines des organoïdes

REMARQUE : Pour l'isolement des protéines, préparez un tampon RIPA standard contenant des inhibiteurs de la phosphatase et de la protéase (Tableau des matériaux). L'utilisation d'au moins trois dômes est recommandée, qui peut être ensemencée dans un seul puits 12.

  1. À l'aide d'une pipette P1000, dessinez le milieu de la cellule avec les dômes de membrane du sous-sol contenant des organoïdes et des pipettes de haut en bas pour perturber la matrice de membrane du sous-sol.
  2. Lorsqu'elle est complètement perturbée, transférer la suspension dans un tube conique de 15 ml. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min.
  3. Retirer le supernatant et laver avec 5 ml de PBS glacé. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min.
  4. Retirer le supernatant et resuspendre la pastille dans 4 ml de remplacement de trypsine. Digdion de 5 à 10 min en secouant à 37 oC.
  5. Ajouter un volume égal de milieu organoïde - 10% FCS pour inhiber le remplacement de la trypsine. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min.
    REMARQUE : Après centrifugation, aucune matrice de membrane de sous-sol ne devrait être visible dans la pastille.
  6. Retirer le supernatant et laver avec 5 ml de PBS glacé. Retirez le supernatant et suspendez la pastille cellulaire dans un tampon de lyse de 300 l à l'aide d'un tuyauphe P1000, puis transférez-le dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml.
  7. Incuber sur la glace pendant 10 min et ensuite sonicate 2x pour 30 s chacun à l'eau refroidie avec une température de 4 oC. Placez le tube sur la glace et effectuez la quantification des protéines en utilisant des méthodes standard.
  8. Dénaturer la protéine en ajoutant du sulfate de dodécyl de sodium (SDS) contenant du colorant de chargement et faire bouillir pendant 5 min à 95 oC. Conserver les lysates à -80 oC ou continuer avec des applications en aval.

7. L'assoucande de viabilité cellulaire avec des organoïdes

REMARQUE : La viabilité des cellules peut être évaluée à l'aide du kit d'analyse de viabilité cellulaire disponible dans le commerce et d'un lubraméricain. Préparer les tampons selon les instructions du fabricant. Cinq répliques par condition sont recommandées : une réplique composée d'un dôme de matrice de membrane de membrane de sous-sol de 35 l l dans un puits d'une plaque de 24 puits.

  1. Retirez le milieu de la culture organoïde, en prenant soin de laisser les dômes de matrice intacts.
  2. Ajouter 65 L de PBS et pipette de haut en bas pour perturber le dôme de matrice.
  3. Ajouter 100 L du tampon du kit d'assay de viabilité de la cellule et le suspendre à nouveau par pipetting.
  4. Incuber à température ambiante (RT) pendant 10 min en secouant.
  5. Transférer 100 l de mélange sur une plaque non translucide adaptée au luminomètre et effectuer la lecture selon les instructions du fabricant pour le kit d'évaluation de la viabilité de la cellule.

8. Préparation d'organoïdes pour le xénogreffe

REMARQUE : Les organoïdes sont également propices à la greffe sous-cutanée chez les deux animaux immunodéprimés, ainsi que chez les souris isogéniques. Pour s'assurer que les organoïdes injectés se distinguent in vivo, étiquetez les organoïdes avec un fluorophore constitutivement exprimant5. Il est recommandé d'effectuer une expérience pilote pour la greffe en utilisant 5 x 105 cellules à 2 x 106 cellules par injection, avec des incréments de 5 x 106 cellules, que l'efficacité de greffe varie entre les lignées organoïdes.

  1. À l'aide d'une pipette P1000, dessinez le médium et la pipette de haut en bas pour perturber la matrice de membrane du sous-sol. Lorsqu'elle est complètement perturbée, transférer la suspension dans un tube conique de 15 ml. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min.
    REMARQUE : Ne transférez pas plus de 10 dômes de matrice par tube conique de 15 ml.
  2. Retirer le supernatant et laver avec 5 ml de PBS. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min.
  3. Retirer le supernatant et resuspendre la pastille dans 4 ml de remplacement de trypsine. Digdion de 5 à 10 min en secouant à 37 oC.
  4. Ajouter un volume égal de milieu organoïde - 10% FBS pour inhiber le remplacement de la trypsine. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min.
  5. Retirer le supernatant et le suspendre dans 1 ml de PBS. Filtrer la suspension à l'air d'un filtre de 40 m pour assurer une suspension à cellule unique. Quantifier les cellules à l'aide de méthodes standard.
  6. Faites tourner et resuspendles les cellules de l'inhibiteur de la PBS et de Rho à une concentration de 2 x 106 cellules par 100 l (voir le tableau 2 pour les concentrations cellulaires et le nombre absolu de cellules nécessaires pour des concentrations variables). Utilisez un volume égal de matrice de membrane de sous-sol pour générer une suspension 1:1. Placez la suspension sur la glace.
  7. Injecter des cellules selon les protocoles standard et surveiller la croissance du xénogreffe en utilisant des méthodes standard8.

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Résultats

Efficacité de l'ensemencement
La capacité de formation d'organoïdes est déterminée par phénotype et génotype. Les cellules basales de la prostate de type sauvage (WT) ont montré une capacité de formation organoïde supérieure (30 %-40 %) par rapport aux cellules lumineuses (3%) (Figure 1A). Après l'établissement d'organoïdes, la capacité de formation a augmenté radicalement. En règle générale, 25 % à 30 % des cellules dériv...

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Discussion

Comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à la résistance aux antiandrogènes et découvrir les vulnérabilités thérapeutiques potentielles nécessite de tester des réponses pharmacologiques dans des systèmes modèles imitant le cancer de la prostate. Décrit ici est un protocole détaillé pour l'analyse fiable des réponses pharmacologiques dans les organoïdes de prostate patients-dérivés et génétiquement modifiés et la préparation de ces échantillons d'organoïdes pour des applications en aval.

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Déclarations de divulgation

C.L.S siège au conseil d'administration de Novartis; est cofondateur d'ORIC Pharmaceuticals et co-inventeur de l'enzalutamide et de l'apalutamide; est conseiller scientifique pour Agios, Beigene, Blueprint, Column Group, Foghorn, Housey Pharma, Nextech, KSQ, Petra et PMV; et est cofondateur de Seragon, racheté par Genentech/Roche en 2014. W.R.K. est coinventeur et titulaire de brevets en technologie organoïde.

Remerciements

K.P. est soutenu par NIH 1F32CA236126-01. C.L.S. est soutenu par HHMI; CA193837; Ca092629; CA224079; CA155169; CA008748; et Starr Cancer Consortium. W.R.K. est soutenu par La Fondation néerlandaise contre le cancer/KWF Buit 2015-7545 et la Prostate Cancer Foundation PCF 17YOUN10.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
A83-01Tocris2939Composant du milieu organoïde : Concentration finale 200 nM
ADMEM/F12Gibco/Life technologies12634028Composant du milieu organoïde
B27Gibco/Life technologies17504-044Composant du milieu organoïde
Plaques de culture cellulaireFisher657185
Titre cellulaire GloPromegaG7571
DHTSigma-AldrichD-073Composant du milieu organoïde : Concentration finale 1 nM
DMSOFisherBP231-100
EGFPeprotech315-09Composant du milieu organoïde : Concentration finale 50 ng/ml pour la souris, 5 ng/nl pour l’homme
FGF10Peprotech100-26Composant du milieu organoïde spécifique à l’homme : Concentration finale 10 ng/ ml
FGF2Peprotech100-18BComposant du milieu organoïde spécifique à l’homme : Concentration finale 5 ng/ml
GlutamaxGibco/Life technologies35050079Composant du milieu organoïde
HEPESFABRIQUÉ EN INTERNEN/AComposant du milieu organoïde : Concentration finale 10 mM
Matrigel (facteur de croissance réduit & Sans rouge de phénol)CorningCB-40230CComposant du milieu organoïde
N-AcétylcystéineSigma-AldrichA9165Composant du milieu organoïde : Concentration finale 1,25 mM
NicotinamideSigma-AldrichN0636Composant du milieu organoïde spécifique à l’homme : Concentration finale 10 mM
NOGGINPeprotech ou cellules 293t transfectées stables avec construction Noggin (Karthaus et al. 2014)120-10CComposant du milieu organoïde : Concentration finale Milieu conditionné à 10 % ou 100 ng/ml
Pénicilline/StreptavidineGemini Bio-Products400-109Composant du milieu organoïde
Inhibiteurs de la phospataseMerck Millipore524629
Prostaglandine E2Tocris3632464
Inhibiteurs de protéaseMerck Millipore539131
R-SPONDINCellules 293t transfectées par Peprotech ou stables avec construction R-Spondin1 (Karthaus et al. 2014)120-38Composant du milieu organoïde : Concentration finale Milieu conditionné à 10 % ou 500 ng/ml
Tampon RIPAMerck20-188
Minikit RNA-easyQiagen74104
SB202190Sigma-Aldrich152121-30-7Composant du milieu organoïde spécifique à l’homme : Concentration finale 10 &mu ; M
TryplEThermoFisher12605036
Y-27632SelleckchemS1049Composant du milieu organoïde : Concentration finale 10 &mu ; L

Références

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