Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Résumé

Les cultures de tranches organotypiques sont un outil puissant pour étudier les processus neurodéveloppementaux ou dégénératifs/régénérateurs. Ici, nous décrivons un protocole qui modélise la mort neurodéveloppementale des cellules de Purkinje dans les cultures de tranche de cévedrillon de souris. Cette méthode peut bénéficier à la recherche dans la découverte de médicaments neuroprotecteurs.

Résumé

La culture de tranches organotypiques est un modèle in vitro puissant qui mimicks in vivo conditions plus étroitement que les cultures cellulaires primaires dissociées. Au début du développement postnatal, les cellules cérévelaires de Purkinje sont connues pour passer par une période vulnérable, au cours de laquelle elles subissent la mort cellulaire programmée. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour effectuer la culture de tranche de cervelateur organotypic de souris pendant ce temps critique. Les tranches sont également étiquetées pour évaluer la survie des cellules de Purkinje et l'efficacité des traitements neuroprotecteurs. Cette méthode peut être extrêmement utile pour dépister de nouvelles molécules neuroactives.

Introduction

La modélisation in vitro est un outil essentiel de la recherche biomédicale. Il permet aux chercheurs d'étudier et de contrôler étroitement des mécanismes spécifiques dans les types de cellules restreintes, ou dans des systèmes/organes isolés. La culture de tranches organotypiques est une technique in vitro largement utilisée, en particulier dans le domaine des neurosciences¹. La méthode a d'abord été mise en place par le président Dehwiler, qui a cultivé des tranches de cerveau en utilisant la technique du tube à rouleaux², puis modifiée par Yamamoto et coll., qui ont introduit l'utilisation d'une membrane microporeuse ....

Protocole

Toutes les expériences impliquant des animaux ont été réalisées conformément au comité d'études animales de l'Université Northwestern.

1. Préparation avant les cultures de tranches de cervelateur organotypiques

1. Dans une hotte de culture cellulaire pulvérisée avec 70% d'éthanol à l'avance, préparer 200 ml de milieu de culture dans un filtre à vide de 250 ml fixé à un récepteur de bouteille stérile. Ajouter 100 ml d'aigle moyen basal (BME), 50 ml de solution de sel équilibré (HBSS) de Hanks, 50 ml de sérum de cheval inactivé par la chaleur, 1 ml de 200 mL de L-Glutamine (concentration finale 1 mM) et 5 ml de glucose de 200 g/L (conc....

Résultats

Comme le montre la figure 4, ce protocole produit des cultures de tranches de cervelateurs organotypiques dans lesquelles la survie des cellules de Purkinje peut être évaluée après les étapes d'immunofluorescence et d'acquisition d'image. Les cellules purkinje ont été étiquetées avec une combinaison d'anticorps anti-Calbindin D-28K (dilution 1/200) et d'anticorps anti-souris Alexa594 (dilution 1/300). La couture d'image a été faite automatiquement par le logiciel d'acquisition de microscope .......

Discussion

La culture de tranches de céveltove est un outil puissant pour étudier la mort cellulaire programmée de Purkinje pendant le développement postnatal. Cette technique peut être utilisée pour dépister rapidement les molécules candidates pour leur potentiel neuroprotecteur. Le principal avantage est que la configuration est simple et très rentable, et ne nécessite qu'un investissement modeste dans l'équipement (un vibratome peut coûter jusqu'à 3 fois plus cher qu'un hélico de tissu). En outre, 10 à 15 tranches saines peuvent.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG anticorps secondaire	ThermoFisher scientific	A21203
Basal Medium Eagle (BME)	ThermoFisher scientific	21010046
Biosafety box Class II, Type A2	NuAire	NU-540-400
Albumine sérique bovine	Millipore Sigma	A2153
Brush
anticorps anti-Calbindin D-28K (CB-955)	Abcam	ab82812
Incubateur CO2	NuAire	NU-5700
Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates Fisher	Scientific	07-200-83
Coverslips, 22 x 50 mm	Fisher Scientific	12-545-E
Pince à pansement, droite	Harvard Apparatus	72-8949
Lames à double tranchant	Fisher Scientific	50949411
Éthanol 200 proof	Decon Labs, Inc	2701
Ciseaux pour les yeux, droits	Appareil Harvard	72-8428
Pince fine	Fisher Scientific	16-100-127
L-Glutamine 100X	ThermoFisher scientific	25030149
Solution de glucose	ThermoFisher scientifique	A2494001
Hanks' Solution saline équilibrée	ThermoFisher scientific	14025092
Hoechst 33342, trichlorhydrate trihydraté	Fisher Scientific	H21492
Sérum pour cheval, inactivé par la chaleur, origine néo-zélandaise	ThermoFisher scientific	26050088
ImageJ
McIlwain Tissue Chopper	Fisher Scientific	NC9914528
Microsondes	Fisher Scientific	08-850
Inserts de culture cellulaire Millicell Millipore	Sigma	PICM0RG50
Nalgene Unités de filtration stériles jetables à débit rapide avec membrane PES, 250 mL	ThermoFisher scientific	168-0045
Système de microscope laser confocal Nikon A1R
NIS-Elements	Nikon
Paraformaldéhyde	Acros Organics	41678-0010
Pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
Chlorure de potassium	Fisher Scientific	BP366-500
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher scientific	P10144
Ciseaux opératoires, droits	Harvard Apparatus	72-8403
Vibrateur orbital Belly Dancer	IBI Scientific	BDRLS0003
Prism 8	GraphPad
Superfrost Plus Lames de microscope	Fisher Scientific	12-550-15
Boîte de culture tissulaire, 60 mm avec anneau de préhension	Fisher Scientific	FB012921
Plaque de culture tissulaire, 24 puits	Falcon/Corning
Pipettes de transfert, stériles	ThermoFisher scientific	13-711-21
Triton X-100	ThermoFisher scientific	BP151-500

Logiciel d’imagerie Nikon 353047