Isolement et caractérisation des vésicules extracellulaires produites par des mycobactéries limitées en fer

Résumé

Mycobacterium tuberculosis montre une augmentation de la production et la libération de vésicules extracellulaires en réponse à de faibles conditions de fer. Ce travail détaille un protocole pour générer de faibles conditions de fer et des méthodes pour la purification et la caractérisation des vésicules extracellulaires mycobactériennes libérées en réponse à une carence en fer.

Résumé

Les mycobactéries, y compris Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l'agent causal de la tuberculose humaine, libèrent naturellement des vésicules extracellulaires (VE) contenant des molécules immunologiquement actives. Les connaissances concernant les mécanismes moléculaires de la biogenèse vésicule, le contenu des vésicules et leurs fonctions à l'interface pathogène-hôte sont très limitées. Pour répondre à ces questions, il faut des procédures rigoureuses d'isolement, de purification et de validation des véhicules électriques. Auparavant, la production de vésicules s'est avérée améliorée lorsque M. tuberculosis a été exposé à la restriction de fer, une condition rencontrée par Mtb dans l'environnement hôte. Présenté ici est un protocole complet et détaillé pour isoler et purifier les véhicules électriques à partir de mycobactéries déficientes en fer. Des méthodes quantitatives et qualitatives sont appliquées pour valider les véhicules électriques purifiés.

Introduction

Les vésicules extracellulaires mycobactériennes (MEV) sont des nanoparticules membranaires, de 60 à 300 nm de taille, naturellement libérées par les mycobactéries à croissance rapide et lente¹. Les MEV libérés par les mycobactéries pathogènes constituent un mécanisme d'interaction avec l'hôte par l'intermédiaire de protéines immunologiquement actives, lipides et glycolipides sécrétés d'une manière concentrée et protégée^2,3,4. Pour caractériser les Monos et comprendre leur biogenèse et leurs fonctions, des méthodes strictes et efficaces de purification et de validation des vésicules sont cruciales. Jusqu'à présent, les MEV ont été isolés des filtrates de culture des mycobactéries cultivées dans un milieu riche en fer^1,5,6,7^,8.

Cependant, des travaux antérieurs ont démontré que la limitation du fer stimule grandement la libération de vésicule dans Mtb, peut-être pour capturer le fer par l'intermédiaire de la mycobactine, un siderophore sécrété dans meVs⁹. Bien que des procédures d'isolement des MVE par rapport à la culture Mtb dans un milieu de fer élevé aient été décrites, une méthodologie efficace pour obtenir des MPV à partir de cultures de fer faible n'a pas été signalée. Par conséquent, l'objectif de cette méthode est d'isoler, purifier et quantifier les Monovirus obtenus à partir de cultures de fer faible afin qu'ils puissent être utilisés pour des essais biochimiques et fonctionnels et pour l'analyse des déterminants génétiques de la production de vésicules chez les mycobactéries.

Protocole

1. Préparation du milieu défini appauvri en fer

1. Préparer 1 L de milieu minimal (MM) en dissolvant 5 g de KH₂PO₄, 5 g de L-asparagine, 20 ml de glycérol et 2 g de dextrose dans 900 ml d'eau deionisée dans un récipient en plastique. Évitez le verre pour prévenir la contamination du fer. Ajuster le pH à 6,8 avec 5 N NaOH et le volume à 1 L avec de l'eau.
2. Ajouter 50 g de résine de chélage métallique (MCR) et agiter doucement à l'aide d'une barre magnétique pendant 24 h à 4 oC. Stériliser et retirer le MCR par filtration à travers une unité de filtre de 0,22 m avec un récepteur en plastique. Pour accélérer la filtration et prévenir l'engorgement du filtre, laissez les sédiments de résine pendant environ 30 minutes avant la filtration.
   REMARQUE: Ce milieu contient moins de 2 m de fer résiduel, tel que déterminé par spectroscopie d'absorption atomique.
3. Supplément MM avec 0,5 mg/L de ZnCl₂, 40 mg/L de MgSO₄, et 0,1 mg/L de MnSO₄. Séparément, préparer les stocks concentrés (1 000x) de chacun des suppléments métalliques dans l'eau déionisée et stériliser par filtration avant la supplémentation MM. Le MM, épuisé de fer et en métal, sera ici appelé MM à faible teneur en fer (LIMM).
4. À partir d'un stock de 50 mM de FeCl₃ dissous en 10 mm HCl, ajouter 1 ml à 1 L de LIMM (concentration finale de 50 M) pour préparer le MM de fer élevé (HIMM).

2. Cultiver des mycobactéries dans des conditions limitées en fer

1. Décongeler 50 l d'un bouillon de glycérol congelé de 15 % de Mtb et silloner une plaque d'agar complétée par un enrichissement ADN de 10 % (5 g/L d'albumine, 2 g/L dextrose, et 0,85 g/L de chlorure de sodium, 0,2 % de glycérol et 0,05 % de Tween-80)¹⁰. Incuber la plaque à 37 oC jusqu'à ce que les colonies soient visibles.
2. Inoculer une seule colonie de Mtb¹⁰ dans 2 ml de milieu de bouillon mycobactérien (Table de Matériaux) complété par l'enrichissement ADN. Incuber avec agitation à 37 oC.
3. Laissez la culture Mtb se développer jusqu'à la phase logarithmique tardive (OD₅₄₀ est de 0,8). Pour vérifier cela, mesurez l'OD₅₄₀ à l'aide d'un spectrophotomètre.
4. Étendre 200 L de la culture logarithmique tardive sur les plaques d'agar mycobactériennes (Table of Materials) complétées par 0,2 % de glycérol, 0,05 % de Tween-80 et ADN. Inoculer au moins 5 plaques. Incuber les plaques à 37 oC jusqu'à ce que la croissance bactérienne soit visible sous forme de couche de confluents. Cela prend 1 semaine pour Mtb.
5. Mouillez un coton-tige stérile dans LIMM. Utilisez cet écouvillon pour recueillir les bactéries des plaques d'agar et inoculer 100 ml de LIMM pour préparer une suspension bactérienne concentrée avec un OD₅₄₀ de 1,0.
6. Diluer cette suspension 10 fois à 1 L avec LIMM et la diviser en deux bouteilles en plastique stériles de 2 L, chacune contenant 500 ml de culture.
7. Sortez 2 ml de culture et transférez-le dans un tube de culture de 5 ml. Ajouter 10 lloxapol vol/vol.
8. Incuber les cultures à 37 oC debout pendant 14 jours.

3. Collection de MONOspaces

1. Mesurer l'OD₅₄₀ de la culture de 2 mL au moment de la collecte. Faire 1:10 dilutions sérielles de la culture et de la plaque 100 'L de chaque dilution sur des plaques d'agar avec ADN et 0,05% Tween-80.
2. Transférer la culture dans cinq tubes coniques de centrifugeuse de 225 ml et une centrifugeuse à 2 850 x g pendant 7 min à 20 oC.
3. Recueillir le supernatant de culture avec une pipette de 50 ml et filtrer le stériliser à travers une unité de filtre de 0,22 m.

4. Isolement des Monospaces

1. Transférer le filtrate de culture dans un système d'ultrafiltration de cellules agitées placé à 4 oC et filtrer le concentré à 50 psi à travers une membrane de coupure de 100 kDa à 50 ml.
2. Centrifuger la culture concentrée filtrate à 15 000 x g pendant 15 min à 4 oC et recueillir le supernatant.
3. Centrifuger la culture filtrate dans des tubes d'ultracentrifugation en polycarbonate à 100 000 x g pour 2 h à 4 oC.
4. Resuspendre les granulés membranaires dans un total de 1 ml de phosphate stérile tamponné saline (PBS) par pipetting douce.
5. Mélanger 0,5 ml de la suspension à granulés obtenue à l'étape 4.4 avec 1,5 mL de solution iodixanol à 60%, donnant une concentration finale d'iodixanol de 45% wt/vol. Dispensez ce mélange au fond d'un tube ultracentrifuge en polypropylène de 13 mm x 51 mm à parois minces.
6. Reproduit la suspension MEV-iodixanol 45% avec 1 mL de 40%, 35%, 30%, 25%, et 20% (vol/vol en PBS) solutions iodixanol et 1 mL de PBS au sommet.
7. Centrifugeuse à 100 000 x g pour 18 h à 4 oC.
8. Recueillir les fractions de gradient de densité de 1 ml à partir du haut à l'aide d'une seringue Hamilton de 1 ml.
9. Diluer chaque fraction recueillie à 20 ml avec le PBS et la centrifugeuse à 100 000 x g pendant 2 h à 4 oC.
10. Retirez le supernatant et suspendez la pastille dans 0,5 ml de PBS. Entreposer cette pastille à 4 oC.

5. Quantification des Monospaces

1. Mesurer la concentration en protéines dans chaque fraction par un test Bradford (Tableau des matériaux), suivant les directives du fabricant.
2. Effectuer l'analyse des lipides membranaires.
   1. Incuber 10 L de chaque fraction de gradient avec la sonde à membrane fluorescente 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate (TMA-DPH) à une concentration finale de 1 g/mL dans un volume final de 50 L de PBS en 96 bien noir Plaques.
   2. Incuber les assiettes à 33 oC pendant 20 min.
   3. Mesurer la fluorescence à 360 nm d'excitation et 430 nm d'émission.

6. Analyse qualitative des Monospaces

1. Effectuer l'électrophoresis de protéine.
   1. Mélanger environ 1 g d'échantillons de MEV dans 16 L avec 4 l de tampon de chargement de l'échantillon 5x (10 % w/v SDS, 10 mM dithiothreitol, 20 % v/v glycerol 0,2 M Tris-HCl, pH 6,8 0,05 % w/v bromophenol bleu) et chauffer les échantillons dans un échantillon tampon à 85 min.
   2. Chargez dans un gel 10% Tris/Glycine SDS-polyacrylamide¹¹ et courez à 10 V/cm dans le tampon de fonctionnement (base Tris 25 mM, 190 mM de glycine, 0,1% SDS) jusqu'à ce que le front de teinture bleue atteigne le fond du gel.
   3. Tainer le gel avec une solution de coloration de protéines ultrasensibles (Table des Matériaux).
2. Effectuer la tache de point.
   1. Chargez 2 L d'une suspension MEV avec une concentration d'environ 0,5 g/L, et des dilutions en série doubles sur une membrane de nitrocellulose et le processus pour une tache de point selon les instructions du fabricant.
   2. Utilisez un antisérum élevé chez la souris contre une préparation de MEV à une dilution de 1:5,000 comme anticorps primaire et un anti-souris de chèvre couplé au raifort peroxidase (HRP) à une dilution 1:10,000 comme anticorps secondaire. Détectez les complexes antigènes-anticorps avec un réagent approprié de détection de détection de blotting de substrat de HRP et un système de formation image.
3. Effectuer une coloration négative et une microscopie électronique.
   1. Fixer 250 L de MEV avec 2% de glutaraldéhyde en cacodylate de 0,1 M à température ambiante pendant 2 h et incuber toute la nuit dans 4% de formaldéhyde, 1% de glutaraldéhyde et 0,1% de PBS.
   2. Tainer les échantillons fixes avec 2% de tétroxide d'osmium pendant 90 min.
   3. Déshydrater l'échantillon en série dans de l'éthanol et l'intégrer dans la résine époxy de Spurr.
   4. Observez les MEV sous un microscope électronique de transmission.

Résultats

Les Monospaces ont été purifiés par sédimentation différentielle dans un gradient de densité (Figure 1, Figure 2). Dans les conditions décrites, les MEV se sont séparés principalement en fraction de gradient 3 (F3), ce qui correspond à 25% d'iodixanol. Cette conclusion est basée sur la détection de protéines, de lipides membranaires, de visualisation microscopique de Monomètres intacts, de distribution de la taille des nanopartic...

Discussion

Plusieurs méthodes pour purifier les exosomes eucaryotes dérivés de cellules ont été développées¹². En revanche, il existe peu d'informations sur les méthodes efficaces pour purifier les véhicules électriques dérivés de bactéries⁷. L'isolement efficace des véhicules électriques dérivés de Mtb doit tenir compte des difficultés intrinsèques à cultiver ce mycobactérie pathogène. Mtb a un temps de division long (24 h) et doit être manipulé dans des conditions de niveau de biosé...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cellule agitée Amicon Modèle 108	EMD Milipore	UFSC40001	Cell Système d’ultrafiltration
BD Polypropylène 225 mL Tubes coniques	Fisher	05-538-61	Tubes à centrifuger coniques
Biomax 100 kDa Membrane d’ultrafiltration	EMD Milipore	PBHK07610	Membrane d’ultrafiltration
Résine Chelex-100	Bio-Rad	142-2842	Métal résine chélatrice
Middlebrook 7H10 Agar	BD Difco	262710	Plaques de gélose mycobactérienne
Middlebrook 7H9 Broth	BD Difco	271310	Milieu de bouillon mycobactérien
Nitrocellulose membrane buvard	GE Healthcare	10600001	Blotting Membrane
Optiprep	Sigma	D1556	Iodixanol
Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 mm x 89 mm	Beckman Coulter	355618	Tubes ultra-centrifugateurs en polycarbonate 25 mm x 89 mm
Tube à centrifuger à paroi mince en polypropylène 13 mm x 15 mm Beckman	Coulter	344059	Tube à centrifuger en polypropylène à paroi mince 13 mm x 15 mm
Colorant d’analyse des protéines	BioRad	5000006	Bradford Protein Staining
Sondes moléculaires	SYPRO Ruby	S12000	Coloration protéique ultrasensible
TMA-DPH	Sondes moléculaires	T204	1-(4-Triméthylammoniumphényl)-6-Phényl-1,3,5-Hexatriène p-Toluenesulfonate
Fioles de filtration	sous vide CellPro	V50022	Unité de filtration