Une méthode d'imagerie semi-haut débit et une boîte à outils de visualisation de données pour analyser C. elegans Embryonic Development

Summary

Ce travail décrit un protocole semi-haut débit qui permet l'imagerie simultanée en time-lapse 3D de l'embryogenèse dans 80-100 embryons d'élegans de C. dans une seule course de nuit. En outre, des outils de traitement d'image et de visualisation sont inclus pour rationaliser l'analyse des données. La combinaison de ces méthodes avec des souches de reporter personnalisées permet une surveillance détaillée de l'embryogenèse.

Abstract

C. elegans est le premier système d'analyse systématique de la spécification du destin cellulaire et des événements morphogénétiques au cours du développement embryonnaire. Un défi est que l'embryogenèse se déroule dynamiquement sur une période d'environ 13 h; cette demi-journée a limité la portée des expériences en limitant le nombre d'embryons qui peuvent être photographiés. Ici, nous décrivons un protocole semi-haut-débit qui permet l'imagerie simultanée 3D de time-lapse du développement dans 80-100 embryons à la résolution de temps modérée, de jusqu'à 14 conditions différentes, dans une seule course de nuit. Le protocole est simple et peut être mis en œuvre par n'importe quel laboratoire ayant accès à un microscope avec une capacité de visite ponctuelle. L'utilité de ce protocole est démontrée en l'utilisant pour l'image de deux souches sur mesure exprimant des marqueurs fluorescents optimisés pour visualiser les aspects clés de la spécification germinale et de la morphogénèse. Pour analyser les données, un programme personnalisé qui récolte des embryons individuels à partir d'un champ de vision plus large dans tous les canaux, z-étapes, et les points de temps et enregistre les séquences pour chaque embryon dans une pile tiff séparée a été construit. Le programme, qui comprend une interface utilisateur graphique conviviale (GUI), simplifie le traitement des données en isolant, pré-traitant et en orientant uniformément les embryons individuels en vue de la visualisation ou de l'analyse automatisée. Une macro ImageJ qui compile des données d'embryons individuelles dans un fichier multipanel qui affiche la projection de fluorescence d'intensité maximale et les images des champs lumineux pour chaque embryon à chaque moment. Les protocoles et les outils décrits ci-dessus ont été validés en les utilisant pour caractériser le développement embryonnaire après l'élimination de 40 gènes développementaux précédemment décrits ; cette analyse a visualisé les phénotypes développementaux précédemment annotés et en a révélé de nouveaux. En résumé, ce travail détaille une méthode d'imagerie semi-haut débit couplée à un programme de recadrage et à un outil de visualisation ImageJ qui, combiné à des souches exprimant des marqueurs fluorescents informatifs, accélère considérablement les expériences d'analyse développement embryonnaire.

Introduction

L'embryon de C. elegans est un système modèle important pour la biologie cellulaire mécaniste et l'analyse de la spécification du destin cellulaire et des événements morphogénétiques conduisant au développement embryonnaire^1,2,3^{,4 ,5,6,7,8,9}. À ce jour, une grande partie de la caractérisation des événements au niveau cellulaire et de la spécification du destin....

Protocol

1. Préparation des embryons de C. elegans pour l'imagerie semi-haute débit

REMARQUE: L'objectif de cette partie du protocole est de charger une population d'embryons de C. elegans semi-synchronisés (stade de 2 à 8 cellules), disséqués à partir de souches de marqueurs appropriées (figure 2), dans une plaque de 384 puits à fond de verre pour l'imagerie. D'autres formats de plaques pourraient également fonctionner, mais les 384 plaques de puits sont préférées parce que la petite taille du puits limite la propagation des embryons à une zone relativement petite, ce qui facilite l'ide....

Results

Un défi important dans la caractérisation de l'effet des perturbations moléculaires sur le développement embryonnaire de C. elegans est qu'il faut environ 10 h pour que les embryons progressent du premier clivage à la fin de l'allongement à 20^'16. Une méthode semi-haut débit dans laquelle de grandes cohortes d'embryons peuvent être simultanément imageest utile pour les événements sur cette échelle de temps, car elle permet l'imagerie de conditions multiples en parallèle avec une taille d'.......

Discussion

Ce travail décrit une série d'outils et de méthodes qui ont été développés pour permettre des efforts à plus grande échelle pour profiler la fonction des gènes dans le développement embryonnaire dans C. elegans. Notre méthode semi-haut débit permet l'imagerie en time-lapse 3D du développement embryonnaire à une résolution de 20 min pour 80 à 100 embryons dans une seule expérience. Bien que ce protocole puisse être adapté pour une utilisation avec n'importe quelle souche de marqueur souhaitée, ce travail démontre.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ensemble tube d’aspirateur	Drummond Scientific	2-000-000
Pipette calibrée (25 mL)	Drummond Scientific	2-000-025
Cell Voyager Software	Yokogawa Electric Corp	CV1000
(15 mL)	USA Scientific	1475-0501
Microscope CV1000	Yokogawa Electric Corp	CV1000
Lame de dépression (3 puits)	Erie Scientific	1520-006
Microscope de dissection	Nikon	SMZ-645
Centrifugeuse Eppendorf 5810R	Eppendorf	5811 07336
ImageJ/FIJI	Open Source	https://imagej.net/Fiji
M9 Buffer	Lab Prepared	https://openwetware.org/wiki/M9_salts
Tube de microcentrifugation (1,5 ml)	USA Scientific	1615-5500
Microseal F-foil Seal	Bio-Rad	MSF1001
NGM Plates	Lab Prepared	http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Scalpel #15	Bard Parker	REF 371615
Sensoplate Plus, 384 puits, fond F, Pince à épiler	Greiner Bio-One	781855
Tetramisole Hydrochloride	Sigma Aldirch	T1512-10G
, Dumont #3	Electron Microscopy Sciences	0109-3-PO
Objectif U-PlanApo (10× ; 0.4 NA)	Olympus	1-U2B823
U-PlanApo objective (60× ; 1.35 NA)	Olympus	1-U2B832