Génération d'organoïdes endométrials primaires humains multicellulaires

Résumé

Un protocole pour produire des organoïdes endométrials primaires humains qui se composent des cellules épithéliales et stromales et pour retenir des caractéristiques du tissu endométrial indigène est présenté. Ce protocole décrit des méthodes de l'acquisition utérine de tissu au traitement histologique des organoïdes endométrials.

Résumé

L'endomètre humain est l'un des tissus les plus sensibles aux hormones dans le corps et est essentiel pour l'établissement de la grossesse. Ce tissu peut également devenir malade et causer la morbidité et même la mort. Les systèmes modèles pour étudier la biologie de l'endomètre humain ont été limités aux systèmes de culture in vitro de types de cellules uniques. En outre, les cellules épithéliales, l'un des principaux types cellulaires de l'endomètre, ne se propagent pas bien ou ne conservent pas leurs traits physiologiques en culture, et donc notre compréhension de la biologie de l'endomètre reste limitée. Nous avons généré, pour la première fois, des organoïdes endométrials qui se composent à la fois de cellules épithéliales et stromales de l'endomètre humain. Ces organoïdes ne nécessitent pas de matériaux exogènes d'échafaudage et s'organisent spécifiquement de sorte que les cellules épithéliales englobent la structure sphéroïde et deviennent polarisées avec des cellules stromales au centre qui produisent et sécrètent du collagène. Les récepteurs d'oestrogène, de progestérone et d'androgène sont exprimés dans les cellules épithéliales et stromal et le traitement avec des niveaux physiologiques d'oestrogène et de testostérone favorisent l'organisation des organoïdes. Ce nouveau système modèle peut être utilisé pour étudier la biologie de l'endomètre normal et la maladie d'une manière qui n'était pas possible auparavant.

Introduction

L'endomètre humain religne la cavité utérine et sert de premier contact pour l'embryon lors de l'implantation. L'endomètre est composé de cellules épithéliales luminestiques et glandulaires, de fibroblastes stromaux de soutien, de cellules endothéliales et de cellules immunitaires. Ensemble, ces types de cellules composent le tissu endométrial qui est l'un des tissus les plus sensibles aux hormones stéroïdes sexuelles¹. Les changements qui se produisent au cours de chaque cycle menstruel sont frappants. La croissance et le remodelage appropriés de l'endomètre sont nécessaires pour permettre l'implantation d'embryons. La réponse aberrante à l'oestrogène et à la progestérone peut avoir comme conséquence un endomètre réfractaire qui ne permet pas l'établissement réussi de la grossesse et peut même avoir comme conséquence des maladies comprenant la néoplasie endométriale.

Afin d'étudier les réponses hormonales et les changements essentiels qui se produisent dans l'endomètre, les cellules des tissus endométrial excisés des patients pendant la chirurgie ou la biopsie endométriale ont été propagées dans la culture cellulaire. Les cellules stromales endométriales prolifèrent et se propagent facilement de préférence, et le processus de différenciation induit e par la progestérone peut être récapitulé in vitro. En conséquence, beaucoup a été appris au cours de ce processus de différenciation, appelé décidualisation^2,3. L'autre type de cellule majeure dans l'endomètre, les cellules épithéliales luminal et glandulaire, cependant, ne se développent pas bien comme les monocouches traditionnels, perdant la polarité, devenant sénescent, et ayant le potentiel proliférant limité. En conséquence, on en sait moins de leur biologie et de leur rôle dans l'endomètre humain. Comme beaucoup de néoplasie proviennent des cellules épithéliales, les mécanismes associés à l'hyperplasie ou à la transformation aux cellules cancéreuses restent à être entièrement définis. En outre, des études ont établi que la réponse hormonale implique les actions paracrines intimes entre les cellules épithéliales et stromales de l'endomètre^4,5.

Récemment, une culture organoïde tridimensionnelle (3D) des cellules épithéliales endométriales a été établie par deux groupes indépendants^6,7, qui sont les premiers rapports des organoïdes formés à partir du tissu endométrial. Ces organoïdes étaient composés des cellules épithéliales endométriales incorporées dans une matrice de protéine (tableau des matériaux) et n'ont pas inclus un compartiment hormonalement sensible important de l'endomètre endométrial, les fibroblastes stromal. Comme les protéines matricielles peuvent varier d'un lot à l'autre et peuvent déclencher des voies de signalisation qui ne se produisent pas nécessairement dans le tissu, il serait idéal de remplacer les protéines matricielles par des composants de l'endomètre. Dans la présente étude, un protocole pour générer des organoïdes endométrialhumains humains sans échafaudage des cellules épithéliales et stromales de l'endomètre humain est présenté. La présence de cellules stromales fournit non seulement le soutien pour les cellules épithéliales mais fournit également les actions paracrines nécessaires qui ont été établies pour être importantes pour la réponse d'hormone endométriale^4,8,9 .

Le nouvel organoïde endométrial multicellulaire offre un système modèle de l'endomètre qui est simple à générer et qui intègre à la fois des cellules épithéliales et stromales. Ces organoïdes peuvent être utilisés pour étudier les changements hormonaux à long terme et les premiers événements de la maladie comme la tumorigénèse due à un déséquilibre hormonal ou des insultes exogènes. La complexité de ces organoïdes pourrait éventuellement être élargie pour inclure d'autres types de cellules, y compris les cellules endothéliales et immunitaires avec éventuellement des cellules myométriales pour imiter vraiment la physiologie des tissus humains.

Protocole

Des échantillons d'endomètre ont été prélevés sur des femmes préménopausées subissant une hystérectomie de routine pour des affections utérines bénignes à l'hôpital pour femmes Prentice de l'Université Northwestern, selon un protocole approuvé par la Commission d'examen institutionnel. Le consentement écrit a été obtenu de toutes les femmes incluses dans l'étude.

1. Préparation des moules d'Agarose

1. Avant de commencer l'isolement cellulaire, la fonte et l'équilibre de 1,5% agarose micro moules (Table des Matériaux) pour abriter les organoïdes selon les instructions du fabricant.

2. Génération d'organoïdes endométrials

1. Récolte des cellules stromales primaires et épithéliales
   1. Dans un cabinet de biosécurité utilisant une technique aseptique, préparer une solution enzymatique (2,5 mg/mL de collagène de type I - 0,1 mg/mL DNase I dans 10 ml de dispase [500 unités]) à 37 oC, et filtrer stérilement la solution à l'aide d'un filtre à seringues de 0,2 mm dans un tube conique de 15 ml.
   2. Dans une armoire de biosécurité utilisant la technique aseptique, gratter l'endomètre des biopsies utérines et hacher le tissu sous le capot en très petits morceaux avec un scalpel.
      REMARQUE: Le tissu endométrial d'au moins 20 mm x 10 mm x 1 mm est nécessaire pour générer un nombre suffisant d'organoïdes.
   3. Mettre le tissu fraîchement haché dans la solution enzymatique dans un tube conique de 15 ml. Fermer le bouchon et envelopper le dessus avec un film de cire (Table des matériaux) pour prévenir la contamination.
   4. Mettre le tube avec du tissu dans un bain d'eau ou un incubateur à 37 oC pendant 30 min avec des secousses douces (80 à 100 tr/min).
   5. Empilez une passoire cellulaire de 100 m sur une passoire cellulaire de 20 m sur un tube conique de 50 ml. Filtrer la solution à travers les deux passoires, puis rincer le tube conique de 15 ml avec 10 ml de solution de sel équilibrée de Hank (HBSS; Tableau des matériaux) et mettre le lavage à travers la passoire pour s'assurer que toutes les cellules sont recueillies.
      REMARQUE: Le liquide adalé contient des cellules stromales et des globules rouges (20 ml au total). Les cellules épithéliales sont collectées sur la passoire de 20 m. Des morceaux de tissu non digéré restent au-dessus de la passoire de 100 m. Jeter les tissus non digérés dans un contenant de déchets biorisques.
   6. Inverser la passoire à cellules de 20 m de l'étape 2.1.5 sur un nouveau tube conique de 50 ml et laver les cellules épithéliales de la passoire avec 20 mL de médias organoïdes (Table of Materials) complétés par un stylo/streptocoque de 1%.
   7. Centrifuger les tubes coniques des marches 2.1.5 et 2.1.6 à 500 x g pendant 5 min.
   8. Avec les cellules stromales collectées, retirez le supernatant et suspendez de nouveau la pastille avec 10 ml de tampon de lyse de globule rouge.  Incuber à 37 oC pendant 10 à 15 min. Centrifuger le tube conique à 500 x g pendant 5 min, retirer le supernatant et resuspendre la pastille avec 200 à 300 l de supports organoïdes (voir l'étape 2.2.2 pour d'autres instructions).
   9. Avec les cellules épithéliales collectées, retirez le supernatant et suspendez à nouveau avec 100 L de médias organoïdes (voir l'étape 2.2.2 pour d'autres instructions).
2. Cellules d'ensemencement
   1. Après avoir réquilibté les moules d'agarose de 1,5 % dans les puits (1 moule par puits) d'une assiette de 24 puits, retirez les milieuis organoïdes à l'extérieur des moules agarose et inclinez la plaque de culture tissulaire de sorte que le milieu de la chambre d'ensemencement cellulaire des plats d'agarose puisse également être soigneusement enlevés.
   2. Afficher les suspensions épithéliales (à partir de l'étape 2.1.9) et les suspensions cellulaires stromal (à partir de l'étape 2.1.8) sous le microscope.  Ajoutez plus de support organoïde aux suspensions épithéliales ou stromales de cellules 100 l à la fois, de sorte que les suspensions soient à peu près égales en densité.
      REMARQUE: Les cellules épithéliales s'agglutinent ensemble, et il n'est pas conseillé de digérer/trypsiniser les cellules épithéliales en suspensions à cellule unique.
   3. Mélanger 1 partie des cellules stromales avec 3 parties de cellules épithéliales par volume.
   4. Pipette 50 L (60 000 cellules) de la suspension cellulaire combinée dans la chambre d'ensemencement cellulaire du moule à agarose.
   5. Une fois que les moules d'agarose sont remplis de cellules, ajoutez soigneusement 400 l de support organoïde frais dans le puits de la plaque de 24 puits.
      REMARQUE: Le milieu atteint juste en dessous de la surface de la vaisselle agarose et ne fera pas flotter les cellules hors des moules. Après 2 à 3 jours, les cellules se déposent et commencent à former des organoïdes.
   6. Changer de moyen tous les deux jours avec 500 l de milieux organoïdes.
   7. Après 2-3 jours, changer moyen à un qui est complété avec 0.1 nM estradiol (E) et 0.8 nM testostérone (T) pour favoriser l'organisation des cellules épithéliales et stromales.
      REMARQUE: Bien que l'organisation des cellules épithéliales et stromales puisse se produire avec ou sans hormones, plus d'organoïdes s'organiseront en présence d'hormones.

3. Récolte d'organoïdes endométrials pour les expériences

REMARQUE: Une fois l'expérience terminée, les organoïdes endométrials peuvent être traités pour l'histologie ou l'analyse de l'ARN. Les étapes suivantes décrivent comment traiter les organoïdes.

1. Histologie
   1. Dissoudre 1,5 % d'agarose dans la saline tamponnée de phosphate (PBS) par ébullition. Laisser refroidir l'agarose liquide jusqu'à environ 50 oC.
   2. Sous un microscope disséquant, inclinez la plaque de 24 puits et sortez soigneusement le milieu de l'extérieur du moule à agarose. Soigneusement pipette sur le milieu de l'intérieur du moule agarose pour éviter de perturber les organoïdes.
   3. Sous un microscope à disséquer, pipette soigneusement 70-75 l de chaud (50 oC) 1,5% agarose dans la chambre du plat agarose. Veillez à ne pas déranger les organoïdes.
   4. Laisser refroidir à 4 oC pendant 5 min.
   5. Ajouter 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans chaque puits de la plaque de puits 24 et fixer l'ensemble du moule scellé agarose contenant des organoïdes pendant la nuit à 4 oC. Conservez ensuite 70 % d'éthanol à 4 oC jusqu'à ce qu'il soit prêt à être assidu pour l'incorporation de paraffine.
2. Isolement de l'ARN
   1. Sous un microscope disséquant, inclinez la plaque de 24 puits et sortez soigneusement le milieu de la chambre du moule agarose.
   2. Pipette 1 mL de milieu organoïde frais directement dans le moule d'agarose ainsi les organoïdes sont évacués des microwells. Veillez à ne pas créer trop de bulles.
   3. Répétez la pipetilage à nouveau avec le même support à partir de l'étape 3.2.2.
   4. Recueillir tout le milieu contenant les organoïdes. Centrifugeuse à vitesse maximale pour recueillir les organoïdes et procéder à l'extraction de l'ARN.

Résultats

Un schéma du protocole est représenté dans la figure 1. Le tissu utérin a été obtenu de la chirurgie après qu'il ait été examiné par des pathologistes. La doublure endométriale a été séparée du myometrium par le raclage et le tissu endométrial a été enzymatiquement digéré aux cellules comme décrit dans le protocole. Des cellules épithéliales et stromales ont été ajoutées dans des micropuits dans les moules d'agarose. Après 7 jours dans la culture, les organoïdes ont été traités avec E et T p...

Discussion

Nous avons produit des organoïdes endométrials humains composés de cellules épithéliales et stromales de l'endomètre sans l'utilisation de matériaux exogènes d'échafaudage. Bien qu'il ait déjà été démontré que les cellules épithéliales endométriales primaires peuvent former des organoïdes^6,7, ces cellules ont été incorporées dans une matrice gélatineuse de protéines sécrétées par les cellules de sarcome de souris (voir tableau des matériaux) pour...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agarose HS, grade biologie moléculaire	Denville Scientific	CA3510-6
Moules d’agarose	Sigma-Aldrich	Z764043	(https://www.microtissues.com/)
Chlorure d’ammonium (NH4Cl)	Amresco	0621
&beta ;-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2257
Colgénase, type II, poudre	Thermo Fisher Scientific	17101015
Dispase	Corning	354235
DNase I	Sigma-Aldrich	D4513
EDTA	Fisher Scientific	BP120-1
Coloration éosine	VWR	95057-848
(SP1), anticorps monoclonal de lapin	Thermo Fisher Scientific	RM-9101-S
Fluoroshield avec DAPI, milieu de montage histologique	Sigma-Aldrich	F6057
Solution saline équilibrée de Hank (HBSS)	Corning	21-022-CV	1x sans solution
coloration d’hématoxyline	Thermo Fisher Scientific	3530-32	Formulation Harris modifiée,
solution d’héparine	STEMCELL Technologies	07980	ajouté au milieu MammoCult
mère d’hydrocortisone	STEMCELL Technologies	07925	ajouté au milieu MammoCult
Milieux organoïdes - Mammocult	STEMCELL Technologies	05620	complété par 2 µ ; L/mL d’héparine et 5 & micro ; L/mL d’hydrocortisone
Paraformaldéhyde, solution à 16 %	Microscopie électronique Sciences	15710
Pénicilline-Streptomycine	Thermo Fisher Scientific	15140122
Saline tamponnée au phosphate, pH 7,4	Sigma-Aldrich	P3813
progestérone, PgR 1294, non conjugué, surnageant de culture	Agilent Technologies	M356801-2
matrice protéique - Matrigel	BD Biosciences	356231
Anticorps anti-E-cadhérine de souris purifié	BD Biociences	610181	Clone 36
Anticorps anti-vimentine recombinant [EPR3776]	Abcam	ab92547
Kit de lyse et d’isolement de l’ARN	Zymo Research	R2060
Bicarbonate de sodium (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014
Testostérone	Sigma-Aldrich	86500
Teinture trichrome	Abcam	ab150686
Film de cire - Parafilm	VWR	52858-000

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