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Article de méthode

Transplantation de cellules épithéliales mammaires de rat dans le tampon blanc interscapulaire de graisse

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DOI :

10.3791/60401

⸱

4 mars 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Department of Oncology, McArdle Laboratory for Cancer Research, University of Wisconsin-Madison School of Medicine and Public Health

Dans cet article

Résumé

Cet article décrit une méthode de transplantation pour greffer les cellules épithéliales mammaires de rat de distributeur dans le tampon blanc interscapular de graisse des animaux destinataires. Cette méthode peut être utilisée pour examiner les effets de l’hôte et/ou du donneur sur le développement de l’épithélium mammaire et élimine le besoin de pré-compensation, étendant ainsi l’utilité de cette technique.

Résumé

Dès les années 1970, les chercheurs ont réussi à transplanter des cellules épithéliales mammaires dans la coussinet de graisse blanche interscapulaire des rats. La greffe de l’épithélium mammaire à l’aide de techniques de transplantation tire parti de l’environnement hormonal fourni par l’hôte rongeur adolescent. Ces études sont idéalement adaptées pour explorer l’impact de diverses manipulations biologiques sur le développement des glandes mammaires et disséquer de nombreux aspects de la biologie des glandes mammaires. Une caractéristique commune, mais limitante, est que les cellules épithéliales transplantées sont fortement influencées par le stroma environnant et surpassées en concurrence par l’épithélium endogène ; pour employer le tissu mammaire indigène, le tampon blanc abdominal-inguinal de graisse doit être dégagé pour enlever l’épithélium mammaire d’hôte avant la transplantation. Un obstacle majeur lors de l’utilisation de l’organisme modèle de rat est que le dégagement de l’arbre mammaire en développement chez les rats post-soudés n’est pas efficace. Une fois transplantées dans des garnitures sans glande, les cellules épithéliales de distributeur peuvent repeupler le tampon de graisse d’hôte dégagé et former une glande mammaire fonctionnelle. Le tampon de graisse interscapulaire est un endroit alternatif pour ces greffes. Un avantage majeur est qu’il manque de structures canalaires mais fournit le stroma normal qui est nécessaire pour favoriser la croissance épithéliale et est facilement accessible chez le rat. Un autre avantage majeur de cette technique est qu’elle est peu invasive, car elle élimine la nécessité de cautériser et d’enlever l’arbre mammaire endogène en croissance. En outre, le tampon de graisse interscapulaire contient un vaisseau sanguin médial qui peut être utilisé pour séparer les sites pour la greffe. Puisque les glandes endogènes restent intactes, cette technique peut également être employée pour des études comparant la glande mammaire endogène à la glande transplantée. Cet article décrit la méthode de la transplantation épithéliale de cellules mammaires dans le tampon blanc interscapulaire de graisse des rats.

Introduction

Le développement des glandes mammaires postnatales et la morphogénèse canalaire sont des processus largement influencés par la signalisation hormonale au début de la puberté. Chez les souris et les rats, organismes modèles couramment utilisés de la biologie des glandes mammaires, ce processus commence vers l’âge de 3 semaines, où la prolifération et la différenciation rapides entraînent la formation du parenchyme mature. La glande mammaire mature peut subir de nombreuses séries d’expansion et d’involution, une propriété qui a été à l’étude depuis le début du20e siècle. Dans le contexte de l’hyperprolifération et du développement du cancer, des techniques de transplantation de glandes mammaires ont été développées dans les années 19501, et renforcées par la méthodologie quantitative fournie par Gould et coll. en 19772,3,4. Le raffinement de la technique de transplantation chez les rongeurs a contribué à des progrès majeurs dans la compréhension de la biologie normale des glandes mammaires qui sont encore largement utilisés pour étudier l’effet de divers traitements et la manipulation génétique sur le développement normal des glandes mammaires et les états de la maladie.

De nombreuses hypothèses ont été générées et ensuite testées à l’aide de la transplantation de glandes mammaires, décrites pour la première fois par DeOme et coll. en 19591. Des expériences menées sur plusieurs décennies ont montré la propension du tissu canalaire excisé des glandes mammaires des donneurs pour repeupler l’ensemble du coussinet de graisse5,6,7 et ont indiqué qu’un composant critique du développement des glandes mammaires réside dans ces structures épithéliales. Des études ultérieures chez la souris ont montré qu’une seule cellule souche mammaire peut repeupler un coussinet de graisse défriché et a contribué à la découverte d’un ancêtre unique et commun des cellules épithéliales mammaires basales et lumineuses8,9,10. Conformément à ces conclusions, il a été suggéré que la transplantation augmente le bassin de cellules avec un potentiel multilinéaire-repopulation en raison de la plasticité, permettant aux cellules greffées de se développer une glande mammaire fonctionnelle7,10,11,12,13. Fait important, l’utilisation de techniques de transplantation chez les rongeurs surmonte les limites des anomalies induites par la culture cellulaire14 et fournit souvent des résultats en seulement quelques semaines.

Tandis que la procédure a été décrite à l’origine dans le contexte des lésions prénéoplastiques chez les souris, elle a été bientôt étendue aux rats et employée en conjonction avec le traitement cancérogène pour établir la multiplicité comme mesure de la susceptibilité de cancer15,mais la popularité des techniques de transplantation a suivi le développement des outils génétiques pour chaque espèce. Bien que les études de souris incorporant la transplantation aient contribué à de nombreux résultats translationnels, le parenchyme de la glande mammaire de rat ressemble à l’humain plus étroitement16,17 et offre des avantages distincts pour étudier le cancer du sein récepteur-positif d’oestrogène (ERMD). Les tumeurs mammaires sont inducibles chez les deux espèces, mais elles diffèrent en termes de sensibilité hormonale et de profils d’expression génique. Une différence primaire est que les tumeurs mammaires de rat expriment et dépendent de la fonction des récepteurs ovariens et pituitaires d’hormone, à savoir, l’oestrogène et la progestérone (PR), semblables au sous-type luminal-A du cancer du sein humain. En effet, la transplantation épithéliale mammaire, telle que décrite dans ce protocole, a été utilisée pour étudier les variantes génétiques impliquées dans le cancer du sein et déterminer l’autonomie cellulaire des effets sur les cellules épithéliales mammaires18.

En plus de la biologie tumorale, l’épithélium canalaire de la glande mammaire normale de rat montre un niveau plus élevé de ramification et est flanqué d’une couche plus épaisse de stroma que la souris. L’importance du stroma est bien documentée dans les études de transplantation épithéliale mammaire. L’épithélium mammaire doit interagir avec le stroma gras, et idéalement son propre mésenchyme, pour subir sa morphogénèse caractéristique19,20. La greffe de tissu dans une glande mammaire receveure fournit un environnement optimal; cependant, la présence d’épithélium endogène peut interférer avec les résultats. Le préeffacement de la glande mammaire de l’épithélium endogène est généralement exécuté dans les essais de transplantation de souris et exige l’excision chirurgicale du tissu mammaire endogène et/ou l’enlèvement du mamelon1,21,22. Bien que possible, le pré-effacement de l’épithélium mammaire chez les rats après le serrage n’est pas aussi largement exécuté, principalement en raison de l’inefficacité de la compensation de l’arbre mammaire en croissance chez les rats post-serleurs. Puisqu’il a été démontré que les régions du tissu adipeux ailleurs dans le corps pourraient soutenir la croissance de l’épithélium mammaire transplanté21,23,24, le processus de précompensation peut être facilement évité chez les rats en greffant le tissu dans le tampon de graisse blanche interscapulaire.

La méthode de transplantation décrite dans cet article implique l’injection d’organoïdes de glande mammaire enzymatiquement dissociés (fragments d’épithélium canalaire mammaire et d’autres types de cellules capables de morphogénèse) ou de cellules monodispersées dans le coussinet adipeux interscapulaire dans les souches consanguines, isogéniques ou congéniques des rats de laboratoire2. Puisque le tampon interscapulaire de graisse est normalement dépourvu du tissu mammaire, il fournit un environnement approprié pour les emplacements multiples de transplantation sans avoir besoin de pré-défricher l’épithélium endogène. En conséquence, les glandes mammaires abdominales-inguinales de l’animal hôte ne sont pas soumises à une manipulation chirurgicale, se développent normalement et ne peuvent pas interférer avec l’interprétation des résultats. En outre, les glandes mammaires intactes peuvent être utilisées pour la comparaison pour évaluer les effets de l’hôte par rapport aux donneurs sur le développement de l’épithélium mammaire et la tumorigénèse18,25. Bien que le repeuplement de la glande mammaire à partir d’une seule cellule souche est disponible pour les souris, il n’a pas encore été développé pour les rats, principalement en raison du manque de disponibilité d’anticorps à sélectionner pour les cellules souches mammaires rat25,26,27. Malgré cela, la transplantation de cellules épithéliales mammaires monodispersées pour quantifier le potentiel de repeuplement peut être réalisée avec succès, et ces cellules se développeront normalement lorsqu’elles sont greffées dans le cadre approprié2,3,4. Bien que les organoïdes soient bons à de nombreuses fins, les cellules monodispersées sont nécessaires pour des applications quantitatives, par exemple, pour déterminer le nombre de cellules épithéliales mammaires requises pour l’initiation au cancer après le traitement de rayonnement ionisant28 ou pour comparer les caractéristiques des populations épithéliales mammaires sélectionnées par le flux29.

À ce jour, la procédure décrite ici est la méthode la plus robuste d’effectuer la transplantation de glande mammaire chez le rat avec un objectif global d’étudier le développement de glande mammaire et les mécanismes sous-jacents au développement du cancer du sein. Souvent, le donneur et/ou les animaux receveurs sont exposés à différentes variables avant, pendant ou après la transplantation épithéliale. Les exemples incluent des études de gène unique impliquant la carcinogenèse chimique30, rayonnement28,31,32, manipulation génétique du génome hôte/donateur18, et la manipulation hormonale12. Un avantage majeur de la dissociation enzymatique décrite dans ce protocole est la possibilité d’isoler les organoïdes épithélials ou les cellules monodispersées pour des expériences complémentaires impliquant la cytométrie de flux, la culture 3-D, l’édition de gènes, et plus encore. Les applications futures de cette technique comprendront la manipulation supplémentaire du donneur et/ou du tissu hôte avec le génie génétique. Par exemple, les cellules donneuses peuvent être génétiquement modifiées ex vivo à n’importe quel locus génomique choisi à l’aide du système d’édition de gènes CRISPR-Cas9. De même, les rats receveurs peuvent également être génétiquement modifiés pour étudier l’interaction entre les facteurs génétiques du donneur et du receveur.

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Protocole

Tous les animaux ont été logés et entretenus dans un établissement approuvé par l’AAALAC, et les expériences décrites dans ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du MUSC. Les animaux destinés à la transplantation réciproque doivent être une souche consanguine ou isogénique, avec un statut congénique préféré ou rétrocroisé pendant au moins 6 générations.

1. Récolte de l’épithélium de la glande mammaire du rat donneur

  1. Déterminer le nombre de rats donneurs nécessaires à la transplantation.
    REMARQUE : En général, 1 rat donneur (4 semaines) peut fournir suffisamment de cellules pour la transplantation chez 4 animaux receveurs. Certaines applications de ce protocole nécessiteront un nombre supplémentaire de cellules, et il peut y avoir des différences spécifiques à la souche dans le rendement total.
  2. Étiqueter toutes les fournitures et assurer un placement accessible au chirurgien (tableau 1).
  3. Enregistrez le poids corporel de chaque rat donneur femelle. Suivez les directives institutionnelles pour anesthésier ou euthanasier complètement le rat donneur. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réponse à la pincée d’orteil.
  4. Déplacez l’animal vers le champ chirurgical stérile. Placez l’animal sur le dos et vaporisez toute la surface ventrale avec 70 % d’éthanol.
  5. Faire une incision sagittale en forme de X, permettant l’accès aux glandes mammaires thoraciques, abdominales et inguinales. Disséquer tout le tissu de la glande mammaire du rat donneur à l’aide de ciseaux (Figure 1). Enlever tous les ganglions lymphatiques visibles.
  6. Extraire le tissu mammaire à l’aide de forceps et le placer dans un plat de 60 mm étiqueté sur la glace. Ajouter 500 l de supports DMEM/F12 sans sérum au plat de 60 mm. Ajuster le placement du tissu de la glande mammaire afin qu’il reste complètement humide.
  7. Hacher finement le tissu mammaire à l’aide de ciseaux. Pour ce faire, couper le tissu en morceaux de 1 à 2 mm3 de taille(figure 1C). Gardez la glande sur la glace jusqu’à ce que tous les tissus du donneur aient été récoltés (ne dépassent pas 60 min).
    REMARQUE : Le personnel supplémentaire peut hacher des glandes mammaires et préparer en outre la solution de collagène tandis que le chirurgien procède aux extractions de tissu.

2. Extraire des tissus cérébraux de donneurs euthanasiés

  1. Retourner délicatement le corps de l’animal donneur pour le placer dans une position encline. Sécuriser avec des broches. Vaporiser la tête et le haut du dos avec 70% d’éthanol.
  2. Localiser la base du crâne et faire une incision sous les condyles occipitaux. Insérez des ciseaux pointus sous la peau et coupez la peau loin du crâne, y compris les côtés de la tête.
  3. Utilisez des coupeurs d’os ou des ciseaux solides pour couper le crâne le long de la ligne médiane, des os occipitaux aux os frontaux. Gardez la lame aussi superficielle que possible et l’angle vers le haut pour empêcher la destruction du tissu cérébral sous-jacent.
  4. Épluchez l’os à l’aide de rongeurs ou de forceps forts. Insérez l’outil latéral au cervelet pour briser l’os de chaque côté, en exposant le canal auditif osseux. Rompre les liens avec les méninges.
  5. Soulevez doucement le cerveau avec des forceps incurvés et fins. Placez le cerveau sur un morceau de papier d’aluminium et enregistrez le poids, puis transférez immédiatement à un tube de 15 ml avec une quantité égale (w:v) de médias, stockés sur la glace.
    1. Optionnellement, utilisez des forceps à pointe fine pour enlever l’hypophyse (située sous le cerveau) pour une utilisation supplémentaire dans la procédure de transplantation, si nécessaire.
  6. Utilisez un homogénéisateur mécanique pour perturber le tissu. Homogénéiser le cerveau pour 10-15 s à basse vitesse. Laisser le mélange s’asseoir sur la glace pendant au moins 1 min, puis homogénéiser à nouveau. L’homogénéisation est suffisante lorsque le mélange final est exempt de gros morceaux.
  7. Filtrer l’homogénéisme en le passant à travers un filtre de 100 m. Conserver le filtrate sur la glace jusqu’à l’utilisation (moins de 4 h).

3. Digestion et traitement des extraits de glande mammaire

  1. Dégeler ou réchauffer les réactifs comme indiqué (tableau 1). Suivez les étapes appropriées pour récupérer les organoïdes ou les cellules monodispersées.
  2. Préparer 10 ml de filiérisme de digestion sans sérum (sans collagène) pour chaque animal donneur (Fichier supplémentaire 1).
    REMARQUE : Le volume des supports de digestion utilisés peut être ajusté (à l’échelle vers le haut ou vers le bas) pour accueillir le tissu groupé, le cas échéant.
    1. Pour les organoïdes sauter à 3.3.
    2. Pour les cellules monodispersées, préparez le mélange frais de monodispersion et la solution d’inactivation (Fichier supplémentaire 2, Fichier supplémentaire 3) en plus du média de digestion de collagène sans sérum. Passez à l’étape 3.3.
  3. Lorsque tous les tissus mammaires des donneurs ont été extraits et hachés, ajoutez l’enzyme de collagène au média de digestion chaud (ou à température ambiante)(Fichier supplémentaire 1). Mélanger en inversant.
  4. Passer le milieu de digestion du collagène à travers un filtre de 20 m. Distribuer 10 ml de support filtré dans les tubes étiquetés de 50 ml pour la digestion.
  5. Utilisez une nouvelle pointe de pipette de 1 000 l pour chaque échantillon et transférez le tissu de donneur haché de chaque plat de 60 mm au tube de digestion de collagène. Coupez 1 cm de l’extrémité d’une pointe de 1 000 l et placez-la manuellement sur l’appareil avant de l’utiliser. Mélanger délicatement le tissu haché en faisant monter et descendre 1-2 fois.
    REMARQUE: Si le tissu est difficile à pipette pendant le transfert, utiliser une petite quantité du support de digestion de collagène du tube de 50 ml, puis le transférer en arrière.
  6. Placer les échantillons en position horizontale dans un incubateur secouant et laisser les échantillons digérer de 1,5 à 2 h à 37 oC, 200 à 220 tr/min.
    1. Pour les organoïdes sauter à 3,7.
    2. Pour les cellules monodispersées ajouter DNase I (0,2 g/mL) au mélange pour les 10 dernières min de la digestion. Incuber comme avant, avec des secousses vigoureuses. Passez à l’étape 3.7.
  7. Lorsque le tissu est entièrement digéré, pelleter la suspension à l’aide d’une centrifugation froide (4 oC) pendant 10 min à 1 200 x g (Figure 1D).
    REMARQUE : Gardez les tubes sur la glace entre chaque étape pour augmenter la viabilité des cellules.
  8. Assurez-vous qu’une boulette s’est formée, puis versez soigneusement la couche de supernatant et de graisse. Resuspendre délicatement la pastille dans 10 ml de médias DMEM/F12 frais.
  9. Tourner brièvement à 68 x g pendant environ 10 s. La longueur de la rotation (mais pas la vitesse) peut être augmentée s’il n’y a pas de séparation claire des cellules. Inspecter visuellement la pastille avant de procéder (Figure 1D).
  10. Retirez soigneusement le supernatant, en laissant derrière lui un petit volume. Passez à l’étape suivante, selon que des organoïdes ou des cellules monodispersées sont nécessaires.
    REMARQUE Il est important de laisser un petit volume de support dans le tube parce que le granule sera très lâche. Le volume résiduel des supports sera dilué par des étapes de lavage.
    1. Pour les organoïdes, ajouter un autre volume de 10 ml de médias DMEM/F12 et répéter le lavage/spin. Après le deuxième lavage, resuspendre les cellules dans un plus petit volume (1-2 ml) de milieu d’AMEM/F12 pour la filtration. Passez à l’étape 3.11.
    2. Pour les cellules monodispersées, dissoudre dans 2 ml de HBSS pré-chauffé avec 0,025% (w/v) Trypsin et 6.8 mM EDTA. Digest de 3 à 5 min à 37 oC. Inactiver immédiatement.
      1. Ajouter 4 mL de DMEM/F12 avec 10% FBS pour arrêter d’activer la trypsine.
      2. Faites tourner les cellules à 270 x g pendant 5 min, puis resuspendez-les en DMEM/F12 avec 10% de FBS à nouveau. Passez à l’étape 3.11 pour filtrer les cellules.
  11. Filtrer les cellules à l’aide d’une passoire cellulaire de 40 m placée dans un nouveau tube de 50 ml. Prémouiller la passoire en pipetilisant 1 ml du même milieu de base utilisé pour suspendre les cellules, puis passer la suspension cellulaire à travers le filtre à l’aide d’une pipette pour recueillir des fragments de canalisation / organoïdes.
    REMARQUE : Le rendement approximatif de l’épithélium filtré du tissu de glande mammaire d’un seul rat donneur de 4 semaines est de 1 x 106 cellules.
    1. Pour les organoïdes, jetez le filtrate. Les organoïdes mammaires resteront à l’intérieur du panier de la passoire cellulaire et les cellules plus petites et indésirables seront éliminées. Inverser la passoire cellulaire sur un nouveau tube de 50 ml, et rincer avec n’importe quel volume nécessaire pour recueillir les cellules. Passez à l’étape 3.12.
    2. Pour les cellules monodispersées, jetez la passoire cellulaire et gardez le filtrate parce que les cellules épithéliales mammaires passeront à travers le filtre, avec de plus petites cellules stromales et immunitaires. Rincer le tube qui a été utilisé pour la digestion / centrifugation avec un autre volume de DMEM / F12 avec 10% FBS et passer par la même passoire cellulaire. Pelleter les cellules monodispersées par centrifugation à 1 200 x g pendant 5 min. Procéder à l’étape 3,12.
      REMARQUE : Les cellules suspendues sont prêtes pour les applications ultérieures.
  12. Pulse spin la solution et assurer la formation d’une pastille cellulaire avant de passer à l’étape suivante. Tourner à nouveau, si nécessaire.
  13. Retirez soigneusement le supernatant. Resuspendre la pastille en petit volume (1 000 à 2 000 l de DMEM/F12) pour concentrer les cellules pour le comptage.
  14. Comptez les cellules et diluez-vous si nécessaire. Resuspendre le nombre désiré de cellules pour la transplantation dans 20 'L de dMEM/F12 médias pour chaque animal. Gardez toujours les cellules sur la glace.
    REMARQUE : Des cellules de donneur s’étendent dans la gamme de 1 x 105 - 1 x 106 cellules seront exigées pour chaque emplacement de greffe basé sur le point final de l’étude. Par exemple, les expériences de cancérogéesis nécessitent souvent un plus grand nombre de cellules transplantées, par rapport à d’autres applications. Le nombre de cellules nécessaires doit être déterminé expérimentalement pour chaque souche. La procédure décrite dans ce protocole a utilisé 250.000 cellules de distributeur dans 20 médias de L par emplacement de greffe, avant de mélanger avec l’homogénéat de cerveau, comme décrit dans l’étape 3.16.
  15. Préparer tout aliquot (s) de cellules nécessaires pour d’autres expériences (par exemple, l’isolement FACS3,26,27,30,33).
    1. Pour les organoïdes, passez à l’étape 3.16.
    2. Pour les cellules monodispersées, quantifier les cellules viables à l’aide de Trypan ou de taches bleues de méthylène, puis procéder.
  16. Préparer un seul lot de matériel de donneur pour tous les receveurs de greffe. Combinez des volumes égaux de la suspension cellulaire (20 l) avec 50 % d’homogénéisme cérébral (20 l) pour chaque site de transplantation.
    REMARQUE : Un total de 40 L par site sera injecté à chaque site, mais il est recommandé d’inclure un volume supplémentaire minimum de 25 % pour les déchets.
  17. Procéder immédiatement à la transplantation ou à la congélation des cellules pour la transplantation plus tard (point d’arrêt potentiel).
    REMARQUE : Les cellules congelées n’ont pas été testées avec ce protocole et devront être optimistes avant de générer une cohorte d’animaux pour des expériences de transplantation. Il est fortement recommandé de transplanter des cellules fraîches.

4. Procédure de transplantation (rats receveurs de 4 à 5 semaines)

  1. Peser chaque rat receveur et calculer la dose correcte d’analgésique approuvé qui sera utilisé dans la procédure.
    REMARQUE : Les poids corporels peuvent être mesurés jusqu’à 24 h avant la procédure. Suivez les directives institutionnelles pour retenir ou anesthésier brièvement chaque animal pendant toute la durée du rasage.
  2. Raser la zone chirurgicale sur chaque animal à l’aide de tondeuses électriques. Identifiez la base du crâne et commencez la colonne vertébrale. Environ un tiers du chemin vers le bas de la colonne vertébrale, raser une zone de 3 cm x 2 cm sur la partie thoracique supérieure du dos.
    REMARQUE : Le rasage peut également être effectué sous anesthésie le jour de la transplantation, mais doit être effectué en dehors du champ stérile. Remettre le rat dans sa cage d’origine jusqu’à ce qu’il soit nécessaire.
  3. Localiser toutes les fournitures nécessaires à la transplantation (tableau 1).
  4. Évaluer le système d’anesthésie animale de laboratoire avant utilisation. Rechargez les fluides et remplacez les réservoirs ou les pièces nécessaires. Assurez-vous que la conduite de gaz de la chambre d’anesthésie est ouverte et que toutes les lignes périphériques sont fermées afin que l’anesthésie isoflurane et l’oxygène puissent circuler librement vers l’animal une fois qu’il est placé dans la chambre.
  5. Coussins chauffants chauds pour soutenir la température corporelle des animaux receveurs.
  6. Générer le champ stérile qui sera utilisé pour la chirurgie. Disposer les fournitures telles que décrites dans le tableau 1.
  7. Administrer l’analgésique préopératoire aux rats receveurs, comme l’indique le protocole de soins aux animaux approuvé par l’institution.
  8. Rincer les seringues Hamilton avec des supports dérimineux DMEM/F12 pour prévenir la perte de cellules. Assurez-vous que l’aiguille est fixée au corps de la seringue, insérez l’aiguille dans le liquide et tirez le piston. Remplir au volume maximum. Appuyez sur le piston vers le bas et expulsez le contenu dans un tube de collecte des déchets. Répéter 3-5 fois.
  9. Chargez tout le volume de matériel de donneur (préparé à l’étape 3.16) dans une seringue séparée pour chaque condition (p. ex., contrôle, traitement, wildtype, ko, etc.). Insérez la pointe de l’aiguille dans le liquide, tirez le piston et gardez l’aiguille sous la surface du mélange au fur et à mesure que le volume du tube diminue.
    REMARQUE : Inclure au moins 10 % de volume supplémentaire dans chaque seringue. Ne pas jeter le reste du mélange fermer le tube et le garder sur la glace au cas où plus est nécessaire.
  10. Inverser la seringue après qu’elle soit complètement chargée et presser légèrement le piston pour enlever les bulles d’air à l’extrémité de l’aiguille. Passez à l’étape suivante lorsque tout est prêt.
    REMARQUE : Assurez-vous que la pointe de l’aiguille ne touche jamais aucune autre surface, même dans le champ stérile. Il est utile de reposer le corps de la seringue sur un petit récipient de glace pour favoriser la viabilité des cellules.
  11. Placer l’animal receveur dans la chambre d’anesthésie et allumer la machine.
  12. Lorsque l’animal est complètement détendu (ne réagit pas aux écoutes ou aux mouvements doux de la chambre), dirigez l’anesthésie vers le cône nasal et transférez l’animal dans le champ stérile.
    REMARQUE : La durée prolongée de l’anesthésie n’est pas bien tolérée par les rats. Terminer la procédure pour chaque animal en 10 min ou moins.
  13. Placez l’animal en position couchée (sur le ventre) afin que l’arrière de la tête et la colonne vertébrale supérieure soient accessibles.
    REMARQUE : Assurer un soutien thermique adéquat pour l’animal en tout temps et évaluer régulièrement la profondeur de l’anesthésie à l’aide d’une pincée d’orteil ferme.
  14. Optionnellement, appliquez la pommade vétérinaire ophtalmique pour empêcher le séchage des yeux.
  15. Nettoyer la zone fraîchement rasée pour enlever l’excès de cheveux. Utilisez un mouvement circulaire et appliquez 70% d’éthanol (ou un autre réactif, selon les directives institutionnelles) sur la peau, suivi d’un antiseptique (comme l’iode), et répétez. Placez un rideau de serviette au-dessus de l’animal ainsi seulement la région pour la zone rasée est exposée.
  16. Assurez-vous que l’animal reste insensible aux stimuli profonds avec une pincée d’orteil ferme, puis passez à l’étape suivante.
  17. Faire une petite incision interscapulaire (2 cm) à l’aide d’une lame chirurgicale tranchante.
    REMARQUE: La coupe doit être superficielle, comme le tampon de graisse est situé juste sous la peau.
  18. Localiser le vaisseau sanguin médial pour l’orientation (Figure 2B).
  19. Soulevez la peau d’un côté de l’incision à l’aide de forceps et tenez-la loin du coussinet adipeux pendant la transplantation (Figure 2B). Insérez l’aiguille dans le site de la greffe.
    1. Optionnellement, déplacez la pointe de l’aiguille à l’intérieur du tissu et créez une petite poche pour recueillir les cellules. Utilisez un petit mouvement répétitif. Ne retirez pas l’aiguille.
      REMARQUE : Cette étape est recommandée pour les utilisateurs du protocole pour la première fois. Faites preuve d’une extrême prudence lors de la création d’une poche, car le tissu de tampon de graisse interscapulaire est très délicat.
  20. Injecter soigneusement 40 L du mélange cellulaire dans le tissu adipeux interscapulaire. Retirez l’aiguille lentement.
  21. Maintenez le tissu en place et laissez les cellules transplantées se contenter de 3-5 s. Utilisez une paire supplémentaire de forceps, si nécessaire.
  22. Retirez l’aiguille. Répétez la procédure d’injection (étapes 4.18-4.21) au deuxième site de transplantation.
    REMARQUE : L’épithélium d’un groupe de donneurpeut être injecté dans le même côté du coussinet de graisse dans chaque animal, ou en alternant les côtés pour empêcher les effets de lot de la main-dominance du chirurgien.
  23. Fermez la plaie chirurgicale à l’aide de pinces ou de sutures, puis arrêtez l’anesthésie.
  24. Fournir un analgésique postopératoire tel qu’indiqué par un protocole approuvé par l’institution.
  25. Déplacez immédiatement l’animal dans une cage de récupération avec le soutien thermique. Surveillez les signes de détresse tels que des saignements d’incision ou des difficultés respiratoires.
    REMARQUE : L’animal devrait se rétablir complètement dans un délai de 5 à 10 minutes. Se référer aux lignes directrices institutionnelles pour le retour des animaux dans la colonie et la surveillance postopératoire après les procédures de survie.
  26. Optionnellement, effectuer des études de carcinogenèse au site de greffe (s) en administrant des cancérogènes aux rats receveurs 3-4 semaines après la transplantation.
    REMARQUE : Typiquement, la carcinogenèse mammaire de rat est exécutée utilisant un traitement cancérogène chimique à 50-57 jours d’âge. Ce traitement dicte l’âge de la chirurgie de greffe (qui doit être fait entre 29-36 jours d’âge) pour permettre assez de temps pour que les cellules greffées amorcer la croissance de la glande mammaire.

5. Évaluation de la croissance épithéliale

  1. Surveillez le cycle de l’estrus des rats par le lavage vaginal quotidien et examinez la cytologie sur une lame de microscope. Commencez 8-12 jours avant le point final de l’étude. Sacrifiez tous les rats au même stade. Il s’agit d’une étape facultative.
    REMARQUE : Le cycle de l’estrus de rat est de 4-5 jours. Permettre à l’animal de passer par 1-2 cycles complets facilitera l’interprétation, comme les diapositives de lavage des cycles précédents peuvent être utilisés pour la comparaison.
  2. Rats receveurs de greffe de sacrifice 6-8 semaines après la transplantation, par lignes directrices institutionnelles.
    REMARQUE : La croissance est habituellement détectable 3-6 semaines après la transplantation, mais un temps supplémentaire peut être nécessaire.
  3. Placez l’animal en position couchée et nettoyez le corps avec 70 % d’éthanol. Soulevez la peau avec des forceps et faites une incision le long de la colonne vertébrale pour exposer le tampon de graisse interscapulaire. Disséquer la peau loin du tissu de sorte que la majorité de la graisse est visible.
  4. Identifiez le vaisseau sanguin médial qui sépare les emplacements de greffe dans le tampon interscapulaire de graisse. Accise le tampon entier comme un seul morceau de tissu ou couper le long du vaisseau sanguin et enlever les côtés individuellement.
  5. Placez le tissu sur une lame de microscope chargée positivement pour la monture entière. Utilisez 2 paires de forceps émoussés et écartez doucement le tissu pour restaurer sa conformation d’origine sur la glissière.
    REMARQUE : Le tissu mammaire de rat est extrêmement délicat. Les bords du tissu peuvent s’enrouler sous lui-même. Toujours manipuler avec soin et maintenir en place jusqu’à ce que le tissu adhère à la diapositive (quelques secondes).
  6. Montage entier au moins une des glandes mammaires abdominales-inguinales endogènes (avec des ganglions lymphatiques pour l’orientation) pour la comparaison.
  7. Placez les lames dans 70 % d’éthanol pendant 7 à 10 jours pour dégraisser le tissu. Réapprovisionnez l’éthanol aussi souvent que nécessaire pour s’assurer que le tissu ne se dessèche pas.
  8. Préparer la tache de carmin d’alun et traiter les diapositives lorsque le tissu est suffisamment opaque. Laisser refroidir la tache avant utilisation (Fichier supplémentaire 4).
    REMARQUE : La tache peut être préparée jusqu’à un jour à l’avance des étapes de fixation et de réhydratation. La solution peut être stockée à 4 oC et a un potentiel limité de réutilisation.
  9. Fixer le tissu en plaçant les lames dans 25% d’acide acétique glaciaire : 75% d’éthanol pendant 60 min.
    1. Réhydratez le tissu à l’aucours d’une série de 3 lavages dans une série de diminution de la concentration d’éthanol : 70 % d’éthanol pour 15 min, 50 % d’éthanol pour 5 min et dH2O pour 5 min.
  10. Tache avec le carmin d’alun pendant 4-8 jours. Vérifiez le dos des diapositives chaque jour pour déterminer si la tache a complètement pénétré le tissu. Passez à l’étape suivante lorsque la coloration est terminée.
    REMARQUE : La coloration est complète lorsque les parties les plus épaisses de la glande ont une teinte violette et n’apparaissent plus blanches.
  11. Détainer et déshydrater le tissu en transférant les lames à travers une série de concentration croissante d’éthanol : 70 % d’éthanol pour 30 min, 95 % d’éthanol pour 30 min et 100 % d’éthanol pour 30 min.
  12. Placer les lames déshydratées en xylène pendant plus de 3 jours pour dégager le tissu. Transférer à l’huile minérale pour le stockage à long terme.
  13. Une fois les diapositives effacées, utilisez une microscopie lumineuse de faible puissance ou de la photographie numérique haute résolution pour acquérir des images des diapositives aux fins d’analyse. Assurez-vous que les paramètres d’acquisition d’image sont cohérents pour toutes les diapositives.
    REMARQUE : La croissance épithéliale doit être clairement distinguable.
  14. Traiter la présence de la croissance comme un résultat binaire.
  15. Calculez le nombre moyen de cellules épithéliales transplantées qui ont produit une excroissance mammaire de 1 dans 50 % des sites de greffe à l’aide des images acquises. Quantification d’autres caractéristiques physiques, au besoin.

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Résultats

Glandes mammaires de donneur et de receveur
Les étapes pour isoler et préparer les cellules épithéliales mammaires de rat pour la transplantation sont montrées dans la figure 1A. À l’âge de 4 semaines, la glande mammaire endogène du rat donneur a commencé la maturation et l’épithélium peut être visualisé sur des lames montées entières tachées de carmin d’alun (Figure 1

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Discussion

Ce protocole décrit une technique de transplantation épithéliale mammaire optimisée pour travailler avec des rats. Les organoïdes épithéliales mammaires isolés des rats donneurs (3-5 semaines) sont greffés dans le coussinet de graisse blanc interscapulaire des rats receveurs (également 3-5 semaines d’âge). Les résultats peuvent être interprétés aussi peu que 4-6 semaines plus tard, en utilisant la microscopie légère pour examiner le tissu greffé; cependant, la quantité optimale de temps entre la transplantation et le sac...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Remerciements

Ce travail a été financé par le Hollings Cancer Center’s Cancer Center’s Cancer Center Support Grant P30 CA138313 financement de la recherche pilote des National Institutes of Health (https://www.nih.gov/), et des fonds du Département de pathologie et de médecine de laboratoire à l’Université médicale de Caroline du Sud. Nous tenons à remercier Marijne Smiths d’avoir enregistré les déclarations d’entrevue.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,2 et micro ; Filtres pour seringuesM Fisher Scientific09-715Gmilieux de digestion de collagénase filtrants stériles
1,5 - 2,0 mL tubes à microcentrifuger (stériles)Fisher Scientific05-408-129contenant des cellules remises en suspension et/ou un mélange d’homogénat de cerveau
100 & micro ; Filtres à cellules MCorning431752Filtrer l’homogénat du cerveau
100 uL Seringues étanches au gaz avec aiguilles de calibre 25Hamilton81001 & 90525Pour injecter un mélange de greffon dans des animaux receveurs (1 par génotype/condition de donneur)
1000 uL pointes de pipette + pipette--transfert de cellules/mélanges/tissus
15 mL Tube en polypropylèneFalcon (Corning)352196stockage du mélange d’homogénat cérébral, ou cellule : mélange d’homogénat pour la transplantation
40 & micro ; Filtres à cellulesM Corning431750organoïdes filtrants après lavage de la pastille cellulaire
Tubes en polypropylène de 50 mLFisher Scientific05-539-6pour la digestion de la collagénase du tissu de la glande mammaire donneuse
Boîtes de 60 mm ThermoScientific130181pour hacher les tissus
Sulfate d’alun de potassiumSigma-Aldrich243361/237086coloration de la glande mammaire monture entière lames
Vaporisateur d’anesthésie à usage vétérinaire-suivre le protocole institutionnel
Bêta-dine ou iode-
Tube de culture en verre borosilicaté pour l’homogénéisationFisher Scientific14-961-26pour l’homogénéisation du cerveau (utiliser un tube approprié pour l’homogénéisateur)
CarminSigma-AldrichC6152/1022coloration de la glande mammaire Lames de montage entier
Appareil de comptagecellulaire--
Nettoyer les cages d’animaux pour la récupération--suivre le protocole institutionnel
Collagénase Type 3Worthington Biochemical Corp.LS004183digestion enzymatique de tissus de glandes mammaires hachés de rats donneurs
d’eau désionisée-pour solutions chimiques
DMEM/F12GIBCO11320033pour hacher les tissus, milieux de digestion de la collagénase et remettre en suspension les mélanges de cellules épithéliales
EDTA-mélange de monodispersion
Éthanol, 200 ProofDecon Labs2705/2701fixateur de lames mammaires entières, lavages de lames mammaires entières, nettoyage des sites d’incision chirurgicale (dilué)
Sérum de veau fœtal (FBS)Solution d’inactivationd’hyclone
Gaze--
Acide acétique glacialFisher ScientificA38-212utilisation pour fixateur de lames mammaires entières (acide acétique glaciaire 1:4 dans 100 % d’éthanol)
HBSSGIBCO-mélange monodispersion
Coussins chauffants--suivre le protocole institutionnel
Seaux à glace (x2)--
Incubateur avec rotation orbitale--doit être capable de maintenir 37° ; C, agitation à 220-225 tr/min (pour la digestion de la collagénase du tissu mammaire)
Anesthésie à l’isoflurane--suivre le protocole institutionnel
Microscope optique ou appareil photo numérique--visualisation de l’épithélium mammaire monté entier et/ou acquisition d’images
Homogénéisateur mécaniqueFisherScientific-TissueMiser ou modèles alternatifs
Huile minérale, pureSigma-Aldrich/ ACROS Organics8042-47-5stockage à long terme de la glande mammaire nettoyée montages entiers
Réservoirs d’oxygène pour vaporisateur d’anesthésie-suivre le protocole institutionnel
Serviettes en papier ou lingettes délicates--
Lames de microscope chargées positivementThermo ScientificP4981-001supports entiers de tissu de la glande mammaire
Postopératoire analgésique-Protocole institutionnel
BalanceMesures du poids corporel des animaux, dosage approprié des analgésiques
Rasoir-tondeuses électriques ou autres
Bocaux de coloration-minimum de 1 par lavage chimique, taille appropriée pour le nombre de lames, verre préféré
Champs stérilesIMCO4410-IMCutilisés lors de la transplantation
Ciseaux stériles et pinces x3 (autoclavés)--outils chirurgicaux autoclaves utilisés pour les donneurs et les receveurs
Seringues : 5 mL (ou plus)--pour la filtration stérile des milieux de digestion de la collagénase
TrypsineMélange monodispersique Worthington
Réceptacle de collecte des déchets pour liquides (coulés ou aspirés)- -
Applicateur de clip de plaie, clips et outil de retraitFine Science Tools12020-00Fermeture de l’incision cutanée sur le tampon interscapulaire blanc
XylenesFisher ScientificX3S-4nettoyage de la glande mammaire lames de montage entier après coloration

Références

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