Article de méthode

Microscopie de traction intégrée à la microfluidique pour la migration collective chimiotaxique

DOI :

10.3791/60415

⸱

13 octobre 2019

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1Department of Biomedical Sciences, Korea University, 2Department of Mechanical Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3Department of Environmental Health, Harvard T.H. Chan School of Public Health

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La migration collective des cellules dans le développement, la cicatrisation des plaies et la métastes du cancer est souvent guidée par les gradients des facteurs de croissance ou des molécules de signalisation. Décrit ici est un système expérimental combinant la microscopie de traction avec un système microfluidique et une démonstration de la façon de quantifier la mécanique de la migration collective sous gradient biochimique.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules modifient les schémas de migration en réponse aux stimuli chimiques, y compris les gradients des stimuli. La migration cellulaire dans la direction d'un gradient chimique, connu sous le nom de chimiotaxis, joue un rôle important dans le développement, la réponse immunitaire, la cicatrisation des plaies et les métastes cancéreuses. Alors que la chimiotaxie module la migration des cellules individuelles ainsi que des collections de cellules in vivo, la recherche in vitro se concentre sur la chimiotaxie unicellulaire, en partie en raison de l'absence des outils expérimentaux appropriés. Pour combler cette lacune, décrit ici est un système expérimental unique qui combine microfluidique et micropatterning pour démontrer les effets des gradients chimiques sur la migration cellulaire collective. En outre, la microscopie de traction et la microscopie de contrainte de monocouche sont incorporées dans le système pour caractériser des changements dans la force cellulaire sur le substrat aussi bien qu'entre les cellules voisines. Comme preuve de concept, la migration des îles circulaires micropatternées des cellules canines de madin-Darby (MDCK) est testée sous un gradient de facteur de croissance d'hépatocyte (HGF), un facteur de diffusion connu. On constate que les cellules situées près de la concentration plus élevée de HGF migrent plus rapidement que celles du côté opposé à l'intérieur d'une île cellulaire. Dans la même île, la traction cellulaire est similaire des deux côtés, mais le stress intercellulaire est beaucoup plus faible sur le côté de la concentration plus élevée de HGF. Ce nouveau système expérimental peut offrir de nouvelles possibilités d'étudier la mécanique de la migration chimiotaxique par les collectifs cellulaires.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La migration cellulaire dans les systèmes biologiques est un phénomène fondamental impliqué dans la formation des tissus, la réponse immunitaire, et la cicatrisation des plaies1,2,3. La migration cellulaire est également un processus important dans certaines maladies comme le cancer4. Les cellules migrent souvent en groupe plutôt qu'individuellement, ce qui est connu sous le nom de migration cellulaire collective4,5. Pour que les cellules se déplacent collectivement, la détection du microenvironnement est essentielle6. Par exemple, les cellules perçoivent les stimuli physicochimiques et réagissent en changeant la motilité, les interactions cellule-substrat et les interactions cellule-cellule, entraînant une migration directionnelle le long d'un gradient chimique7,8, 9,10. Sur la base de cette connexion, des progrès rapides ont été réalisés dans les technologies de laboratoire sur puce qui peuvent créer des microenvironnements chimiques bien contrôlés tels que le gradient d'un chimioattractant11,12,13 . Alors que ces microfluidiques à base de laboratoire sur puce ont déjà été utilisés pour étudier la chimiotaxie de l'ensemble cellulaire ou sphéroïdes cellulaires14,15,16,17, ils ont été utilisés principalement dans le contexte de la migration unicellulaire18,19,20,21. Mécanismes sous-jacents à une réponse collective cellulaire à un gradient chimique n'est toujours pas bien compris14,22,23,24,25,26 . Ainsi, le développement d'une plate-forme qui permet le contrôle spatiotemporel des facteurs solubles ainsi que l'observation in situ de la biophysique des cellules aidera à démêler les mécanismes derrière la migration cellulaire collective.

Développé et décrit ici est un système microfluidique multicanal qui permet la génération d'un gradient de concentration de facteurs solubles qui module la migration des amas de cellules à motifs. Dans cette étude, le facteur de croissance des hépatocytes (HGF) est choisi pour réguler le comportement migratoire des cellules canines de madin-Darby (MDCK). HGF est connu pour atténuer l'intégrité cellulaire et améliorer la motilité des cellules27,28. Dans le système microfluidique, Fourier transforme la microscopie de traction et la microscopie de contrainte de monocouche sont également incorporées, qui permet d'analyser la motilité, la force contractile, et la tension intercellulaire induite par les cellules constituantes en réponse à un HGF inclinaison. Dans la même île, les cellules situées près de la concentration plus élevée de HGF migrent plus rapidement et montrent des niveaux de stress intercellulaire plus faibles que ceux sur le côté avec une concentration plus faible de HGF. Les résultats suggèrent que ce nouveau système expérimental est approprié pour explorer d'autres questions dans les domaines impliquant la migration cellulaire collective sous des gradients chimiques de divers facteurs solubles.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

REMARQUE : Lithographie des moules SU-8 pour pochoirs (épaisseur de 250 m) et des pièces microcanaux (épaisseur de 150 m), gravure en verre (profondeur de 100 m) et fabrication de moulages ont été externalisées en envoyant des dessins à l'aide d'un logiciel de conception assisté par ordinateur aux fabricants.

1. Fabrication de pochoir et microcanal en polydiméthylsiloxane (PDMS)

  1. Concevoir le micromotif du pochoir et du microcanal.
  2. Fabriquer ou externaliser les moules SU-8 (épaisseur de 250 m pour les pochoirs et de 150 m pour les microcanaux) sur des plaquettes de silicium (4 po de diamètre).
  3. Préparer le mélange PDMS en mélangeant l'élastomère de base et l'agent de durcissement à un rapport de 10:1.
    1. Placer 15 ml de l'élastomère de base dans un tube conique de 50 ml et ajouter 1,5 ml d'agent de durcissement. Préparez-en deux.
    2. Vortex le mélange PDMS pendant 5 min. Centrifuger le mélange PDMS à 196 x g pendant 1 min pour enlever les bulles.
  4. Pour fabriquer le pochoir PDMS, versez 1 ml du mélange PDMS sur la plaquette, tout en évitant les régions à motifs SU-8 de sorte que le PDMS touche le côté des piliers SU-8, mais pas le haut du modèle SU-8.
    1. Placer la plaquette sur une surface plane pendant plus de 30 min à température ambiante (RT). Faire le PDMS dans un four sec à 80 oC pendant plus de 2 h.
    2. Épluchez soigneusement le PDMS du moule SU-8 et coupez la fine membrane PDMS à l'aide d'un poinçon creux de 14 mm. Retirez la poussière à la surface des morceaux de PDMS à l'aide de ruban adhésif et autoclavez les pochoirs PDMS.
  5. Pour fabriquer le microcanal PDMS, versez 30 ml de mélange PDMS sur le moule SU-8.
    1. Dégazer pendant 30 min dans une chambre à vide et guérir le PDMS dans un four sec à 80 oC pendant plus de 2 h.
    2. Épluchez soigneusement le PDMS du moule SU-8 et coupez le PDMS à une taille de 24 mm x 24 mm. Dans chaque bloc PDMS, créez une prise et trois entrées à l'aide d'un poinçon de biopsie de 1 mm.

2. Préparation du verre de fond avec le gel de polyacrylamide (PA)

  1. Fabriquer ou externaliser des lunettes à glissière rectangulaire (24 mm x 24 mm x 1 mm) avec un micro-puits rectangulaire (6 mm x 12 mm, 100 m de profondeur29) par des verres de coupe et de gravure.
  2. Silaniser la surface d'un verre de fond30.
    1. Préparer une solution de silane de liaison en mélangeant 200 ml d'eau déionisée (DIW), 80 l d'acide acétique et 50 l de 3-(trimethoxysilyl) propyl methacrylate (TMSPMA) pendant 1 h.
      CAUTION: TMSPMA est un liquide combustible. Suivez les recommandations dans les fiches de données sur la sécurité des matériaux. Utiliser uniquement dans une hotte de fumée chimique.
    2. Retirer la poussière de la surface du verre par du ruban adhésif et autoclave le verre.
    3. Couvrir la surface gravée du verre inférieur avec 100 l de la solution de silane de liaison et laisser le verre à RT pendant 1 h.
    4. Rincer le verre avec DIW 3x et laisser sécher le verre à température ambiante ou en soufflant de l'air.
  3. Préparer une solution de gel pour le gel PA31.
    1. Préparer une solution fraîche de 0,5 % (w/v) persulfate d'ammonium (APS) en dissolvant 5 mg d'APS dans 1 ml de DIW.
    2. Préparer la solution de gel PA composée de 138 l de 40 % de solution d'acrylamide, de 101 l de solution bis-acrylamide de 2 %, de 5 l de solution de particules fluorescentes (0,2 m) et de 655 l de DIW.
      CAUTION : Les solutions d'acrylamide et de bisacrylamide sont toxiques. Portez des gants de protection, des vêtements et une protection oculaire. Protégez la solution de gel PA contenant des particules fluorescentes de la lumière.
      REMARQUE : Vortex la solution de perle fluorescente avant le tuyauterie pour obtenir un nombre uniforme de perles fluorescentes par lot.
    3. Après l'ajout de 100 L de la solution APS et de 1 L de tétramethylethylenediamine (TEMED), transférer 10 L de solution de gel mixte sur le micro-puits rectangulaire, et placer sur le dessus un bordereau circulaire (18 mm).
      REMARQUE : Pour remplir le verre inférieur avec du gel PA sans bulles, placez une solution de gel suffisante sur la rainure du verre inférieur, faites glisser soigneusement la glissière de couverture sur la solution de gel et enlevez toute solution de gel excédentaire.
      CAUTION: Le gel est lentement durci pendant environ 40 min. La procédure suivante pour les gels centrifiants doit être effectuée dès que possible.
    4. Retourner l'assemblage du verre personnalisé, la solution de gel, et le bordereau, puis centrifugeuse pendant 10 min à 96 x g pour apporter des particules fluorescentes à la couche supérieure du gel PA.
    5. Retirez l'assemblage de la centrifugeuse et placez-le sur la surface plane avec la couverture vers le bas.
      REMARQUE : En commençant par l'étape 2.3.6, manipulez des échantillons dans une armoire de biosécurité.
    6. Après 30 min, retourner l'assemblage et le placer dans un plat Petri de 35 mm, remplir de 2 ml de DIW, et (à l'aide de forceps) retirer délicatement le bordereau en le glissant d'un côté.
      REMARQUE : Le gel PA durci peut être stocké dans Le DIW pendant 1 mois. Cependant, une fois que le collagène est enduit sur le gel PA, il doit être utilisé dans une expérience dans un délai de 1 jour.
  4. Enrober le collagène sur le gel PA.
    1. Dissoudre 1 mg/mL sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoate (sulfo-SANPAH) dans un tampon HEPES chaud de 50 mM. Déposer 200 l de la solution sur la surface du gel et activer par la lumière UV (365 nm longueur d'onde) pendant 10 min.
      REMARQUE : Protégez le sulfo-SANPAH de la lumière.
    2. Rincer le gel avec 0,1 M [4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acide; HEPES] tampon 2x et avec PBS 1x.
    3. Enrober le gel PA d'une solution de collagène (100 g/mL en PBS, collagène de queue de rat de type I) à 4 oC pendant la nuit. Le lendemain, lavez-vous avec PBS 3x.

3. Micropatterning des îles cellulaires

  1. Préparer la solution F-127(Table of Materials) [2 % (w/v) en PBS] et immerger le pochoir PDMS autoclaved dans la solution F-127. Conservez-le dans un incubateur de 37 oC pendant 1 h.
  2. Préparer la solution cellulaire (2 x 106 cellules/mL) dans les milieux de culture cellulaire composés de : le milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % d'antibiotique-antimycotique (AA).
  3. Laver le pochoir PDMS avec PBS 3x et retirer le liquide du pochoir PDMS et du gel PA. Placez le pochoir PDMS sur le gel PA et ajoutez du PBS au pochoir.
  4. Enlever les bulles dans les trous du pochoir PDMS en pipetting doucement. Après avoir enlevé les bulles, retirer le PBS de la surface du pochoir PDMS.
  5. Après avoir mis 200 L de solution cellulaire sur le pochoir PDMS, garder le gel PA dans un incubateur pendant 1 h afin que les cellules se fixent au gel PA.
  6. Lavez doucement la solution cellulaire avec des supports de culture cellulaire, retirez le pochoir PDMS et ajoutez plus de supports de culture cellulaire. Vérifier la formation d'îles cellulaires au microscope.

4. Assemblage du gel PA avec microcanal PDMS

  1. Retirez la poussière sur le microcanal PDMS à l'aide de ruban adhésif, puis autoclave.
  2. Traiter la surface du microcanal PDMS avec du plasma d'oxygène (80 W, 50 kHz) pendant 30 s.
  3. Après avoir enlevé tout liquide sur le verre de fond rempli de gel PA, placez le microcanal PDMS sur le dessus du verre inférieur et placez l'assemblage sur le support de verre personnalisé.
  4. Remplissez le microcanal avec le milieu de culture cellulaire.
    CAUTION: Assurez-vous d'enlever toutes les bulles emprisonnées dans les canaux en rinçant doucement les médias chauds avec une pipette. En outre, tout en enlevant les bulles, assurez-vous de ne pas détacher les îles de cellules micropatternées.

5. Système microfluidique intégré

  1. Connectez les tubes.
    1. Préparer les connecteurs en coupant la pointe des aiguilles (18 G) et en la pliant à 90 degrés.
    2. Préparer les tubes pour trois entrées et une prise.
      1. Pour les tubes d'inlet, connectez l'aiguille taillée et une ligne de mini-volume de 30 cm à un stopcock à trois voies. Préparez-en trois.
      2. Pour les tubes de sortie, connectez l'aiguille taillée et une ligne de mini-volume de 75 cm avec un stopcock à trois voies. Préparez-en un.
      3. Remplir les tubes avec le milieu qui a été préchauffé pendant 1 h.
        CAUTION: Assurez-vous d'enlever toutes les bulles emprisonnées dans les lignes de tuyauterie en rinçant doucement les médias chauds avec une seringue.
    3. Préparer les réservoirs en enlevant les plongeurs des seringues et en connectant les tubes d'inlet.
    4. Branchez les connecteurs d'aiguilles de chaque ligne de tubes dans les trois entrées et une prise de l'appareil microfluidique.
  2. Remplir les réservoirs de 3 ml de milieu frais ou de milieu conditionné chacun.
    1. Pour l'essai de gradient, remplissez le réservoir d'aneth gauche avec 20 ng/mL HGF dans le milieu de culture cellulaire.
    2. Pour la visualisation du gradient de concentration, ajouter un colorant fluorescent de 200 g/mL (rhodamine B-dextran, 70 kDa) au réservoir d'aneth gauche.
    3. Connectez la ligne de tuyauterie à une pompe à seringues.
      REMARQUE : Le mode de fonctionnement de la pompe à seringues est le « retrait ». Le débit est modifié en fonction de la capacité de la seringue et de la vitesse de fonctionnement de la pompe à seringues.
  3. Placez le système microfluidique intégré sur la scène d'un microscope épifluorescent conventionnel.
    CAUTION: Pour générer un gradient doux de HGF dans le canal microfluidique, le débit doit être aussi lent que 0,1 L/min. Ceci est suffisamment sensible pour qu'il nécessite une stabilisation pendant 2 h, et il faut prendre soin d'éviter les perturbations physiques pendant l'expérience.

6. Acquisition d'images

  1. Prenez des images toutes les 10 min pendant jusqu'à 24 h à l'aide d'un microscope automatisé logé dans un incubateur. À chaque moment, prenez un ensemble d'images à l'aide d'une lentille objective 4x dans trois canaux différents, y compris l'image de phase pour visualiser la migration cellulaire, l'image fluorescente verte pour visualiser les perles fluorescentes incorporées dans le gel PA, et l'image fluorescente rouge pour visualiser le gradient de concentration d'un produit chimique.
  2. Après avoir pris des images en time-lapse, infusez la solution trypsin-EDTA de 0,25 % dans des microcanaux pour détacher les cellules du gel PA. Après avoir complètement retiré les cellules du gel, prendre une image fluorescente verte pour être utilisé comme une image de référence pour la microscopie de traction.

7. Analyse des données

REMARQUE: Un code personnalisé pour l'analyse des données a été développé à l'aide de MATLAB, et les détails ont été décrits ailleurs32,33,34,35,36.

  1. Pour l'analyse de phase-image, calculer les déplacements en deux images de phase consécutives à l'aide de la vélocimétrie d'image de particules36.
  2. Pour fourier transformer la microscopie de traction, comparez chaque image fluorescente verte avec l'image de référence et calculez les déplacements dans chaque image à l'aide de la vélocimétrie d'image de particules36. Des déplacements, récupérer la traction faite par les cellules sur le gel DE PA utilisant la microscopie de traction de transformation Fourier33,34,37.
  3. À partir des données de traction, calculez le stress dans la monocouche de l'île cellulaire à l'aide de la microscopie de stress monocouche basée sur les méthodes d'élément fini32,34,38.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour explorer la migration collective sous un gradient chimique, un système microfluidique a été intégré à la microscopie de traction (Figure 1). Pour construire le système intégré, le gel de polyacrylamide (PA) a été jeté sur le verre fait sur commande, et les cellules de MDCK ont été ensemiées dans les îles micropatterned faites par un pochoir de PDMS. Pour cette expérience, douze îles de cellules MDCK (quatre rangées par trois colonnes, diamètre de 700 m) ont été créées. Après que les cel...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La migration collective des cellules constituantes est un processus important pendant le développement et la régénération, et la direction de migration est souvent guidée par le gradient chimique des facteurs de croissance4,23. Pendant la migration collective, les cellules continuent d'interagir avec les cellules voisines et les substrats sous-jacents. De telles interactions mécaniques donnent lieu à des phénomènes émergents tels que le durotaxis

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par la subvention de la National Research Foundation of Korea (NRF) financée par le gouvernement coréen (MSIP) (No. NRF-2017R1E1A1A01075103), Korea University Grant et le programme BK 21 Plus. Il a également été soutenu par les National Institutes of Health (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL007118, R01EY019696).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,25 % trypsine-EDTA (1X)Gibco25200-056
1 M HEPES solution tamponGibco15630-056
1 mm Poinçon de biopsieIntegra Miltex33-31AA-P/25
100 mm Boîtes de PétriSPL10100100 mm de diamètre, 15 mm de hauteur
14 mm poinçon creuxILJIN124-0571
18 mm & Oslash ; LamelleMarienfeld-Superior111580Circulaire 18 mm, épaisseur n° 1 (0,13 à 0,16 mm)
solution de bis-acrylamide à 2 %Bio-Rad1610142Porter des gants de protection, des vêtements et des lunettes de protection.
3-(Trimethoxysilyl)méthacrylate de propyle (TMSPMA)Sigma-Aldrich440159-500ML
Robinet d’arrêt 3 voiesHyupsungHS-T-61NATTENTION : ne pas utiliser si préalablement ouvert. ne pas resterliser ou réutiliser
la ligne de volume minimum de 30 cm (pour pédiatrique)HyupsungHS-MV-30ATTENTION : ne pas utiliser si préalablement ouvert. ne pas stériliser ou réutiliser
boîte de culture cellulaire de 35 mmCorning
solution d’acrylamide à 40 %Bio-Rad1610140Portez des gants de protection, des vêtements et des lunettes de protection.
Ligne de volume minimum de 75 cm (pour pédiatrie)HyupsungHS-MV-75ATTENTION : ne pas utiliser si préalablement ouvert. ne pas stériliser ou réutiliser
l’acide acétiqueJ.T. BakerJT9508-03
Persulfate d’ammonium (APS)Bio-Rad1610700
Antibiotique-antimycosiqueGibco15240-062
Puce de verreinférieure MicroFIT24 x 24 x 1 mm, sur mesure, rainure rectangulaire (6 x 12 mm, profondeur : 100 &mu ; m)
Collagène de type I, queue de ratCorning354236
Porte-verre personnaliséHan-Gug Mechatronics
Modified Eagle’s Medium (DMEM)WelgeneLM 001-11
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)BiowestL0615-500w/o Magnésium, Calcium
Sérum fœtal bovin (FBS)Gibco26140-179
FluoSpheres Microsphères modifiées aux aminesInvitrogenF87640.2 µ ; m, fluorescent jaune-vert(505/515)
Facteur de croissance hépatocytaire (HGF)Sigma-AldrichH1404-5UGrecombinant, stade JuLI humain
système d’imagerie de cellules vivantesNanoEnTek InAutomated X-Y-Z stage et imagerie fluorsente Compatible avec l’incubateur (37 ° ; C et 5 % de CO2)
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK)cell type II
Système plasma d’oxygèneFemto ScienceCUTE-MPR
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443-250G
Rhodamine B isothiocyanate&ndash ; dextranSigma-AldrichR9379-100MG70 kDa, utilisé pour estimer la distribution spatio-temporelle de HGF dans le canal microfluidique
Aiguille hypodermique Steril 18 GKOVAXCoupez la pointe de l’aiguille et pliez-la à 90 degrés pour connecter les ports d’entrée/sortie avec la ligne de volume
Ruban adhésif3M/Scotch810D33 m x 19 mm
Moules maîtres SU-8MicroFIT4 pouces diamètre,
sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH)Thermo Scientific22589Conserver à -20° ;C. Conserver à l’abri de l’humidité et de la lumière.
Sylgard 184 Kit élastomèreDow CorningPDMS
Pompe à seringueChemyx Inc.modèle fusion 720liquide de prélèvement
SeringuesKOVAX1, 3, 5, 10 ou 50 cc pour l’utilisation du réservoir d’entrée ou de la pompe à seringue de sortie
tétraméthyléthylènediamine (TEMED)Bio-Rad1610800Porter des gants, des vêtements et des lunettes de protection.
Lampe ultraviolette (UV)UVP LLC95-0248-02Longueur d’onde 365 nm
la 430165 Dulbecco’s

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Microfluidic ChipChemotactic MigrationCollective Cell MigrationMonolayer Stress MicroscopyHepatocyte Growth FactorMadin Darby Canine Kidney CellsPDMS StencilPolyacrylamide GelFluorescent Beads

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