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Analyse du SSHHP Viral du Groupe IV utilisant des méthodes in vitro et in Silico

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DOI :

10.3791/60421

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21 décembre 2019

 ,  , 
1National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, 2United States Naval Research Laboratory

Dans cet article

Résumé

Nous présentons un protocole général pour identifier de courtes étendues des séquences homologues de protéine d'hôte-pathogène (SSHHPS) incorporées dans la polyprotéine virale. Le SSHHPS est reconnu par les protéases virales et dirige la destruction ciblée de protéines hôtes spécifiques par plusieurs virus du groupe IV.

Résumé

Les enzymes alphavirales sont synthétisées en un seul polypeptide. La polyprotéine non structurelle (nsP) est traitée par sa protéase de cystéine nsP2 pour produire des enzymes actives essentielles à la réplication virale. Les protéases virales sont très spécifiques et reconnaissent les séquences de motifs de site de clivage conservés (6-8 acides aminés). Dans plusieurs virus du groupe IV, les séquences de motifs du site de clivage nsP peuvent être trouvées dans des protéines hôtes spécifiques impliquées dans la génération des réponses immunitaires innées et, dans certains cas, les protéines ciblées semblent être liées au phénotype induit par le virus. Ces virus utilisent de courtes étendues de séquences de protéines homologues hôte-pathogène (SSHHPS) pour la destruction ciblée des protéines hôtes. Pour identifier SSHHPS les séquences virales de motif de clivage de clivage de protéase peuvent être entrées dans BLAST et les génomes d'hôte peuvent être recherchés. Le clivage peut d'abord être testé à l'aide des substrats purifiés de protéase virale nsP et de transfert d'énergie par résonance fluorescence (FRET) fabriqués dans E. coli. Les substrats FRET contiennent des protéines fluorescentes cyan et jaune et la séquence du site de clivage (CFP-séquence-YFP). Cet analyse de protéase peut être utilisé en continu dans un lecteur de plaque ou discontinu dans les gels SDS-PAGE. Des modèles des substrats de peptide liés peuvent être générés en silico pour guider la sélection des substrats et les études de mutagénèse. Des substrats CFP/YFP ont également été utilisés pour identifier les inhibiteurs de la protéase. Ces méthodes in vitro et in silico peuvent être utilisées en combinaison avec des tests cellulaires pour déterminer si la protéine hôte ciblée affecte la réplication virale.

Introduction

Les preuves de transfert horizontal de gènes d'un virus à l'hôte, ou d'un hôte à un virus, peuvent être trouvées dans une variété de génomes1,2,3,4. Des exemples d'endogène virale sont les séquences de l'espaceur CRISPR trouvées dans les génomes de l'hôte bactérien4. Récemment, nous avons trouvé des preuves de séquences de protéines hôtes incorporées dans les polyprotéines non structurelles des virus du groupe IV de l'ARNd. Ces séquences dans les régions codantes du génome viral peuvent être propagées de génération en génération. Les courtes étendues de séquences de protéines homologues hôte-pathogène (SSHHPS) se trouvent dans le virus et l'hôte5,6. SSHHPS sont les séquences de motif de site de clivage conservés reconnues par les protéases virales qui ont l'homologie aux protéines hôtes spécifiques. Ces séquences dirigent la destruction de protéines hôtes spécifiques.

Dans notre publication précédente6, nous avons compilé une liste de toutes les protéines hôtes qui ont été ciblées par les protéases virales et a constaté que la liste des cibles n'était pas aléatoire (tableau 1). Deux tendances étaient évidentes. Tout d'abord, la majorité des protéases virales qui ont coupé les protéines de l'hôte appartenaient à des virus du groupe IV (24 des 25 cas concernaient des protéases virales du groupe IV), et une protéase appartenait aux rétrovirus du groupe VI (VIH, virus de l'immunodéficience humaine)7. Deuxièmement, les cibles de protéine d'hôte étant coupées par les protéases virales ont été généralement impliquées en générant les réponses immunitaires innées suggérant que les clivages étaient destinés à contrarier les réponses immunitaires de l'hôte. La moitié des protéines hôtes visées par les protéases virales étaient des composants connus des cascades de signalisation qui génèrent de l'interféron (IFN) et des cytokines proinflammatoires(tableau 1). D'autres ont été impliqués dans la transcription de cellule hôte8,9,10 ou la traduction11. Fait intéressant, Shmakov et coll.4 ont montré que de nombreuses séquences protospacer CRISPR correspondent à des gènes impliqués dans la conjugaison ou la réplication du plasmide4.

Le groupe IV comprend, entre autres, Flaviviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Calciviridae et Togaviridae. Plusieurs pathogènes nouveaux et émergents appartiennent au groupe IV, comme le virus Zika (ZIKV), le Nil occidental (VNO), le chikungunya (CHIKV), le virus du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS) et le virus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS). Le génome de l'ARNm est essentiellement un morceau d'ARNm. Pour produire les enzymes nécessaires à la réplication du génome, le génome de l'ARNmdoit doit d'abord être traduit. Dans les alphavirus et autres virus du groupe IV, les enzymes nécessaires à la réplication sont produites en une seule polyprotéine (c.-à-d., nsP1234 pour VEEV). La polyprotéine non structurelle (nsP) est traitée protéolytiquement (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) par la protéase nsP2 pour produire des enzymes actives12 (figure 1). Le clivage de la polyprotéine par la protéase nsP2 est essentiel pour la réplication virale; ceci a été démontré par la suppression et la mutagénèse site-dirigée de la cystéine active de site de la protéase nsP213,14. Notamment, la traduction des protéines virales précède les événements de réplication du génome. Par exemple, nsP4 contient la polymérase d'ARN dépendante de l'ARN nécessaire pour reproduire le génome de l'ARNsde. La réplication du génome peut produire des intermédiaires dsRNA; ces intermédiaires peuvent déclencher les réponses immunitaires innées de l'hôte. Ainsi, ces virus peuvent couper l'hôte des protéines de réponse immunitaire innées au début de l'infection afin de supprimer leurs effets15,16,17.

Le silençage peut se produire au niveau de l'ADN, de l'ARN et des protéines. Ce qui est commun à chacun des mécanismes de silençage montrés dans la figure 1, c'est que de courts séquences d'ADN, d'ARN ou de protéines étrangères sont utilisées pour guider la destruction de cibles spécifiques afin de contrarier leur fonction. Les mécanismes de silence sont analogues aux programmes de « recherche et suppression » qui ont été écrits en trois langues différentes. La courte séquence du site de clivage est analogue à un « mot clé ». Chaque programme a une enzyme qui reconnaît la correspondance entre la séquence courte (le «mot clé») et un mot dans le «fichier» qui doit être supprimé. Une fois qu'une correspondance est trouvée, l'enzyme coupe (« supprime ») la séquence cible plus grande. Les trois mécanismes présentés à la figure 1 sont utilisés pour défendre l'hôte contre les virus ou pour défendre un virus contre le système immunitaire d'un hôte.

Les protéases virales reconnaissent les courtes séquences de motifs de site de clivage entre les acides aminés de 2-11 ; dans les nucléotides, cela correspondrait à 6-33 bases. À titre de comparaison, les séquences d'espaceurs CRISPR sont des nucléotides de 26 à 72 et les ARNi sont des nucléotides de 20-2218,19. Bien que ces séquences soient relativement courtes, elles peuvent être reconnues spécifiquement. Compte tenu de la plus grande diversité d'acides aminés, la probabilité d'un événement de clivage aléatoire est relativement faible pour une protéase virale reconnaissant des séquences protéiques de 6-8 acides aminés ou plus. La prédiction du SSHHPS dans les protéines hôtes dépendra en grande partie de la spécificité de la protéase virale examinée. Si la protéase a des exigences strictes de spécificité de séquence la chance de trouver une séquence de site de clivage est 1/206 - 1 dans 64 millions ou 1/208 - 1 dans 25.6 milliards ; cependant, la plupart des protéases ont des tolérances sous-sites variables (p. ex., R ou K peuvent être tolérés sur le site S1). Par conséquent, il n'y a aucune exigence d'identité de séquence entre les séquences trouvées dans l'hôte par rapport au virus. Pour les protéases virales qui ont des exigences de séquence plus lâches (comme celles appartenant à Picornaviridae), la probabilité de trouver un site de clivage dans une protéine hôte peut être plus élevée. Bon nombre des inscriptions au tableau 1 proviennent de la famille Picornaviridae.

Schechter et Berger notation20 est couramment utilisé pour décrire les résidus dans un substrat de protéase et les sous-sites auxquels ils se lient, nous utilisons cette notation tout au long. Les résidus dans le substrat qui sont N-terminal de la liaison scissile sont désignés comme P3-P2-P1 tandis que ceux qui sont C-terminal sont désignés comme P1'-P2'-P3'. Les sous-sites correspondants dans la protéase qui lient ces résidus d'acides aminés sont S3-S2-S1 et S1'-S2'-S3', respectivement.

Pour déterminer quelles protéines hôtes sont ciblées, nous pouvons identifier Le SSHHPS dans les sites de clivage polyprotéine virale et rechercher les protéines hôtes qui les contiennent. Ici, nous dénoncons des procédures pour identifier SSHHPS utilisant les séquences connues de site de clivage de protéase virale. Les méthodes bioinformatiques, les essais de protéase, et dans les méthodes de silico décrites sont destinées à être utilisées en conjonction avec des essais cellulaires.

Les alignements séquences des protéines hôtes ciblées par les protéases virales ont révélé des différences spécifiques aux espèces au sein de ces courtes séquences de sites de clivage. Par exemple, la protéase nsP2 du virus de l'encéphalite équine vénézuélienne (VEEV) a été trouvée pour couper trim14 humain, un motif tripartite (TRIM) protéine6. Certaines protéines TRIM sont des facteurs de restriction virale (par exemple, TRIM521), la plupart sont considérés comme des ligases e3 d'ubiquitine. TRIM14 n'a pas de ring (vraiment intéressant nouveau gène) domaine et n'est pas considéré comme un E3 ligase22. TRIM14 a été proposé pour être un adaptateur dans le signalosome antiviral mitochondrial (MAVS)22, mais peut avoir d'autres fonctions antivirales23. L'alignement des séquences TRIM14 de diverses espèces montre que les équidés n'ont pas le site de clivage et abritent une version tronquée de TRIM14 qui manque le domaine C-terminal PRY/SPRY. Ce domaine contient un site de polyubiquitination (Figure 2). Chez les équines, ces virus sont très mortels (mortalité de 20 à 80 %) alors que chez l'homme, seulement 1 % meurent des infections à VEEV24. Le clivage du domaine PRY/SPRY peut court-circuiter transitoirement la cascade de signalisation MAVS. Cette cascade peut être déclenchée par dsRNA et conduit à la production d'interféron et de cytokines pro-inflammatoires. Ainsi, la présence du SSHHPS peut être utile pour prédire quelles espèces ont des systèmes de défense contre des virus spécifiques du groupe IV.

Dans les virus du groupe IV, on pense que les mécanismes d'antagonisme de l'IFN se multiplient redondants25. Le clivage protéique hôte peut être transitoire pendant l'infection et les concentrations peuvent se rétablir avec le temps. Nous avons constaté dans les cellules que les produits de clivage TRIM14 pouvaient être détectés très tôt après la transfection (6 h) avec un plasmide codant la protéase (promotrice de cytomégalovirus). Cependant, à de plus longues périodes, les produits de clivage n'ont pas été détectés. Dans les cellules infectées par le virus, la cinétique était différente et les produits de clivage pouvaient être détectés entre 6-48 h6. D'autres ont rapporté l'apparition de produits de clivage de protéine d'hôte dès 3-6 h après l'infection9,11.

L'activité protéolytique dans les cellules est souvent difficile à attraper; les produits de clivage peuvent varier dans leur solubilité, concentration, stabilité, et durée de vie. Dans les analyses cellulaires, on ne peut pas supposer que les produits de clivage s'accumuleront dans une cellule ou que les intensités de la bande de protéines coupées et non coupées montreront des augmentations et des diminutions compensatoires, car la protéine coupée peut être dégradée très rapidement et ne peut pas être détectable dans une tache occidentale à un poids moléculaire prévu (MW) (p. ex., la région contenant l'épitope pourrait être coupée par d'autres protéases hôtes). Si le substrat de la protéase virale est une protéine de réponse immunitaire innée, sa concentration peut varier pendant l'infection. Par exemple, certaines protéines de réponse immunitaire innées sont présentes avant l'infection virale et sont induites davantage par l'interféron26. La concentration de la protéine cible peut donc fluctuer pendant l'infection et la comparaison des lysates cellulaires non infectés par rapport aux cellules infectées peut être difficile à interpréter. En outre, toutes les cellules peuvent ne pas être uniformément transfectées ou infectées. Les essais de protéase in vitro utilisant des protéines purifiées de E. coli d'autre part ont moins de variables pour lesquelles contrôler et de telles analyses peuvent être faites en utilisant SDS-PAGE plutôt que des immunoblots. Les protéases contaminantes peuvent être inhibées dans les premières étapes de la purification des protéines du substrat CFP/YFP, et les protéases virales mutées peuvent être purifiées et testées comme témoins pour déterminer si le clivage est dû à la protéase virale ou à une protéase bactérienne contaminante.

Une limitation des essais de protéase in vitro est qu'ils n'ont pas la complexité d'une cellule de mammifères. Pour qu'une enzyme coupe son substrat, les deux doivent être co-localisés. Les protéases virales du groupe IV diffèrent dans la structure et la localisation. Par exemple, la protéase ZIKV est incorporée dans la membrane du réticulum endoplasmique (ER) et fait face au cytosol, tandis que la protéase VEEV nsP2 est une protéine soluble dans le cytoplasme et le noyau27. Certaines des séquences de site de clivage trouvées dans l'analyse de ZIKV SSHHPS étaient dans des peptides de signal suggérant que le clivage pourrait se produire co-traductionnellement pour quelques cibles. Ainsi, l'emplacement de la protéase et le substrat dans la cellule doivent également être pris en compte dans ces analyses.

Les tests cellulaires peuvent être utiles pour établir un rôle pour la protéine hôte identifiée dans l'infection. Les méthodes qui visent à arrêter le clivage de protéase virale des protéines hôtes telles que l'ajout d'un inhibiteur de la protéase6 ou une mutation dans la cible hôte16 peuvent être utilisés pour examiner leurs effets sur la réplication virale. La surexpression de la protéine ciblée peut également affecter la réplication virale28. Les essais de plaque ou d'autres méthodes peuvent être utilisés pour quantifier la réplication virale.

Protocole

1. Bioinformatique : Identification du SSHHPS dans le génome de l'hôte à l'aide de BLAST

REMARQUE: Protein BLAST peut être trouvé à blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.

  1. Entrée 20 acides aminés entourant le lien scissile dans la polyprotéine virale. Sélectionnez des séquences et des types de protéines non redondants dans le génome de l'hôte à rechercher (p. ex., Homo sapiens).
    1. Si nécessaire, sélectionnez PHI-BLAST. Tapez une séquence de motifs (p. ex., pour les 25 résidus de V12 indiqués ci-dessous, entrez le modèle « AG » sans guillemets).

      figure-protocol-1

      REMARQUE: Dans PHI-BLAST, les supports carrés [XY] indiquent que l'acide aminé X ou Y peut se siégatiser à la position du sous-site (p. ex., AG[AC][GAY]).
    2. Inspecter les résultats de BLAST et identifier les résultats qui ont une identité de séquence élevée aux résidus qui sont conservés dans les sites de clivage polyprotéine (p. ex., protéine motif tripartite 14) (Figure 3).
      REMARQUE: Pour les protéases sérines une conservation plus élevée des résidus de P1 est prévu, tandis que pour les protéases cystéines une conservation plus élevée des résidus de P2 est prévu.
    3. Colorer les résidus identiques à une séquence de site de clivage et qui sont en ordre séquentiel (pas de lacunes). Colorer les résidus tolérés au sous-site, mais présents dans un site de clivage différent dans une seconde couleur.
      REMARQUE: Des résidus qui représentent des substitutions conservatrices (p. ex., Leu c. Val) qui ne sont pas présents dans un site de clivage viral peuvent également être trouvés et peuvent ou non être reconnus par la protéase virale.
    4. Classez l'ordre blast en fonction du nombre de résidus identiques ou tolérés consécutifs qui correspondent à une séquence de site de clivage. Dans la liste, sélectionnez les protéines contenant 6 résidus identiques ou similaires pour les analyser dans les essais de protéase.
    5. Répétez la procédure pour les autres sites de clivage (nsP2/3, nsP3/4, etc.) et renforcez progressivement la prédiction en ajoutant des résidus plus fortement conservés au modèle PHI-BLAST.

2. Essais in vitro: Conception et préparation de substrats de protéase

  1. Construire un plasmide codant la protéine fluorescente cyan (CFP), 25 acides aminés de la séquence du site de clivage, suivi de la protéine fluorescente jaune (YFP, également connu sous le nom de Vénus29).
    REMARQUE: Le plasmide peut être construit à l'aide d'un clonage indépendant de séquence et de ligature (SLIC)30 ou d'une synthèse génétique commerciale. Un plasmide pet15b contenant la séquence montrée dans la figure 4 a été synthétisé commercialement et a été utilisé ici.
    1. Pour optimiser la longueur du substrat, construire des substrats FRET de longueur variable supplémentaires contenant 12-25 acides aminés des séquences virales naturelles de site de clivage de polyprotéine utilisant une réaction SLIC de 2 fragments. Analysez le clivage à l'aide de l'analyse à base de gel SDS-PAGE ou en mesurant les paramètres cinétiques à l'état stable en utilisant les méthodes ci-dessous.
      REMARQUE: Dans certains cas, les sites de clivage peuvent être identifiés par homologie aux sites de clivage connus31. Si le clivage des substrats contenant les séquences de jonction en polyprotéine n'est pas observé, il peut y avoir une exigence pour des résidus supplémentaires ou un motif structurel (par exemple, une hélice alpha32). Alternativement, la protéase virale purifiée peut être inactive. Confirmer le clivage des séquences virales de polyprotéine avant de poursuivre l'analyse de SSHHPS. Le nombre de résidus dans le substrat a été optimisé pour la protéase VEEV à l'aide de substrats de longueur variable (12 à 25 acides aminés) suivi de l'analyse de Vmax et Km32,33. Les sites de clivage de protéase ns2B/nsB virales De Zika utilisés dans les exemples ont été publiés34,35.
  2. Préparer les substrats CFP/YFP en transformant fraîchement 8-20 l de BL-21(DE3)E. colicellules compétentes avec le plasmide CFP-V12-YFP selon les directives du fabricant et la plaque sur les plaques d'agar Luria Bertani (LB) contenant 50 g/mL d'ampicilline (37 oC).
    1. Autoclave quatre flacons de 4 L contenant des supports LB (1,5 L de support par flacon) et 100 ml de LB dans un flacon de 250 ml. Garnir chaque flacon de papier d'aluminium.
    2. Inoculer la culture de 100 ml avec une colonie de bactéries fraîchement transformées et se développer à 37 oC avec des secousses (200 tr/min) pendant la nuit.
    3. Pour faire le substrat CFP/YFP, inoculer quatre flacons de 4 L avec 25 ml d'une culture du jour au lendemain. Commencez à secouer les cultures à 37 oC et surveillez la croissance par spectroscopie UV-vis à 600 nm par heure.
    4. Lorsque la bactérie atteint une absorption de 1,0 à 600 nm (environ 3-4 h de croissance) induisent l'expression des protéines en ajoutant 0,5 ml de 1 M isopropyl-D-thiogalactoside (IPTG) par flacon. Après l'ajout de l'IPTG, abaisser la température de l'incubateur secouant à 17 oC et permettre à l'expression de continuer toute la nuit pendant 17-20 h.
    5. Pelleter les bactéries à l'aide d'une centrifugeuse à grande vitesse à 7 000 x g pendant 10 min (4 oC) et conserver les granulés. Retirer et jeter les supports liquides. Conserver les granulés à -80 oC ou lyse immédiatement.
    6. Préparer 100 ml de tampon de lyse contenant 50 mM Tris pH 7,6, 500 mM NaCl, 35 ml de réagent d'extraction de protéines bactériennes, 30 mg de lysozyme, 25 U de DNase et 1 comprimé inhibiteur de la protéase. Resuspendre les granulés dans un tampon de lyse à l'utilisation d'une pipette et transférer 25 à 35 ml dans des tubes coniques jetables de 50 ml.
    7. Placer les tubes dans un bécher en plastique contenant de l'eau glacée. Insérez la pointe du sonicator dans les tubes de sorte que la pointe soit de 1 cm du fond du tube et sonicate les lysates 10-20 fois au niveau 5 pour des intervalles de 15 s jusqu'à ce que le lysate devienne fluide et liquéfié.
      REMARQUE: Utilisez une protection auditive pendant la sonication.
    8. Transférer le lysate dans les tubes de centrifugeuse à grande vitesse et la centrifugeuse à 20 500 x g pendant 30 min à 4 oC. Après le spin, conserver le supernatant (100 ml) et le transférer dans une bouteille propre. Jeter les granulés.
    9. Préparer 1 L de Tampon A (50 mM Tris pH 7,6, 500 mM NaCl). Préparer 300 ml de tampon B (50 mM Tris pH 7,6, 500 mM NaCl, 300 mM Imidazole).
    10. Équilibrez une colonne de nickel de 100 ml à l'aide de 3 volumes de colonnes de tampon A et d'un débit de 5 ml/min.
    11. Chargez le lysate sur la colonne de nickel à l'aide d'un débit de 2 à 5 ml/min. Laver la colonne avec 2 volumes de colonnes de tampon A, suivis de volumes de colonnes de 20 % de tampon B. Pendant le lavage de 20% de tampon B, l'absorption à 280 nm (A280) augmentera pendant que les contaminants s'édumisont de la colonne pendant le lavage. Continuez à laver la colonne jusqu'à ce que l'A280 de l'éluate revienne aux valeurs de base.
    12. Élichez la protéine avec 2-3 volumes de colonne de 100% Buffer B en utilisant un débit de 2-5 ml/min et de recueillir 10 ml fractions. Mesurer l'A280 de chaque fraction.
    13. Combiner et concentrer les fractions contenant A280 'gt; 0.1 à l'aide d'une unité d'ultrafiltration centrifuge de 15 ml. Faites tourner les unités d'ultrafiltration à 5 000 x g pendant 15 min et continuez d'ajouter des fractions jusqu'à ce que le volume ait été réduit à 50-75 ml.
    14. Couper un morceau de 14 pouces de tuyauterie de dialyse avec un poids moléculaire coupé (MWCO) de 6-8 kDa. Hydratez le tube de dialyse en le faisant bouillir complètement immergé dans 300 ml d'eau pendant 10 min. Attachez un noeud sûr à une extrémité de la membrane. Remplissez le sac d'un tampon de dialyse pour vous assurer qu'il n'y a pas de fissures ou de fuites. Retirez le tampon du sac et gardez le sac immergé dans le tampon de dialyse.
    15. Transférer la protéine concentrée de 2.2.13 dans le sac de dialyse avec une pipette en plastique. Retirez les bulles d'air du sac. Fermer le sac avec un deuxième noeud ou un clip de dialyse. Dialyser la protéine contre 500 ml de 50 mM Tris pH 7,6, 5 mM EDTA (acide éthylènediaminetetraacetic), 250 mM NaCl dans un cylindre gradué de 500 mL pendant la nuit à 4 oC.
    16. Dialyser la protéine une deuxième fois contre 500 ml de 50 mM Tris pH 7,6 à 4 oC pour 2 h.
  3. Pour la colonne d'échange d'anion préparer 500 ml de tampon A (50 mM Tris pH 7,6) et 500 mL Buffer B (50 mM Tris pH 7,6, 1,0 M NaCl). Équilibrez une colonne d'échange d'anion de 30 mL avec 3 volumes de colonnes de Buffer A (2-5 mL/min).
    1. Retirer la protéine du sac de dialyse et transférer dans une bouteille. Gardez la bouteille sur la glace. Chargez la protéine dialysée sur la colonne (2-5 ml/min).
      REMARQUE: La protéine CFP/YFP liera la colonne et sera jaune en apparence.
    2. Laver la colonne avec le tampon A jusqu'à ce que l'A280 revienne à la ligne de base (5 mL/min). Élirez la protéine à l'aide d'un gradient (0-50% Buffer B, 100 ml) et recueillez 10 ml de fractions.
    3. Inspectez les fractions de colonne à l'aide de SDS-PAGE. Combinez ceux qui sont purs à 95 %.
    4. Concentrez la protéine sur un A280 -10-20 à l'aide d'une unité d'ultrafiltration centrifuge de 15 ml. Faire tourner le concentrateur à 4 500 x g pendant 10 min à 4 oC et continuer à ajouter des protéines jusqu'à ce que toutes les fractions contenant des protéines aient été combinées.
  4. Retirer soigneusement la protéine du concentrateur à l'eau avec une pipette. Aliquot la protéine en tubes microcentrifuges de 1,5 ml et le gel flash dans l'azote liquide pour le stockage à long terme à -80 oC. Échangez la protéine à température ambiante à l'aide d'une colonne PD-10 libalée avec le tampon d'évaluation approprié avant l'utilisation.
  5. À l'aide de la loi de Beer, calculer la concentration en protéines à l'aide de l'A280 et d'un coefficient d'extinction calculé (p. ex., pour le substrat V12, de 47 790 M- 1 cm-1).
    REMARQUE: Le coefficient d'extinction peut être calculé à partir de la séquence protéique de la figure 4 à l'aide du programme Expasy ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/).

3. Préparation de la protéase Alphaviral nsP2 Cysteine

  1. Concevoir et construire un plasmide codant la protéase. Pour les protéases de cystéine, utilisez le plasmide pet32 pour construire une protéine de fusion de thioredoxine (Trx).
    Note:Le plasmide pet32 code un site de clivage de thrombin (LVPRGS) pour enlever la thioredoxine et son-tag (Figure 5). La thioredoxine aidera à maintenir la cystéine active de site dans un état réduit pendant l'expression. Pour les protéases sérines, la thioredoxine n'est pas nécessaire et les étapes impliquant son déplacement par thrombine peuvent être omises. La séquence de protéase VEEV nsP2 a été incorporée dans un plasmide pet32b qui a été préparé commercialement pour éviter de manipuler les agents Select.
    1. Transformer fraîchement l'ADN plasmide en BL21(DE3)pLysS E. coli selon les directives du fabricant. Déposer les bactéries sur des plaques d'agar LB contenant de l'ampicilline.
      REMARQUE: Le chloramphenicol n'est utilisé que pour les souches d'E. coli transportant le plasmide de plysmide et est omis si des cellules BL21 (DE3) sont utilisées. Il n'est pas nécessaire d'inclure le chloramphenicol sur la plaque d'agar LB dans cette étape.
    2. Autoclave quatre flacons de 4 L de 1,5 L de support LB (6 L volume total) et 100 ml de LB dans un flacon de 250 ml. Garnir chaque flacon de papier d'aluminium.
    3. Inoculer une culture de 100 ml de LB/Ampicillin avec une colonie de l'assiette et grandir dans un incubateur secouant (200 tr/min) à 37 oC.
    4. Inoculer les flacons de 4 L avec 25 ml de la culture du jour au lendemain et ajouter les antibiotiques appropriés.
      REMARQUE: Les milieux des cellules DE21 (DE3) de pLysS portant le plasmide pet32 devraient avoir des concentrations finales de chloramphenicol de 25 g/mL et d'ampicilline de 50 g/mL.
    5. Induire l'expression des protéines en ajoutant 0,5 mL d'IPTG à la culture lorsque l'absorption à 600 nm atteint 1,0. Abaisser la température de l'incubateur secouant à 17 oC. Permettre à l'expression de continuer toute la nuit (17 h).
    6. Pelleter les cellules par centrifugation (7 000 x g pendant 10 min à 4 oC). Retirer et jeter le support liquide.
      REMARQUE: Les granulés peuvent être stockés à -80 oC pendant des mois ou lysés immédiatement.
    7. Préparer 100 ml de tampon de lyse (50 mM Tris pH 7,6, 500 mL NaCl, 2 mM bêta mercaptoethanol (BME), 30 mg de lysozyme, 5 % de glycérol, 25 U DNase, 35 mL de réagent d'extraction de protéines bactériennes). Ouvrez les bouteilles de BME dans une hotte chimique lors de l'ajout. Gardez le lysate bactérien sur la glace ou à 4 oC pour cette étape et toutes les étapes suivantes.
      REMARQUE: Pour les protéases de cystéine, 2 mM BME est inclus pour maintenir la cystéine nucléophile réduite. Les colonnes peuvent être exécutés à température ambiante à l'aide de tampons réfrigérés. Les tampons doivent être faits avec de l'eau froide déionisée refroidie à 4 oC.
    8. Resuspendre les granulés bactériens dans un tampon de lyse de 25 ml et transférer 25 ml de lysate en tubes coniques jetables de 4 x 50 ml. Placer les tubes dans des béchers en plastique contenant de l'eau glacée. Sonicate le lysate 10 fois au niveau 5 pour 15 s intervalles.
    9. Transférer le lysate dans des tubes de centrifugeuse à grande vitesse. Clarifier le lysate par centrifugation (30 min, 20 500 x g à 4 oC).
    10. Préparer 0,5 L de tampon A (50 mM Tris pH 7,6, 500 mM NaCl, 5 % de glycérol, 2 mM BME) et réfrigérer jusqu'à 4 oC.
    11. Préparer 250 ml de tampon B (50 mM Tris pH 7,6, 500 mM NaCl, 5 % de glycérol, 2 mM BME, 300 mM d'imidazole) et réfrigérer jusqu'à 4 oC.
    12. Équilibrez une colonne de nickel de 50 ml avec 3 volumes de colonne soute de tampon A. Chargez le lysate clarifié sur la colonne à 2-5 ml/min et jetez les granulés.
    13. Laver la colonne (2-5 mL/min) avec 2 volumes de colonnes de tampon A suivis de 5 volumes de colonnes de tampon A contenant 20% de tampon B (60 mM Imidazole). Élirez la protéine (5 ml/min) avec 100% Buffer B et collectez 10 ml de fractions.
    14. Combiner et concentrer les fractions contenant la protéase qui ont unA 280 0,1 à l'aide d'une unité d'ultrafiltration centrifuge de 15 ml et de 15 min de spins à 5 000 x g à 4 oC. Une fois que le volume a été réduit à 5 ml, tampon échangez la protéine dans l'unité de concentration en ajoutant un tampon de dialyse frais à la protéine (50 mM Tris pH 7,6, 250 mM NaCl, 5 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM EDTA, 5% Glycerol). Faire tourner à nouveau à 5 000 x g à 4 oC pendant 15 min; répéter l'étape d'échange tampon 2-3 fois. Ajouter la thrombine à la protéine (20 l de 1 unité/L) avant la dialyse pour enlever la thioredoxine et son étiquette.
    15. Transférer la protéine dans un sac de dialyse et dialyser contre 500 ml du tampon de dialyse (4 oC) dans un cylindre gradué de 500 ml pendant la nuit.
      REMARQUE: Le système FPLC (chromatographie liquide à protéines rapides) et la colonne de nickel doivent être soigneusement nettoyés à l'effigie de décapage (2 M NaCl, 50 mM EDTA) avant de passer à la colonne d'échange d'anions. Tout nickel résiduel dans les lignes FPLC transformera les solutions tamponcontenant le brun TNT lorsqu'il est mélangé. Laver la colonne de nickel et le système FPLC avec 4 volumes de colonne d'eau. Pompez laver le système FPLC à fond avec de l'eau. La colonne de nickel peut être régénérée en coulant 2 volumes de colonne de sulfate de nickel de 0,2 M sur la résine pour les purifications ultérieures.
  2. Pour la colonne d'échange d'anion préparer 1 L de tampon A (50 mM Tris pH 7,6, 5 mM DTT, 5% de glycérol).
    1. Préparer 0,5 L de tampon B (50 mM Tris pH 7,6, 5 mM DTT, 5 % de glycérol, 1,25 M NaCl).
    2. Équilibrez une colonne d'échange d'anion de 30 mL avec le tampon A (3 volumes de colonnes, 2-5 mL/min). Placez les tubes dans le collecteur de fractions pour la collecte du flux à travers.
      REMARQUE: La protéase VEEV a un point isoélectrique calculé (pI) de 8,7 et liera les colonnes d'échange de cation, mais coulera à travers les colonnes d'échange d'anion. Le pI peut être calculé à partir de la séquence protéique à l'aide du programme Expasy ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/).
    3. Diluer la protéine dialysée 1:3 avec le tampon A, puis charger la protéine (5 ml/min). Recueillir le flux en fractions de 10 ml.
  3. Supprimer la colonne d'échange d'anion du système FPLC. Connectez une colonne d'échange de cations au système FPLC. Équilibrez une colonne d'échange de cation de 30 mL avec 3 volumes de colonnes de tampon A (5 mL/min).
    1. Chargez le flux à travers la colonne d'échange d'anion sur la colonne d'échange de cation à 2-5 ml/min. Lavez la colonne avec le tampon A jusqu'à ce que l'A280 retourne au niveau de base. Élirez la protéine avec un gradient de 100 ml (0-50% Buffer B) et recueillez 10 ml de fractions.
      REMARQUE: La protéase VEEV s'éliront à environ 0,6 M NaCl.
    2. Inspectez les fractions de colonne à l'aide de SDS-PAGE. Combinez les fractions qui sont pures et concentrées sur un A280 à 2 à l'aide d'unités d'ultrafiltration centrifuge s'il y a 15 ml. L'enzyme peut être congelée au flash dans de l'azote liquide et stockée à -80 oC.

4. Assaying l'enzyme en continu à l'aide d'un lecteur de plaque

  1. Préparer 50 ml de tampon d'essai (50 mM HEPES pH 7.0).
    1. Comme les protéases alphavirales ont des valeursde chat k relativement faibles, diluer l'enzyme dans le tampon d'essai à 4,7 M (ce qui correspondra à peu près à un A280 - 0,2 pour la protéase VEEV sans Trx).
    2. Pour mesurer l'activité de l'enzyme, préparer un stock de substrat dans le tampon d'essai avec une concentration de 185 M; cela correspondra à peu près à un A280 '9. Dans 8 tubes de microcentrifuge, préparer les mélanges de réaction indiqués dans le tableau 2 en combinant les volumes appropriés du stock de substrat de 185 M et du tampon. Dans une demi-zone noire de 96 puits, la plaque de 45 l l de la réaction se mélange en 3 puits (colonnes 1, 2, 3). La rangée A doit contenir le mélange de réaction [S] de 5 M, et la rangée H doit contenir le mélange de réaction [S] de 140 m.
    3. Réglez le lecteur de plaque pour détecter simultanément la fluorescence à deux longueurs d'onde avec un tube photomultiplicateur fixe (PMT) (p. ex., faible) :
      Longueur d'onde 1 excitation 434 nm, émission 527 nm
      Longueur d'onde 2 excitation 434 nm, émission 470 nm
    4. Définir le temps de lecture à 20 min (mesurant 1 lecture par minute) et sélectionnez les puits à lire. Insérer la plaque dans le lecteur de plaque et mesurer le taux spontané d'hydrolyse pendant 20 min. Surveiller les ratios d'émission (émission à 527/émission à 470) au fil du temps.
    5. Exécuter un point d'extrémité de la lecture de la plaque contenant le substrat "UNCUT".
      REMARQUE: Ces valeurs seront utilisées dans les calculs de données ultérieurs. La moyenne des ratios d'émission de 3 puits sera la valeur du substrat «UNCUT» à t -0 dans le tableau 3.
    6. Retirer la plaque et le tuyau de 5 l d'enzyme dans chaque puits. Relisez l'assiette pendant 20 min avec 1 lecture par minute. Définir le lecteur de plaque sur des valeurs absolues de sortie.
      REMARQUE: Pour cet exemple, les pistes seront négatives. Chaque puits contiendra un volume total de 50 L.
    7. À la fin de la lecture, sceller la plaque avec du film pour éviter l'évaporation. Laisser la plaque à température ambiante pendant la nuit pour permettre à l'enzyme de couper complètement le substrat.
    8. Après 24 h, retirer le film d'étanchéité et effectuer une lecture de la plaque en utilisant le même PMT que dans les plaques précédentes. Moyenne de ces ratios d'émission et d'entrée dans le tableau 3 sous la « CUT ». Confirmer le clivage du substrat à l'aide de l'essai discontinu SDS-PAGE décrit ci-dessous (étape 5.1.).
    9. Exportez les données vers une feuille de calcul. Sortie des unités de fluorescence à chaque point de temps pour les 2 longueurs d'onde (tableau 4).
    10. Calculer le nmol du substrat qui ont été coupés à l'aide de l'équation (1) où X est le rapport d'émission (527 nm/470 nm) à un moment donné, neg est le rapport d'émission du substrat "UNCUT" à t - 0, et pos est le rapport d'émission du substrat complètement "CUT" mesuré après 24 h de coupe (tableau 3).

      figure-protocol-2

      REMARQUE: Des données représentatives de fluorescence sont présentées pour un puits (puits E7) contenant un substrat de 80 M (4 nmol de S par puits) dans le tableau 4. Les calculs ont été effectués pour chaque puits dans la plaque.
    11. Pour chaque puits, tracez nmol vs temps (min) et obtenez les vitesses initiales (pentes) en adaptant les données à y ' mx 'b. Pour les données recueillies en 4.1.5, tracez nmol vs temps (min) pour chaque puits. La pente sera égale au produit de nmol produit par minute. Soustraire les taux spontanés d'hydrolyse mesurés en 4,1,5 des taux de réaction catalysés par les enzymes (tableau 5).
      REMARQUE: La première lecture peut être extraite des données si elle est artifactually élevé en raison du mouvement de la plaque dans le lecteur de plaque.
    12. Calculer la quantité d'enzyme s'ajouter à chaque puits (p. ex., 0,0009 mg). Une unité est définie comme une mol le produit produit par minute (mol/min). Diviser le nmol/min par le mg d'enzyme présent dans le puits pour obtenir mU/mg; diviser par 1 000 pour obtenir U/mg.
    13. Terrain [S] M sur l'axe x et U/ mg sur l'axe y et adapter les données à l'équation Michaelis-Menten pour obtenir Vmax et Km. Cela peut être fait dans le logiciel (par exemple, GraFit).

5. Assaying the Enzyme Discontinuously Using SDS-PAGE Analysis 5. Assaying the Enzyme Discontinuously Using SDS-PAGE Analysis 5. Assaying the Enzyme Discontinuously Using SDS-PAGE Analysis 5.

  1. Préparer une réaction de 50 L contenant un substrat et un tampon de 10 M à la place de l'enzyme et de l'étiquette « UNCUT ».
    REMARQUE: Les volumes de substrat et de tampon sont indiqués dans le tableau 2. Si l'essai continu a été exécuté, les échantillons peuvent être utilisés directement à partir de la plaque de 96 puits.
    1. Préparer une réaction de 50 L contenant un substrat de 10 M et une enzyme de 5 L et une étiquette sous le nom de « CUT ». Démarrer la minuterie lorsque l'enzyme est ajoutée au substrat.
      REMARQUE: Des inhibiteurs peuvent être ajoutés à d'autres tubes contenant de l'enzyme et du substrat. Ajuster le volume de mémoire tampon ajouté pour compenser le volume supplémentaire d'inhibiteur. Les concentrations de DMSO ne doivent pas dépasser 2 %.
    2. Incuber les réactions de 15 à 24 h à température ambiante (22 à 3 oC). Arrêtez les réactions en ajoutant 50 l de tampon Laemelli 2x. Après l'arrêt de l'ébullition de réaction, chaque tube pendant 3-10 min.
    3. Assembler le réservoir de gel selon les instructions du fabricant. Insérez une cassette en gel polyacrylamide pré-moulé e 17 bien et un barrage tampon de l'autre côté. Remplissez le réservoir intérieur de la cellule avec un tampon de fonctionnement 1x SDS jusqu'à ce que le tampon atteigne le haut de la cassette. Remplissez le réservoir externe à moitié plein avec le même tampon.
    4. Pour analyser le clivage à l'aide de l'analyse discontinue, chargez 5 L de chaque mélange de réaction dans une voie d'un gel SDS-PAGE commençant par la réaction « UNCUT ». Inclure un marqueur de poids moléculaire dans la première ou la dernière voie.
    5. Fixez les électrodes du réservoir de gel à l'alimentation et séparez les produits à 110 V pendant 60 min. Retirez le gel de la cassette en insérant l'outil de fissuration entre les plaques. Placer le gel dans un bac en plastique et immerger le gel dans 5-10 ml de solution de coloration gel; bandes seront visibles dans les 30 minutes. Après 1-24 heures enlever la tache excédentaire, immerger le gel dans l'eau et utiliser un imageur de gel pour prendre une photo du gel.

6. Docking Substrat Peptides à la protéase VEEV-nsP2 Cysteine

  1. Téléchargez le fichier de coordonnées de la protéase de cystéine VEEV du PDB (https://www.rcsb.org/). Le code PDB est 2HWK. Enregistrer le fichier comme 2HWK.pdb.
    1. Préparer la structure protéique à l'aide de MOE(https://www.chemcomp.com/). Chargez le fichier PDB protéique dans le MEO. Cliquez sur la sélectionnez et le solvant sur la barre de droite et supprimez le solvant.
    2. Ouvrez le panneau de préparation de la structure à partir de la barre de menu supérieur Protein. Corriger automatiquement tous les éléments structurels en cliquant sur Corriger et protonate la structure en cliquant sur Protonate3D. Ajoutez des charges partielles à la protéine en ouvrant le panneau de charges partielles et en sélectionnant Amber 99 et Ajustez les paires d'hydrogènes et de lone au besoin. Enfin, enregistrez le fichier de structure comme "2HWK_dock.pdb".
  2. Construire la structure des peptides substrat (nsP12, nsP23, nsP34) et TRIM14 à l'aide de MOE. Ouvrez le panneau Protein Builder, entrez dans la séquence du substrat, configurez la géométrie comme étendue et cliquez sur Construire. La structure sera affichée dans la fenêtre MOE.
    1. Minimisez la structure peptide en cliquant sur Minimiser sur le panneau. Enregistrer la structure comme un fichier PDB (Figure 6).
  3. Dock les peptides de substrat à VEEV-nsP2 en utilisant PyRx/AutoDock 4.2 (http://autodock.scripps.edu/). Ouvrez l'outil PyRx, modifiez le paramètre de préférence, inactivez toutes les torsions pour la préparation De Ligand. Chargez la molécule de substrat, cliquez à droite sur le nom de la molécule sur le panneau Navigator, sélectionnez Faire ligand pour préparer le fichier d'amarrage ligand. Chargez la protéine 2HWK_clean.pdb, et sélectionnez Faire macromolécule pour préparer le fichier d'amarrage pdbqt (Figure 7).
    1. Démarrez l'AutoDock Wizard sur le panneau d'amarrage en bas. Sélectionnez les fichiers ligands et protéinés préparés. Définissez la poche de liaison protéique en ajustant manuellement la dimension de grille qui est centrée sur le résidu catalytique Cys-477. Utilisation du paramètre d'espacement par défaut 0.375 '. Cliquez sur Run AutoGrid pour générer des cartes de grille.
    2. Exécutez AutoDock et sélectionnez la méthode Lamarckian Genetic Algorithm (LGA). Cliquez sur les paramètres d'amarrage et définiz le nombre d'exécutions d'AG à 50. Utilisez les paramètres par défaut pour les autres. Cliquez sur Vers l'avant pour commencer la course d'amarrage.
    3. Ouvrez le panneau Résultats d'analyse. Inspecter toutes les poses de liaison prévues. Sélectionnez le meilleur modèle avec l'énergie de liaison la plus basse prédite et les interactions de liaison raisonnables entre le Cys-477 et le substrat sur le site de clivage. Enregistrer le modèle de liaison en tant que fichier PDB pour d'autres simulations MD.

7. Simulations MD des complexes VEEV-substrate docked

  1. Préparer les fichiers d'entrée en utilisant Amber (http://ambermd.org/). Suivant le protocole standard, des simulations MD sont effectuées pour les modèles de liaison de substrat prévus à l'aide du paquet AMBER et du champ de force ff99SB.
    REMARQUE: Les systèmes résolus sont soumis à une minimisation complète de l'énergie avant les simulations MD. Des conditions de limite périodiques sont appliquées pour simuler un système continu. La méthode du maillage de particules Ewald (PME) a été utilisée pour calculer les interactions électrostatiques à longue portée. Le système simulé a d'abord été soumis à une augmentation progressive de la température de 0 K à 300 K sur 100 ps, puis a été agrémenté pour 500 ps à 300 K, suivi par des séries de production de 2 ns longueur au total.
    1. Exécutez le travail de simulation dans une installation informatique haute performance. Nos simulations ont été réalisée sur le cluster Biowulf (https://hpc.nih.gov/) (Figure 8).
    2. Visualisez la sortie de trajectoire à l'aide du programme VMD(http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/). Analyser les interactions de liaison et les changements conformationnels des substrats et du TRIM14 dans le site actif de nsP2 (figure 9).

Résultats

L'analyse SSHHPS de la protéase ZIKV ns2B/3 a identifié 4 cibles protéiques hôtes : FOXG1, SFRP1, une sous-unitéalpha G d'une bibliothèque d'ADNc rétinienne, et la nt5M mitochondriale 5',3'-nucleotidase (Figure 10)6. Notamment, aucune autre méthode n'a prédit ces protéines comme cibles potentielles de la protéase ZIKV. Des mutations dans le gène FOXG1 ont été liées à un syndrome congénital caractérisé par le développement altéré et les anomalies structurales de cerveau telles que la microcéphalie. SFRP1 est une protéine sécrétée liée à la frisottis (SFRP); ces récepteurs solubles peuvent lier les ligands Wnt de façon compétitive pour contrarier et inhiber la signalisation Wnt. La voie de signalisation Wnt est impliquée dans la régulation de la réponse IFN pendant l'infection par flavivirus36. On s'attendrait à ce que le clivage de SFRP1 améliore la réplication de flavivirus. SFRP1 est également impliqué dans la différenciation Th17-cellule37. Les alignements de séquences du SSHHPS ont montré des différences spécifiques aux espèces dans les séquences des sites de clivage(figure 10D). La séquence de site de clivage dans SFRP1 était identique chez l'homme et les poulets ; ZIKV peut induire la mortalité et la microcéphalie dans les embryons de poulet38. Chez les rongeurs, les résidus de P1 hautement conservés (K/R)R-G sont remplacés par une glycine (RGG). Les souches immunocompétentes de souris sont généralement résistantes à l'infection et à la maladie de ZIKV39.

Les paramètres cinétiques à l'état stable et les constantes d'inhibition peuvent être mesurés pour les séquences virales de polyprotéines et pour les séquences de protéines hôtes en utilisant l'analyse continue dans un lecteur de plaque31,40,41 ( Figure11A). Pour les informations qualitatives de clivage, telles que le clivage d'une séquence particulière ou l'inhibition de la protéase par divers composés, l'analyse discontinue peut être utilisée (Figure 11B).

L'optimisation du nombre de résidus entre la PCP et le PFJ peut être nécessaire. Un modèle lié au substrat peut être fabriqué en utilisant les méthodes in silico. Un modèle à quai représentatif de la jonction nsP1/nsP2 est indiqué à la figure 9. Pour la protéase VEEV nsP2, le clivage d'une séquence de 12 acides séminés Semliki Forest Virus (SFV) avait été signalé (Km - 0,58 mM)33. L'allongement de la séquence du substrat à 19, 22 et 25 résidus et la réduction de la résistance ionique du tampon ont conduit à une réduction significative de Km. L'examen de la structure en cristal VEEV nsP2 et de l'emballage en cristal a également montré qu'une partie de l'une des jonctions était emballée contre le domaine de la protéase et était hélicoïdale. Ainsi, plus les substrats VEEV plus longs peuvent se lier mieux en raison de la reconnaissance d'un motif structurel secondaire.

Pour TRIM14, nous avons obtenu un Km '21 'M6,33. Le Km pour le substrat porteur de la séquence protéique hôte était comparable aux valeurs De Km des substrats contenant les séquences virales du site de clivage polyprotéine (Km(V12) - 12 M et Km(V34) - 21 M). Les séquences du site de clivage aux jonctions nsP1/nsP2, nsP2/nsP3 et nsP3 ont été coupées avec des gains d'efficacité différents. Dans la cellule, on pense que cela permet le clivage séquentiel de la polyprotéine42.

Il faut faire preuve de prudence dans l'interprétation des résultats négatifs. Si aucun clivage ne se produit, le site de clivage peut être trop court ou la protéase purifiée peut être inactive. Pour les substrats qui sont coupés, des expériences supplémentaires sont nécessaires pour confirmer le clivage de la protéine pleine longueur ou le clivage dans les cellules infectées par le virus. Des expériences de suivi appropriées doivent être choisies. Les effets de la surexpression ou du silence de la protéine cible sur la réplication virale peuvent également être testés.

figure-results-1
Figure 1 : Trois mécanismes de silence. Le silençage peut se produire au niveau de l'ADN, de l'ARN ou des protéines. Ces algorithmes de « recherche et suppression » utilisent chacun un « mot clé » pour diriger le clivage d'un fichier contenant le mot. Ce chiffre a été modifié à partir de Morazzani et coll.32 et des références qui s'y contonta. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 2 : Différences spécifiques aux espèces dans les séquences de sites de clivage. Les domaines C-terminal PRY/SPRY des homologues TRIM14 sont indiqués dans l'alignement. Le domaine PRY/SPRY peut être identifié par les motifs conservés mis en évidence en gris. L'humain TRIM14 est coupé à QEAGA-G par la protéase de cystéine VEEV nsP2. La séquence SSHHP est affichée en couleur. Le résidu en vert est le résidu P1'; en bleu est le résidu P4, et en rouge sont d'autres résidus conservés dans la séquence de motif du site de clivage. L'équine abrite une version tronquée de TRIM14 dépourvue du domaine PRY/SPRY. La lysine mise en évidence dans le cyan est poly-ubiquitinated et est importante pour l'assemblage du signalosome de MAVS. Le domaine C-terminal PRY/SPRY peut être coupé transitoirement par la protéase nsP2 pour altérer la réponse antivirale de l'hôte intracellulaire ment pendant une infection virale aigue. En équine, ce domaine est toujours absent. Ceci suggère que le domaine PRY/SPRY de TRIM14 puisse avoir une fonction protectrice contre des infections de VEEV. Ce chiffre a été reproduit à partir de Morazanni et al.6S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 3 : Identification SSHHPS à l'aide de BLAST. La séquence de motif du site de clivage à la jonction VEEV nsP1/nsP2 est alignée avec la séquence SSHHP dans la protéine hôte TRIM14. Le résidu coloré en vert est le résidu P1'; en bleu est le résidu P4 et en rouge sont d'autres résidus conservés de la séquence de motif du site de clivage. La plupart des alignements contenaient de l'homologie à des régions à l'extérieur du motif du site de clivage conservé ou n'incluaient pas les résidus de liaison scissile P1/P1. TRIM14 a montré une correspondance à 6 résidus dans l'ordre séquentiel qui comprenait P1 et P1 '. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 4 : Séquences protéiques et d'ADN du substrat CFP-V12-YFP pour la protéase de cystéine VEEV nsP2. Les sites de restriction NdeI (CATATG) et XhoI (CTCGAG) sont indiqués en majuscules. En rouge est la séquence du site de clivage de la polyprotéine virale qui se trouve entre nsP1 et nsP2. Le résidu en vert est le résidu P1' et en bleu est le résidu P4 du site de clivage. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 5 : Séquence protéique de la construction de la protéase de cystéine Detrx-VEEV-nsP2. La thioredoxine (Trx) est représentée en jaune. Le site de clivage de thrombin e et son-tag sont montrés en cyan. Les Cys-His dyade sont étiquetés en rouge. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 6 : Structures peptidiques dans le MEO. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 7 : Docking of substrat peptide using PyRx/AutoDock. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 8 : Emplois en cours d'exécution sur le cluster Biowulf. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 9 : Modèle du substrat VEEV P12 contenant la séquence du site de clivage à la jonction nsP1/nsP2. La dyade catalytique Cys-477/His-546 est représentée en bleu. La figure a été faite à l'aide de Pymol (https://pymol.org). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 10 : Analyse du SSHHPS de la protéase du virus Zika ns2B/ns3. (A) Cibles protéiques hôtes prévues de la protéase ZIKV ns2B/ns3. Les résidus en rouge correspondent à une séquence de site de clivage unique. Les résidus en vert sont tolérés au sous-site et correspondent aux résidus d'autres sites de clivage. SFRP1 a eu le plus grand nombre de résidus identiques dans l'ordre consécutif. (B) Les protéines CFP-substrate-YFP (50-60 kDa) ont été exprimées et purifiées contenant la séquence SSHHP prévue de chaque protéine hôte (humaine). La protéase ZIKV a coupé l'humain FOXG1, SFRP1, NT5M et une sous-unité alphadeG isolée d'une bibliothèque de cDNA rétinien. Les produits de clivage sont environ 28-30 kDa. Les séquences de substrats sont disponibles dans Morazzani et al.6 (C) Bien que la protéase ns2B/ns3 coupe SFRP1, elle n'a pas coupé ses homologues (SFRP2 et SFRP4). (D) L'alignement des sites de clivage de différentes espèces animales peut être utile dans le choix d'un modèle animal pour un virus du groupe IV. Notez que la séquence de R-G conservée diffère entre les humains et les rongeurs dans SFRP1. Figure reproduite à partir de Morazzani et coll.6Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 11 : Analyse cinétique à l'état régulier à l'aide des essais continus et discontinus. (A) Les données cinétiques présentées dans le tableau 5 ont été tracées dans GraFit. L'enset montre l'intrigue Lineweaver-Burk. (B) Gel SDS-PAGE montrant les produits de clivage du substrat CFP-V12-YFP. Dans la voie 1 se trouve le substrat "UNCUT" (48 kDa). Dans la voie 2 se trouve le substrat "CUT" (31 kDa et 27 kDa). Dans les voies 3-9 différents composés ont été inclus pour tester leur activité inhibitrice. La voie 4 contient l'inhibiteur covalent E64d. Ces réactions ont été courues pendant la nuit pendant 17 h à température ambiante. L'ébullition des échantillons était nécessaire pour atteindre le modèle de baguage pointu. La protéase nsP2 est visible (56 kDa) dans les réactions contenant de l'enzyme, mais pas dans la voie 1. La voie 1 est le contrôle " sans enzymes ". Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

La destruction spécifique à la séquence d'une protéine ou d'un acide nucléique guidée par une séquence étrangère n'est observée que dans quelques cas en biologie. Les mécanismes indiqués à la figure 1 sont des mécanismes défensifs qui protègent un hôte contre un virus ou un virus d'un hôte.

En utilisant des méthodes bioinformatiques, nous pouvons identifier les cibles qui sont détruites par ces systèmes. Dans nos analyses des séquences de SSHHP, nous avons découvert que beaucoup d'entre eux pourraient être trouvés dans les protéines nécessaires pour générer des réponses immunitaires innées. Certains avaient des rôles évidents tels que MAVS et TRIF (adapton adaptateur-contenant le domaine TIR-induisant l'interféron-MD), tandis que d'autres étaient liés à l'immunité bien que des mécanismes plus complexes (par exemple, Histone H3, SFRP1, FOXG1)8,9. L'information cible stockée dans la séquence SSHHP a le potentiel d'identifier les voies qui ont des effets antiviraux contre ces virus. Les réponses antivirales in vivo sont souvent spécifiques au virus26,43. Par exemple, les sous-ensembles de protéines TRIM ont des effets antiviraux sur différents virus43,44,45, certains sont des facteurs de restriction virale (par exemple, le VIH et TRIM5). La spécificité des protéines TRIM (70 ont été identifiées) est encore à l'étude44,45. L'information contenue dans le SSHHPS peut contribuer à notre compréhension de la façon dont ces virus échappent aux réponses immunitaires innées. D'autres modèles et corrélations peuvent être découverts au fur et à mesure que l'on examine davantage le SSHHPS.

Des différences propres aux espèces étaient évidentes dans nos analyses (Figure 2, Figure 10). Ces virus sont connus pour affecter certaines espèces plus que d'autres. Des informations sur la portée de l'hôte, la susceptibilité de l'hôte et les défenses d'hôte peuvent être présentes au sein du SSHHPS. Par exemple, l'équidé, l'espèce la plus sensible aux virus de l'encéphalite équine, n'avait pas la région de TRIM14 humain qui a été coupée transitoirement par la protéase VEEV nsP2. Les humains meurent rarement des infections de VEEV mais peuvent être infectés24. La protéine humaine TRIM14 portait une séquence de clivage de protéase nsP26. La présence du site de clivage suggère que les humains ont un mécanisme de défense contre ces virus. On a pensé que les oiseaux étaient des réservoirs potentiels de ces virus46. La séquence SSHHP correspondante dans la protéine TRIM14 des poulets différait des séquences trouvées chez l'homme et d'autres espèces. Des différences subtiles comme celles-ci peuvent rendre une protéine hôte cible oncleavable ou plus facilement clivée. Aguirre et coll.16 ont montré qu'une protéine STRING mutée oncleavable induit des niveaux plus élevés d'IFN après l'infection par le virus de la dengue et que les souris portent naturellement une version de STING qui n'est pas coupée par la protéase dengue ns2B3. La protéine murine STING n'a pas été coupée par la protéase ZIKV47. Dans notre analyse SSHHPS, nous avons également observé des différences dans les séquences du site de clivage de protéase ZIKV lorsque nous avons comparé les protéines humaines avec celles des rongeurs6 (Figure 10D). La reproduction des clivages protéolytiques spécifiques aux espèces des protéines hôtes peut être importante dans les modèles animaux utilisés pour les virus du groupe IV. L'inhibition du clivage protéique hôte a également des implications en ce qui concerne le développement des inhibiteurs de la protéase du groupe IV. Dans notre publication précédente, nous avons montré que nous pouvions inhiber trim14 clivage par la protéase VEEV nsP2 en utilisant CA074 ester méthyle6. Ce résultat suggère que les inhibiteurs de petite molécule de ces protéases puissent moduler les réponses immunitaires innées qui sont capables de supprimer l'infection6,31.

La variation génétique au sein d'une espèce a également le potentiel de produire des différences dans le clivage protéolytique. Les différences subtiles dans l'utilisation de codon pourraient affecter la pause ribosome48. Étant donné que certaines protéases virales du groupe IV sont intégrées dans la membrane des urgences, les différences dans ces pauses pourraient affecter le clivage d'une cible si le clivage se produit de façon co-traduite. Certains des sites de clivage que nous avons identifiés se trouvaient dans des séquences de peptides de signal prévues (p. ex., SFRP1) tandis que d'autres étaient internes.

L'analyse SSHHPS peut produire des informations qui diffèrent des autres méthodes d'analyse des protéines hôtes. L'analyse Du SSHHPS était peu coûteuse et facile à employer. L'utilisation d'un système d'expression bactérienne a permis de tester des segments courts (25 acides aminés) de séquences de mammifères sans l'utilisation de la culture cellulaire des mammifères. Nous avons constaté que les substrats CFP-YFP étaient capables de tolérer toutes les séquences de protéines humaines testées; cependant, les rendements variaient. Dans des essais semblables, des substrats contenant des séquences de protéine humaine aussi longtemps que 63 acides aminés ont été avec succès exprimés, purifiés, et utilisés pour des analyses cinétiques et le criblage d'inhibiteur49,50,51. Étant donné que seules de petites quantités du substrat sont nécessaires pour l'analyse discontinue, un grand nombre de cibles peuvent être explorées. L'un des avantages du système est que les substrats CFP/YFP peuvent être utilisés pour des analyses SDS-PAGE et pour des analyses cinétiques plus élaborées (c.-à-d., IC50, Ki, Km, Vmax). Pour la découverte de médicaments, les composés inhibiteurs peuvent produire des artefacts dans des analyses fluorescentes. Ainsi, l'essai discontinu en combinaison avec un essai continu permet de confirmer le clivage ou l'inhibition du clivage. Les échantillons pour l'analyse discontinu SDS-PAGE peuvent être prélevés directement sur les plaques de 96 puits. Les substrats CFP/FpJ ont été utilisés pour le dépistage des bibliothèques composées52. Cependant, des analyses supplémentaires sont nécessaires pour déterminer si un substrat convient au dépistage à haut débit, comme le calcul d'un facteur Z53.

L'un des défis de la conception d'un substrat est d'identifier la région autour du lien scissile qui est lié et reconnu par la protéase. Dans les exemples présentés ici, nous avons commencé avec 12 séquences de résidus qui ont été centrées autour du lien scissile. Après avoir analysé les alignements de séquence des sites de clivage homologie aux résidus N-terminal du lien scissile a été trouvé pour la protéase VEEV, tandis que pour l'homologie de protéase ZIKV à plusieurs des résidus C-terminal a été trouvé. Un modèle in silico du substrat amarré peut être utilisé pour concevoir des expériences de mutagénèse dirigées par le site qui sondent les sites de liaison du substrat. Puisque le substrat et les séquences d'enzymes sont sur des plasmides, l'un ou l'autre peut être muté pour tester les modèles en silico ou les tolérances de sous-site. Cela peut être avantageux si une structure cristalline du substrat lié n'est pas disponible.

L'analyse du SSHHPS peut également fournir de nouvelles informations sur les mécanismes par lesquels les phénotypes induits par le virus sont produits par des enzymes virales. Une des cibles ZIKV, SFRP1, fait partie de la voie de signalisation Wnt et a des rôles dans le développement du cerveau et des yeux et dans les réponses immunitaires36,37,54,55,56,57. Nous avons constaté que les autres séquences protéiques qui pourraient être coupées par la protéase ZIKV ns2B/ns3 étaient également dans les protéines impliquées dans le développement du cerveau et des yeux; des anomalies dans les deux ont été observées dans le syndrome congénital de Zika et sont vraisemblablement pour faire partie du phénotype58virus-induit.

La prévisibilité des interactions hôte-pathogène pourrait être exploitée pour une variété d'applications : thérapies virales oncolytiques spécifiques à la cible; la réduction du risque des vaccins contre les virus vivants; le raffinement, la prédiction ou la sélection des modèles animaux; prédiction de la portée ou de la susceptibilité de l'hôte; prévision des événements zoonotiques; et la prédiction des défenses d'hôte. Étant donné que les méthodes décrites sont basées sur des séquences, elles peuvent être d'une valeur à intégrer dans le logiciel à l'avenir.

Déclarations de divulgation

Les opinions exprimées ici sont celles des auteurs et ne représentent pas celles de la marine américaine, de l'armée américaine, du ministère de la Défense des États-Unis ou du gouvernement américain.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les numéros de projet CB-SEED-SEED09-2-0061 et CBCall4-CBM-05-2-0019, et en partie par le programme de recherche intra-muros/extra-muros des fonds de base du NCATS, des NIH (XH) et du Naval Research Laboratory.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Fiole Erlenmeyer de 250 mLVWR89000-362
2-mercaptoéthanolAcros Organics (Fisher)125472500Danger : Toxicité aiguë. Ouvrez la bouteille dans la hotte pour éviter d’inhaler les fumées.
Fiole Erlenmeyer graduée à large col en Pyrex de 4 L avec bouchon à visMillipore SigmaCLS49954L-1EA
AKTA Prime PlusGE Healthcare17-0729-01
AKTA XK 16/20 ColonneGE Healthcare28988937
Unité de filtration centrifuge Amicon Ultra-0.5 Unité de filtration
Amicon Ultra-15Unité de filtre centrifuge Millipore SigmaUFC901096
Amicon Ultra-4Millipore SigmaUFC801024
AmpicillinSigmaA0166Danger : Réactions allergiques (cutanées ou respiratoires).
Sépharose chélatante à débit rapideGE Healthcare17-0575-02Une fois que la résine est équilibrée avec du sulfate de nickel 0,2 M, elle est désignée comme une colonne de nickel dans le texte. La colonne aura une couleur verte après le lavage à l’eau. La colonne aura une couleur bleue après l’équilibrage avec le tampon.
ChloramphénicolRPIC61000Danger : Peut causer le cancer.
Tubes à centrifuger Corning 50 mLCorning430828Suggestion : Les tubes en polypropylène sont moins susceptibles de se fissurer lors de la sonication que les tubes en polyéthylène
Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding SurfaceCorning3993
Pinces de tube de dialyseFisher ScientificPI68011
Colonne de dessalage-10 jetableGE Healthcare17-0851-01
DNAseSigmaDN25-1G
DTT (DL-Dithiothreitol)RPID11000-50.0Avertissement : Toxicité orale aiguë ; irritation de la peau et des yeux
EDTAFisher ScientificS311-500
Fisherbrand Boîtes de Pétri avec couvercle transparentFisher ScientificFB0875712
GlycérolAcros Organics (Fisher)15892-0010
HEPESMillipore SigmaH4034-1KG
ImidazoleAcros Organics301870010Danger : Toxique, Irritant
IPTG (Isopropyl &beta ;-D-thiogalactopyranoside)Calbiochem (Millipore Sigma)420291Ne pas respirer la poussière. Évitez tout contact avec les yeux et la peau.
Laemmli Tampon d’échantillonBIO-RAD1610737
Luria Bertani AgarFluka (Millipore Sigma)L3027-1KGSuggestion : Autoclave avec agitateur magnétique dans le liquide, et remuer pendant le refroidissement. Attendez avant d’ajouter l’antibiotique jusqu’à ce que vous puissiez tenir vos mains sur la bouteille sans douleur pendant 30 secondes.
Luria Bertani MediaFisher BioréactifsBP1426-2
LysozymeSigmaL4919-5g
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorèse CellGel BoxBIO-RAD
Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge TubesNalgene (Thermo Scientific)3119-0050
NanodropThermo Fisher
Nouveau-Brunswick Innova 42R Shaker IncubateurEppendorfM1335
Sulfate de nickel hexahydraté (cristallin/certifié ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificN73-500Danger : Nocif en cas d’ingestion ou d’inhalation, irritation de la peau et des yeux
One Shot BL21(DE3) Chimiquement compétent E. coliInvitrogen (Thermo Fisher)C600003Peut être nocif en cas d’inhalation ou d’ingestion. Peut provoquer une irritation de la peau et des yeux chez les personnes sensibles.
One Shot BL21(DE3) pLysS Chimiquement compétent E. coliInvitrogen (Thermo Fisher)C606003Peut être nocif en cas d’inhalation ou d’ingestion. Peut provoquer une irritation de la peau et des yeux chez les personnes sensibles.
L’ADN plasmidique pet15bNovagen (Millipore Sigma)69661GenScript Inc. a été utilisé pour la synthèse de l’ADN commercial. Le plasmide pet15b a été utilisé pour les substrats CFP/YFP.
pet32bNovagen (Millipore Sigma)69016-3Le plasmide pet32b a été utilisé pour la construction de la cystéine protéase.
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, sans EDTAThermo FisherA32955Avertissement : Corrosion/irrigation cutanée ; lésions oculaires
Lecteur de plaquesDispositifs moléculairesModèle M5
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein StandardBIO-RAD161-0373
Réactif d’extraction de protéinesNovagen (Millipore Sigma)70584-4BugBuster ou Bper (Catalogue # 78248, ThermoFisher)
Q-Sepharose Fast FlowG.E. Healthcare17-0510-01Résine échangeuse d’anions
RunBlue (12 %) 17 puits PAGE gelsExpedeonBCG01227Tout gel de polyacrylamide prémoulé à 12 % peut être utilisé
RunBlue 20x SDS Running BufferExpedeonNXB50500Diluez 50 mL avec 950 mL d’eau désionisée pour obtenir 1x
RunBlue Instant Blue Gel Stain ExpedeonISB1LNe pas diluer, utiliser comme indiqué
Chlorure de sodiumFisher ChemicalS271-10
Sonifier Cell Disrupter 450 SonicatorBranson Ultrasonics (VWR)N° de modèle 101-063-346RLe sonicateur a été utilisé sur le niveau 5
Spectra/Por 6-8 kD MWCOSpectrum Labs132645TDialysis Tubing
SP-Sepharose Fast FlowG.E. Soins de santé17-0729-01Résine échangeuse de cations
Thrombine du plasma bovinSigmaT6634-500UN
Tris BaseFisher ScientificBP152-500Attention : Irritant pour les yeux/la peau
centrifuge Millipore Sigma UFC501096

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