Système centrifuge automatisé de contre-flux pour le traitement cellulaire à petite échelle

Summary

L'automatisation est essentielle à la mise à l'échelle et à la gestion des coûts dans la fabrication de cellules. Ce manuscrit décrit l'utilisation d'un dispositif de traitement centrifuge de contre-flux pour automatiser l'échange de tampons et les étapes de concentration cellulaire pour le biotraitement à petite échelle.

Abstract

La commercialisation réussie des thérapies géniques et cellulaires nécessite des procédés de fabrication rentables et évolutifs. L'échange de tampons et la concentration des produits sont des composants essentiels pour la plupart des procédés de fabrication. Cependant, aux premiers stades du développement du produit, ces étapes sont souvent effectuées manuellement. La centrifugation manuelle sans issue pour l'échange de tampons est laborieuse, coûteuse et non évolutive. Un système automatisé fermé peut effectivement éliminer cette étape laborieuse, mais la mise en œuvre peut être difficile. Ici, nous décrivons un dispositif de traitement cellulaire nouvellement développé qui convient au traitement cellulaire à petite et moyenne échelle et vise à combler l'écart entre le traitement manuel et l'automatisation à grande échelle. Ce protocole peut être facilement appliqué à divers types et processus cellulaires en modifiant le débit et la vitesse de centrifugation. Notre protocole a démontré la récupération élevée de cellules avec des temps de traitement plus courts par rapport au processus manuel. Les cellules récupérées du processus automatisé ont également maintenu leurs taux de prolifération. L'appareil peut être appliqué comme un composant modulaire dans un processus de fabrication fermé pour accueillir des étapes telles que l'échange de tampons, la formulation cellulaire, et la cryoconservation.

Introduction

Le paysage de la médecine moderne s'est rapidement transformé grâce aux développements récents des thérapies géniques et cellulaires (TCM). En tant que l'un des domaines de la recherche translationnelle qui connaît la croissance la plus rapide, le secteur de la GCT est également confronté à des défis uniques et sans précédent. En plus des résultats cliniques robustes, des procédés de fabrication efficaces et rentables sont essentiels au succès commercial de GCT, qui est particulièrement difficile à réaliser dans la fabrication à petite échelle¹. Le coût du temps, du travail et des assurances de qualité est amplifié lorsque chaque lot de cellule....

Protocol

1. Préparation des réactifs et des cellules pour l'échange de tampons

1. Préparer des tampons (voir Tableau des matériaux) dans une hotte à débit laminaire de classe 2. À l'aide d'une seringue et d'un assemblage d'aiguilles, retirer 50 ml de solution saline d'un sac salin de 500 ml. Remplacez cela par 50 ml d'albumine de sérum humain (HSA) pour faire 2% HSA en salin, qui servira de tampon de lavage.
2. Retirez les cellules des vaisseaux de culture et effectuez un nombre cellulaire pour déterminer la quantité et la viabilité des cellules de départ par exclusion bleue trypan. Chargez les cellules dans un sac de transfert.
   REMARQUE : Dan....

Results

Dans ce protocole, nous avons utilisé les cellules Jurkat et les MSC comme exemples représentatifs pour démontrer le processus automatisé d'échange de tampons. Pendant le processus, les cellules Jurkat et les MSC ont partagé les mêmes étapes de traitement avec les différences de force centrifuge et de vitesse de la pompe qui contrôlent le débit (tableau 1). La figure 2 montre des images représentatives capturées par la caméra de la façon dont le lit de cellule fluidisé peut .......

Discussion

Le protocole d'échange de mémoire tampon automatisé décrit est simple et convivial. Néanmoins, il y a quelques étapes clés dans ce protocole qui sont critiques et nécessitent une attention particulière. D'après notre expérience, lors du traitement de cellules plus grandes telles que les MSC (diamètre moyen de 10 à 15 m), chaque course devrait inclure au moins 1 x 10⁷ cellules pour atteindre une récupération optimale des cellules (Figure 4B). Le traitement de cellu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seringues Luer lock de 20 ml	BD	302830
20 % d’albumine sérique humaine (HSA)	CSL Behring	AUST R 46283
4-(Dimethylamino)benzaldehyde	Sigma-Aldrich	156477-25g
500ml Sachet salin IV	Fresenius Kabi	K690521
Antibiotique-Antimycotique	Thermo Fisher	Scientific 15240112
Compteur de cellules automatisé (Countess)	Thermo Fisher Scientific	N/A
Lames de chambre de comptage de cellules	Thermo Fisher Scientific	C10228
Cocktail de stimulation cellulaire (500x)	Thermo Fisher Scientific	00-4970-93
Sacs de transfert de cellules	Terumo	T1BBT060CBB
CellTiter AQueous One Solution Cell Prolifération Testation (MTS)	Promega	G3582
Centrifugeuse	Eppendorf	5810R
DMEM : Média F12	Thermo Fisher Scientific	11320082
EnVision Lecteur de plaques	Perkin Elmer	N/A
Sérum fœtal bovin (FBS)	Thermo Fisher Scientific	10099141
Human Interleukin 2 (IL2) Kit	Perkin Elmer	Al221C
Raccords Luer (femelle)	CPC	LF41
PC, ordinateur portable ou PC, tablette	ASUS	N/A
Lecteur de plaques (SpectraMax i3)	Dispositif moléculaire	: N/A
: IFN-&gamma humain recombinant ;	PeproTech	300-02
Rotea Dispositif de traitement de cellules centrifuges à contre-courant	Scinogy	N/A
Rotea Kit de traitement à usage unique	Scinogy	N/A
RPMI média	Thermo Fisher Scientific	11875119
Ciseaux chirurgicaux	ProSciTech	420SS
Acide trichloracétique	Sigma-Aldrich	T6399-250g
Trypan Blue stain	Thermo Fisher Scientific	T10282
Enzyme de digestion de la trypsine (TrypLE Express Enzyme)	Thermo Fisher Scientific	12604013