Suivi des cellules souches mésenchymales étiquetées à l'oxyde de fer superparamagnetic à l'aide de l'IRM après la livraison intranasale dans un modèle de murine traumatique de lésions cérébrales

Résumé

Présenté ici est un protocole pour la livraison non-invasive de cellules souches mésenchymales (MSC) et le suivi dans un modèle de souris de lésions cérébrales traumatiques. Les nanoparticules d'oxyde de fer superparamagnetic sont employées comme sonde d'imagerie par résonance magnétique (IRM) pour l'étiquetage mSC et le suivi in vivo non invasif suivant la livraison intranasale utilisant l'IRM en temps réel.

Résumé

Les thérapies à base de cellules souches pour les lésions cérébrales, telles que les lésions cérébrales traumatiques (ITC), sont une approche prometteuse pour les essais cliniques. Cependant, les obstacles techniques tels que l'administration et le suivi invasifs de cellules avec l'efficacité peu de transplantation demeurent des défis dans la thérapie translationnelle de tige-basée. Cet article décrit une technique émergente pour l'étiquetage et le suivi des cellules souches basés sur l'étiquetage des cellules souches mésenchymales (MSC) avec des nanoparticules d'oxyde de fer superparamagnetic (SPIO), ainsi que la livraison intranasale des MSC étiquetés. Ces nanoparticules sont de la fluorescéine isothiocyanate (FITC) intégrée et sans danger pour étiqueter les MSC, qui sont ensuite livrés au cerveau des souris induites par TBI par la voie intranasale. Ils sont ensuite suivis in vivo de façon non invasive par imagerie par résonance magnétique en temps réel (IRM). Les avantages importants de cette technique qui combine SPIO pour l'étiquetage cellulaire et la livraison intranasale incluent (1) non-invasif, suivi in vivo de MSC après livraison pendant de longues périodes de suivi, (2) la possibilité de régimes de dosage multiples dus au non-invasif l'itinéraire de la livraison de MSC, et (3) les applications possibles aux humains, en raison de la sûreté de SPIO, nature non envahissante de la méthode de cellule-tracking par MRI, et itinéraire d'administration.

Introduction

Les cellules souches mésenchymales (MSC) sont des candidats attrayants pour les thérapies à base de cellules souches dans les traitements des troubles du système nerveux central (SNC) et des blessures chez l'homme. En outre, les MSC ont été utilisés comme un véhicule pour la livraison de protéines thérapeutiques sur les sites de blessures^1,2. Au cours des dernières années, des innovations prometteuses ont été développées pour établir 1) de nouvelles voies d'administration cellulaire et 2) le suivi cellulaire pour les thérapies à base de cellules souches des troubles du SNC. La livraison intranasale des cellules souches dans le cerveau dépend de la capacité des cellules à contourner la plaque cribriforme et entrer dans l'ampoule olfactive partiellement par une voie parenchymale³. La combinaison de la livraison intranasale et de l'étiquetage des MSC avec des nanoparticules d'oxyde de fer superparamagnetic (SPIO) représente une approche prometteuse pour les applications cliniques des MSC dans le traitement des troubles de la SNC, puisque les nanoparticules SPIO sont des sondes sûres pour l'imagerie par résonance magnétique (IRM) et permettent le suivi longitudinal sensible non invasif des MSC après la livraison par IRM^3,4,5. En outre, la livraison intranasale est une voie sûre et non-invasive qui permet l'administration répétée dans un court laps de temps.

Cet article décrit une technique très sensible et non-invasive pour suivre MSCs in vivo post-intranasal delivery dans un modèle de souris de lésions cérébrales traumatiques (TBI), qui emploie des cellules étiquetées SPIO et MRI. Un avantage important de l'étiquetage SPIO est la détection sensible de SPIO dans les tissus par IRM, ce qui permet de suivre les cellules efficacement et non-invasivement. Les nanoparticules SPIO utilisées ici sont disponibles dans le commerce et étiquetées avec un fluorophophore isothiocyanate (FITC) de fluoréiocyanate (FITC), qui permet la détection de SPIO dans les tissus sans immunostaining ou traitement supplémentaire. En outre, il est possible d'effectuer un suivi longitudinal en temps réel et d'étudier la biodistribution des SDC livrés.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux dans ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux, avec l'approbation du Comité d'éthique de l'utilisation des animaux à l'Université médicale de Taipei (approbation no. BAC-2018-0574; 15.03.2019).

1. Étiquetage des MSC avec des nanoparticules SPIO

1. Pour étiqueter les MSC avec SPIO, ajouter 6 ml de milieu x d'étiquetage (25 g/mL de SPIO dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco [DMEM] sans sérum bovin fœtal [FBS]) à un flacon T75 contenant des MSC (80 % de confluence).
2. Incuber les cellules avec le support d'étiquetage dans un incubateur de CO₂ (37 oC, 5 % CO₂) sans trembler. Après 24 h, retirer délicatement le support d'étiquetage à l'aide d'une pipette stérile Pasteur avec une pointe en plastique fixée à un vide. Laver les cellules monocouches 2x avec 6 ml de phosphate tamponné saline (PBS) pour enlever toute trace de SPIO non internalisé.
   1. Pour déterminer si les cellules ont été étiquetées avec succès, vérifiez les cellules étiquetées sous un microscope fluorescent ou un microscope confocal si le SPIO est étiqueté avec un fluorophore (c.-à-d., comme ceux utilisés ici; Figure 1B,C). Alternativement, effectuer la coloration bleue prussienne pour les cellules (voir les étapes 6.2-6.4 pour le protocole de coloration).
3. Récoltez les cellules adhérentes par traitement avec 3 ml de trypsine et incuber à 37 oC. Après 5 min d'incubation, ajouter 7 ml de supports DMEM préréchauffés avec 10% FBS (v/v) pour inactiver la trypsine. Recueillir la suspension cellulaire à l'aide d'une pipette dans un tube conique de 15 ml.
4. Centrifuger la suspension cellulaire à 300 x g pendant 5 min. Jetez le supernatant et suspendez la pastille cellulaire dans PBS. Comptez les cellules viables à l'aide de colorant bleu trypan et d'un hémocytomètre.
   REMARQUE: La pastille cellulaire des cellules étiquetées apparaîtra comme une couleur foncée en raison de la charge de fer (Figure 1D). Ce protocole est pertinent pour l'étiquetage MSC et l'imagerie par IRM. La procédure d'étiquetage MSC⁶ a déjà été optimisée, et seules les étapes pour préparer les MSC étiquetés pour suivre in vivo sont incluses ici, puisque le suivi in vivo est au centre. Le protocole de culture et d'étiquetage d'autres types de cellules devrait être optimisé par le chercheur.
5. Ajuster la concentration cellulaire à l'aide de PBS à 150 000 cellules (ou un nombre qui donne un signal d'IRM suffisant) dans 18 L de PBS (ou le volume total qui sera utilisé dans la procédure de livraison intranasale).
   REMARQUE: On l'a remarqué qu'une concentration cellulaire supérieure à 150 000 cellules/18 L de PBS conduit à l'agrégation cellulaire, ce qui peut affecter l'efficacité de la livraison intranasale. Si un plus grand nombre de cellules est nécessaire pour la livraison intranasale, augmenter le volume total de suspension cellulaire et augmenter le nombre d'administrations intranasales, comme l'administration intranasale est une procédure non-invasive, et le dosage multiple est possible.

2. Blessures à l'impact cortical contrôlé (ICC)

REMARQUE: Dans ce protocole, les souris mâles C57 BL/6 (7-8 semaines) ont été maintenues dans un cycle de lumière/obscurité de 12/12 h avec un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau.

1. Pour préparer chaque souris aux blessures de l'ICC, administrer le zolazepam (50 mg/kg) et le xylazine (20 mg/kg) cocktail anesthésiant par injection intrapéritone (1 mL/kg). Assurez-vous que la profondeur de l'anesthésie est suffisante par un manque de réponse à l'orteil-pinch. Alternativement, placez la souris dans une chambre fournie avec 2%-4% isoflurane pour 60 s.
2. Raser la fourrure de la surface dorsale du crâne entre les oreilles à l'aide d'une tondeuse à cheveux électronique. Nettoyez la zone rasée plusieurs fois à l'aide d'un coton-tige stérile imbibé d'iode. Utilisez un coton-tige imbibé d'éthanol à 70 % pour nettoyer l'iode.
3. Placez la souris anesthésié dans le cadre stéréotaxique et fixez la souris à l'aide de barres d'oreilles et de barres nasales. Faire une incision midsagittal (environ 2,5 cm) dans la peau rasée à l'aide de ciseaux stériles pour accéder à la surface du crâne.
4. Enlever le tissu sur l'os à l'aide d'un tampon de coton pour exposer le crâne. Nettoyez la surface du crâne à l'aide d'un coton-tige imbibé de 3 % De₂O₂ pour 10 s, puis nettoyez-le à l'aide d'un tampon de coton sec.
   REMARQUE: Les sutures du crâne et le bregma et le lambda peuvent maintenant être facilement identifiés.
5. Identifiez les coordonnées de choix sur la surface du crâne pour la blessure de l'ICC et dessinez un cercle (4 mm de diamètre) autour des coordonnées à l'aide d'un crayon ou d'un marqueur approprié.
   REMARQUE: Dans ce protocole, les coordonnées à l'antiéroposterior (AP) -2.0 mm et médiolatérale (ML) -1,5 mm ont été utilisées pour l'induction de l'ICC.
6. Utilisez un microdrill et une bavure ronde (0,5 mm de diamètre) pour éclaircir le crâne au cercle marqué. Évitez d'appliquer de la pression pendant le forage, car le forage à travers l'os peut causer des dommages au parenchyme cérébral. Nettoyez la poussière osseuse à l'aide d'un coton-tige propre et sec.
7. Retirez délicatement le lambeau osseux à l'aide de forceps fins stériles pour exposer le dura mater tout en le gardant intact. Retirez la souris du cadre stéréotaxique utilisé pour la préparation avant la blessure et placez-la dans le cadre stéréotaxique de l'appareil CCI.
8. Stabiliser la tête de la souris à l'aide des barres d'oreilles et des barres nasales. Assurez-vous que la tête de la souris est de niveau dans la direction rostrale-caudale et ajustez les barres nasales, si nécessaire.
9. Suivez les instructions sur la boîte de contrôle pour zéro la pointe de l'impacteur à la surface corticale exposée. Assurez-vous que la pointe de l'impacteur est alignée directement au-dessus des coordonnées du cortex désiré pour être impactée à l'aide des roues de commande X et Y sur la base de l'impacteur.
10. Définiz les paramètres de l'expérience à l'aide de la boîte de commande avec une vitesse de 5 m/s, un temps d'occupation de 250 ms et une profondeur de blessure de 1 mm pour induire des blessures légères chez la souris.
11. Induire une blessure en appuyant sur le bouton ' impact' sur la boîte de commande. Écouvillonner tout saignement qui se produit à l'aide d'un coton-tige stérile.
12. Retirez la souris du cadre stéréotaxique et fermez l'incision à l'aide de sutures chirurgicales en soie. N'utilisez pas de pinces métalliques pour fermer le site chirurgical, puisque la souris sera soumise à un champ magnétique pour l'IRM.
13. Appliquer des antibiotiques topiques (neomycine bacitracin) sur le site chirurgical pour prévenir les infections. Gardez la souris sur le coussin chauffant et surveillez-la de près pendant la phase de récupération.
14. Administrer le kétoprofène (2,5 mg/kg, IP) quotidiennement pendant 3 jours après la chirurgie, à moins que l'administration de kétoprofène ne soit contredite avec les objectifs de l'étude.

3. Livraison intranasale

1. À l'induction post-CCI d'un jour, administrer le zolazepam (50 mg/kg) et le cocktail d'anesthésie de xylazine (20 mg/kg) par injection i.p. Assurez-vous que la souris est profondément anesthésié par le manque de réponse à l'orteil-pinch.
2. Préparer la souris pour l'accouchement intranasal de MSCs par traitement hyaluronidase.
   1. Prenez les éraflures de la souris et tournez fermement sur le dos tout en immobilisant le crâne. Placez la pointe d'une pipette qui contient de l'hyaluronidase dans le PBS stérile (4 U/L) près de la narine de la souris à un angle de 45 degrés.
   2. Administrer 3 llde de suspension hyaluronidase dans chaque narine. Maintenez la souris immobilisée et orientée vers le haut sur un tampon propre pendant 5 min. Répétez le traitement hyaluronidase 4x (total de 100 U suspension hyaluronidase).
3. Après le traitement à l'hyaluronidase, gardez la souris traitée sur un coussinet propre vers le haut pendant 30 min.
4. Pour délivrer des MSC dans le cerveau, maintenez la souris fermement, comme décrit à l'étape 3.2.1. Administrer 3 l/narine de suspension MSC avec un intervalle de 3 s. Continuez à maintenir la souris dans la même position pendant 30 s jusqu'à ce que les gouttes d'échantillon aient complètement disparu.
   REMARQUE: Évitez de former des bulles d'air pendant l'administration.
5. Répétez l'administration avec un intervalle de 2 min jusqu'à 3x.
   REMARQUE: Le nombre total de cellules à livrer est de 150 000, de sorte que 18 l de la suspension cellulaire peuvent être livrées à une dose de 3 l pour chaque narine, 3x chacune.
6. Remettre la souris dans sa cage et la surveiller de près jusqu'à ce qu'elle se rétablisse complètement de l'anesthésie.

4. Imagerie par résonance magnétique in Vivo

REMARQUE: La coloration histologique du tissu cérébral a été précédemment employée pour confirmer la livraison réussie des cellules souches après administration intranasale. Cependant, cette méthode ne peut être utilisée que comme point de terminaison d'une étude, et non pas longitudinalement. L'utilisation de sondes IRM pour étiqueter les cellules souches thérapeutiques permettra un suivi in vivo longitudinal des cellules à l'aide de l'IRM. Fait important, ce protocole réduit efficacement le nombre d'animaux requis. Dans ce protocole, la balayage de MRI a été exécutée aux jours 1, 7, et 14 post-livraison des MSCs.

1. Pour préparer la souris à l'IRM, anesthésiez la souris à l'isoflurane (5% d'isoflurane en 1 L/min d'O₂ pour l'induction, 1,5% à 2% d'isoflurane pour l'entretien). Effectuer un pincement d'orteil pour s'assurer que la souris atteint le niveau d'anesthésie requis.
2. Placez la souris sur le support d'imagerie et fixez sa position à l'aide de robinets ou de toute autre méthode appropriée. Déplacez le support vers le centre de la bobine IRM (aimant de 7 T/40 cm) et connectez la connexion de surveillance.
3. Pour acquérir des scans pondérés en T2 à l'aide d'une séquence spin-écho, définir le temps de répétition (TR) à 1500 ms et le temps d'écho (TE) à 2,8 ms.
4. Utilisez un champ de vision de 16 mm x 16 mm (FOV), une matrice d'acquisition de 128 x 128 (MTX) et une épaisseur de tranche de 0,75 x 0,8 mm² avec quatre moyennes de signal et un angle de bascule de 90 degrés (FA).
5. Retirez le support de la souris du centre de bobine d'IRM après avoir terminé les balayages. Remettre la souris dans sa cage et la surveiller de près jusqu'à ce qu'elle se remette complètement de l'anesthésie.
6. Pour suivre et quantifier les MSC étiquetés sur les images pondérées par T2, utilisez le logiciel ITK-SNAP (version 3.8.0)⁷.
   1. Transférer les données brutes des IRM de l'ordinateur de l'appareil d'IRM à l'ordinateur utilisé pour l'analyse dans un format DICOM (imagerie numérique et communications en médecine).
   2. Exécutez le logiciel ITK-SNAP et chargez les images IRM en cliquant sur le bouton Fichier. Ensuite, cliquez sur Open Main Image dans le menu. Appuyez sur le bouton Image ouverte dans la fenêtre d'affichage, puis localisez et ouvrez les images IRM à l'aide du bouton Parcourir.
      REMARQUE: La visualisation des cellules étiquetées dans les images IRM apparaîtra sous forme de zones hypointenses. Si le contraste d'image doit être ajusté, sélectionnez Outils Contraste d'image.
   3. Créez des segmentations des zones hypointenses et des lésions ou d'autres parties du cerveau en sélectionnant active Label dans la section étiquettes de segmentation. Utilisez différentes couleurs d'étiquette s'il y a différents segments (si la segmentation de plus d'une partie est nécessaire).
   4. Utilisez l'outil Polygon dans la barre d'outils principale pour dessiner autour des zones hypointenses représentant les MSC étiquetés SPIO. Select Accept, situé en dessous de l'image IRM. Les zones segmentées apparaîtront comme la même couleur de l'étiquette active assignée à ce segment particulier. Répétez cette étape de segmentation pour toutes les tranches d'IRM.
   5. Développer une carte 3D des zones segmentées pour représenter la distribution MSC dans l'ensemble du cerveau en sélectionnant l'outil Scalpel au bas de la barre d'outils 3D, situé dans la section Étiquettes de segmentation au bas de la boîte à outils TheITK-SNAP. Ensuite, appuyez sur Accepter au bas de la carte 3D créée.
   6. Pour effectuer une analyse quantitative (volume et intensité moyenne) des zones hypointenses segmentées représentant les cellules étiquetées, appuyez sur le bouton segmentation dans le panneau supérieur et sélectionnez Volume et Statistiques.

5. Fixation du cerveau de la souris et cryosectioning

1. Pour fixer le cerveau de souris, effectuer la perfusion transcardiaque avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) après la dernière IRM, comme précédemment décrit⁸.
   1. Décapiter la tête et extraire le cerveau⁸. Fixer le cerveau avec 4% de PFA pendant au moins 48 h à 4 oC.
   2. Déshydratez le cerveau en l'immergeant dans une solution de saccharose de 30 % à 4 oC jusqu'à ce que le cerveau s'enfonce au fond de la solution.
2. Intégrer le cerveau dans la solution optimale de température de coupe (OCT) et congeler à -20 oC. Sectionnez le cerveau avec un microtome cryostat en tranches d'une épaisseur de 14 m et montez-les sur des lames. Conserver les diapositives des sections à -20 oC jusqu'à ce qu'elles soient utilisées davantage.

6. Staining bleu prussien

REMARQUE: La coloration bleue prussienne est couramment utilisée pour détecter la teneur en fer des cellules étiquetées SPIO. Ici, la coloration bleue prussienne est utilisée pour confirmer que les signaux hypointenses dans les images d'IRM correspondent aux MSC étiquetés SPIO et non aux artefacts. La coloration bleue prussienne est l'une des méthodes histochimiques les plus sensibles utilisées pour détecter le fer dans les tissus et peut être utilisée pour identifier ne serait-ce qu'un seul granule de fer dans les cellules.

1. Laver les diapositives des sections du cerveau avec de l'eau distillée pendant 5 min.
2. Effectuer la coloration bleue prussienne en immergeant les diapositives pendant 30 min dans la solution de coloration, qui contient de l'acide chlorhydrique à parts égales (10%) et ferrocyanide de potassium (10%) préparé immédiatement avant utilisation.
3. Laver 3x avec de l'eau distillée, pendant 5 min chacun. Counterstain les sections avec le rouge rapide nucléaire pendant 5 min. Rincer les diapositives 2x avec de l'eau distillée.
4. Déshydrater les sections graduellement en immergeant les lames dans 95% et 100% d'alcool pendant 2 min chacun. Ajouter le bordereau avec un support de montage résineux.
5. Utilisez un microscope léger pour détecter les cellules tachées dans les sections du cerveau.
   REMARQUE: Le fer dans les cellules étiquetées apparaîtra sous forme de dépôts de couleur bleue.

Résultats

Vingt-quatre heures après la livraison intranasale, les MSC étiquetés SPIO ont été détectés comme des zones hypointenses fortes médiales à la blessure corticale sur les images t2 -weighted (figure 2B), indiquant la migration ciblée de SPIO au site de blessure. Cette migration est demeurée visible jusqu'à 14 jours après la livraison, car les signaux hypointenses se sont avérés visibles sans réduction significative pour cette période(figure 2B). Les animaux blessés traités par PBS n'ont montré aucune zone hypointense, ce qui indique que les zones hypointenses observées correspondent aux MSC étiquetés SPIO et non à signaler les artefacts (Figure 2A) La biodistribution des MSC étiquetés qui ont été observés in vivo avec IRM a été visualisée à l'aide de la reconstruction 3D(figure 2C,D). La migration des MSC vers le cortex blessé a été confirmée histologiquement par la coloration bleue prussienne et la détection du canal FITC du SPIO étiqueté FITC dans les MSC étiquetés(figure 3A,B).

Figure 1 : Diagramme schématique du protocole et confirmation in vitro de l'utilisation de SPIO par mSCs. (A) MSCs ont été incubés avec SPIO pendant 24 h pour l'étiquetage. Ensuite, les MSC étiquetés ont été livrés dans un modèle de souris TBI via un itinéraire intranasal (IN). L'IRM à différents moments a été effectuée pour suivre les MSC étiquetés. La confirmation d'un étiquetage suffisant des MSC par SPIO a été obtenue par microscopie à fluorescenceB) et (C) microscopie confocale à l'aide du canal FITC, puisque les nanoparticules SPIO ont été étiquetées avec FITC. (D) La pastille cellulaire des MSC étiquetés semblait de couleur foncée en raison de la charge de fer. FITC - isothiocyanate de fluorescéine; SPIO - particules superparamagnetic d'oxyde de fer; MSCs et cellules souches mésenchymales; IRM et imagerie par résonance magnétique; IN intranasal; TBI - traumatisme crânien. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : L'IRM en temps réel permet la détection et le suivi de la migration du MSC étiqueté e sPIO vers les sites de blessures dans le cerveau des souris induites par le TBI. (A) Les souris ont été soumises à tBI, suivi d'un traitement avec des MSC étiquetés PBS ou SPIO, administrés par voie intranasale 24 h après des blessures. Les sections coronales des images pondérées en T2 ont montré que les MSC étiquetés étaient une zone hypointense (tête de flèche) sur le bord du site de blessures (zone décrite) à 1, 7 et 14 jours après la livraison. Les souris PBS-traitées ne montrent aucune zone hypointense. (B) Processus de segmentation de la zone du site de blessures (vert) et mSC étiquetés (rouge) à partir d'images coronales T2MD-IRM. (C) reconstruction 3D du traitement du cerveau de la souris basée sur des images pondérées en T2 illustrant la biodistribution des MSC étiquetés SPIO dans le cerveau 14 jours après la livraison. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : L'analyse histologique confirme la présence de SSC étiquetés SPIO dans le cerveau des animaux traités. La coloration bleue prussienne des sections de cerveau d'une souris(A) traitée avec PBS (contrôle) et (C) souris traitée avec des MSC SPIO-étiquetés. Les cellules SPIO-positives ont été détectées dans la souris MSC-traitée (cellules boxed, bleue), alors que la souris de commande n'a montré aucune cellules positives au site de blessure dans le cortex à 14 jours après la livraison, confirmant des observations de MRI. L'analyse de microscopie de fluorescence du cortex d'une souris témoin(B) traitée avec PBS et (D) souris traitée avec des MSC SPIO-étiquetés a été effectuée 14 jours après la livraison. L'analyse a révélé la présence de cellules SPIO-positives marquées par le FITC (cellules en boîte, vertes) au cortex blessé dans la souris MSC-traitée, mais aucun signal FITC n'a été observé dans le cortex de la souris PBS-traitée. Barres d'échelle de 50 m, sauf indication contraire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Le protocole décrit ici représente les procédures générales pour l'étiquetage SPIO des MSC et le suivi PAR IRM des MSC étiquetés SPIO après l'accouchement intranasal. Le protocole permet d'étudier la migration et la biodistribution des MSC après la livraison in vivo dans le cerveau, en utilisant une méthode non invasive.

Les MSC sont des candidats attrayants pour les thérapies à base de cellules souches pour les troubles et les blessures du SNC en raison de leur capacité à sécréter des facteurs trophiques qui 1) déclenchent des processus neuroréparateurs et 2) fournissent une neuroprotection, en raison de leurs effets anti-inflammatoires dans la zone des blessures^9,10,11,12. Bien que le suivi et la détection à long terme par IRM des MSC étiquetés SPIO puissent être limités en raison de la dilution du SPIO intercellulaire avec division cellulaire, les cellules étiquetées peuvent être détectées pendant plusieurs semaines après la transplantation dans le cerveau des modèles animaux¹³.

Le protocole d'étiquetage des MSC avec des nanoparticules SPIO recouvertes de dextran sans agents de transfection est également décrit ici. D'autres protocoles ont été utilisés dans la littérature^14,15,16. Cependant, dans tous les cas, ces protocoles devraient être ajustés pour le type de cellule, la taille de SPIO, le temps d'incubation, et la concentration de SPIO. Il a été démontré que les MSC avaient un potentiel de différenciation chondrogénique altéré, mais non une différenciation adipogénique sur l'étiquetage SPIO¹⁷. Par conséquent, il est fortement recommandé que les tests de différenciation soient effectués avant la livraison des cellules souches afin d'évaluer l'influence de SPIO sur la puissance de différenciation des cellules souches. Dans une étude précédente, il a été démontré que l'étiquetage MSC avec le même type de SPIO et la concentration utilisée dans l'ici n'a pas affecté la puissance de différenciation ostéogénique ou adipogénique de MSCs⁶.

La voie intranasale de la livraison thérapeutique de cellules souches pour des désordres et des dommages de cerveau est une approche prometteuse pour l'application clinique des cellules souches. Cependant, les mécanismes intrinsèques et moléculaires qui dictent les comportements des cellules souches dans la cavité nasale restent flous. Bien que la voie intranasale soit largement explorée pour la livraison de petites molécules, la taille et le comportement de biodistribution de la tige thérapeutique diffèrent des petites molécules. Le protocole actuel démontre que les SSM ont tendance à migrer vers le site des blessures après l'accouchement intranasal.

Ici, des images pondérées en T2 ont été utilisées pour suivre les MSC étiquetés SPIO. D'autres rapports ont utilisé l'imagerie par écho de gradient. Cependant, les artefacts de susceptibilité sont souvent observés dans l'imagerie d'écho de gradient due au SPIO intercellulaire. Dans le protocole actuel, l'emplacement des zones hypointenses représentant les MSC étiquetés SPIO sur les images pondérées en T2 était le même que celui de l'OIP dans les sections cérébrales détectées par l'examen histologique(figure 3). Cela indique la sensibilité adéquate de l'imagerie par écho de spin pondérée par T2 pour le suivi MSC étiqueté SPIO dans le cerveau.

En résumé, le protocole décrit est bénéfique pour les études in vivo de suivi des cellules souches des lésions cérébrales et des troubles. Le suivi longitudinal des cellules souches in vivo a traditionnellement été effectué en sacrifiant des animaux à plusieurs moments. Le protocole actuel fournit une approche non invasive et efficace pour l'administration et le suivi des SSM, ce qui représente une procédure potentielle pour la thérapie à base de cellules souches pour les lésions cérébrales et les troubles dans les milieux cliniques.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Fournitures de culture cellulaire (plastiques)	ThermoFisher Scientific	Variable	Remplaçable avec n’importe quelle source
Lame de microtome jetable	VWR	95057-832
D-MEM/F-12 (1x) avec GlutaMAX	GIBCO	10565-018
Milieu d’enrobage pour échantillons de tissus congelés (O. C. T.)	Sakura Finetek	4583
Sérum de veau fœtal (FBS)	GIBCO	12662-029
Microscope à fluorescence à champ sauvage	Olympus Olympus	BX43
Forcept	Fine Science Tools	11293-00	Chirurgie
Gentamicine (10 mg/mL)	GIBCO	15710-064
Tondeuse à cheveux	Pet Club	PC-400
Dispositif de contusion pour traumatisme crânien	Systèmes de précision et instrumentation	Modèle TBI-0310
Hyaluronidase à partir de testicules bovins	MilliporeSigma	H3506
Logiciel ITK-SNAP	Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) de l’Université de Pennsylvanie et Institut de calcul et d’imagerie scientifiques (SCI) de l’Université de l’Utah	ITK-SNAP 3.8.0
Kétamine ( Ketavet)	Pfizer	778-551
Souris	National Laboratory Animal Center, Taïwan	C57BL6	Souche de souris de type sauvage utilisée dans l’étude
Microdrill	Nakanishi	NE50	Combiner avec des bavures pour générer la fenêtre osseuse
Microtome	Leica	RM2265
Souris (C57BL/6) Cellules souches mésenchymateuses	GIBCO	S1502-100
Scanner IRM	Bruker Biospec
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Corning Cellgro/ThermoFisher	21-031-CV
Povidone-iode 7,5 %	Produit Purdue L.P.		Gommage chirurgical
Bleu de Prusse Teinture	Abcam	ab150674
Ciseaux	Outils scientifiques fins	14084-08
Chirurgie Cadre stéréotaxique	Kopf Instruments	Modèle 900
Nanoparticules d’oxyde de fer superparamagnétique (SPIO)	BioPAL	Molday ION EverGreen, CL-50Q02-6A-51	Marquage des cellules souches pour le suivi in vivo à l’aide de l’IRM
Suture monofilament	Ethicon	G697	Suture
Timer	Wisewind		Remplaçable avec n’importe quelle source
TrypLE	GIBCO	12604-013
Xylazine (Rompun)	Bayer	QN05 cm92