Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Culture de la petite colonie Variante de Pseudomonas aeruginosa et Quantitation de son Alginate

8.8K vues

⸱

DOI :

10.3791/60466

⸱

22 février 2020

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Joan C. Edwards School of Medicine, Marshall University, 2Progenesis Technologies LLC, Robert C. Byrd Biotechnology Science Center, 3Department of Pediatrics, Joan C. Edwards School of Medicine, Marshall University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous décrivons une condition de croissance à la culture de la variante petite colonie de Pseudomonas aeruginosa. Nous décrivons également deux méthodes séparées pour la détection et la quantitation de l’alginate d’exopolysaccharide produit par P. aeruginosa utilisant un test traditionnel de carbazole d’acide uronique et un anticorps monoclonal alginate-spécifique (mAb) basé ELISA.

Résumé

Pseudomonas aeruginosa, un agent pathogène bactérien gram-négatif opportuniste, peut surproduire un alginate exopolysaccharide résultant en un phénotype unique appelé mucoidy. L’alginate est lié aux infections pulmonaires chroniques ayant pour résultat le pronostic pauvre dans les patients présentant la mucoviscidose (CF). Comprendre les voies qui régulent la production d’alginate peut aider à l’élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant la formation d’alginate. Un autre phénotype lié à la maladie est la variante de la petite colonie (CVC). Le VCS est dû à la croissance lente des bactéries et souvent associé à une résistance accrue aux antimicrobiens. Dans cet article, nous montrons d’abord une méthode de culture d’une forme génétiquement définie de P. aeruginosa SCV due aux mutations de biosynthèse de pyrimidine. La supplémentation des bases azotales, uracil ou cytosine, retourne la croissance normale à ces mutants, démontrant la présence d’une voie de récupération qui récupère les bases libres de l’environnement. Ensuite, nous discutons deux méthodes pour la mesure de l’alginate bactérien. La première méthode repose sur l’hydrolyse du polysaccharide à son monomère d’acide uronique suivie d’une dérivation avec un réactif chromogénique, le carbazole, tandis que la seconde méthode utilise un ELISA basé sur un mAb disponible dans le commerce, spécifique à l’alginate. Les deux méthodes nécessitent une courbe standard pour la quantitation. Nous montrons également que la méthode immunologique est spécifique pour la quantification d’alginate et peut être employée pour la mesure de l’alginate dans les spécimens cliniques.

Introduction

Les infections pulmonaires chroniques avec Pseudomonas aeruginosa sont une cause majeure de morbidité et de mortalité chez les patients atteints de fibrose kystique (FK). Pendant la petite enfance, les patients sont colonisés par de multiples agents pathogènes bactériens, y compris des isolats nonmucoïdes de P. aeruginosa1,2. L’émergence des isolats de la petite colonie (SCV) ainsi que des isolats mucoïdes est un marqueur pour l’apparition d’infections chroniques. Les isolats SCV sont très résistants aux médicaments3 en raison de leur faible taux de croissance4, ce qui les rend un moyen de dissuasion sévère dans les régiments de traitement et d’autres infections chroniques5 par P. aeruginosa. Les travaux d’Al Ahmar et coll.6 ont montré un lien entre le VHC et la mucoidy lié par la biosynthèse de novo pyrimidine. La famine de pyrimidine, due aux mutations dans les gènes impliqués dans la production de pyrimidine, a eu comme conséquence le phénotype de SCV dans la souche de référence nonmucoid PAO1 et le dérivé mucoid, PAO581 (PAO1mucA25).

Même si la surproduction d’alginate est un marqueur important de la maladie pour les infections pulmonaires chroniques dans les fc, il n’est pas clair s’il existe une corrélation directe entre la quantité d’alginate et la pathologie pulmonaire, et il n’est pas clair si l’alginate peut être utilisé comme marqueur de pronostic pour le traitement7. La production d’alginate est principalement réglementée par deux opopons, un opperon réglementaire (algUmucABCD)8,9 et l’opéron biosynthétique(algd opéron)10,11. La production d’alginate est étroitement réglementée par le facteur sigma AlgU9,12 (également connu sous le nom AlgT) et la dégradation du facteur anti-sigma MucA13. La capacité de surveiller la production d’alginate in situ à partir des échantillons d’écrachats des patients peut aider au développement de nouvelles options thérapeutiques.

Ici, nous décrivons une condition de croissance qui détecte la présence de VCS causée par des mutants qui ne peuvent pas synthétiser la pyrimidine de novo. La supplémentation de l’uracil et/ou de la cytosine, la base azotée du nucléotide de pyrimidine, au milieu active la voie de récupération, rétablissant ainsi la croissance normale chez les mutants. Cette méthode de croissance pour ces mutants spécifiques de SCV peut être employée comme méthode de criblage pour identifier des mutations de pyrimidine dans des échantillons patients. En outre, nous discutons deux méthodes pour la détection et la mesure de l’alginate produit et sécrété par P. aeruginosa. La première est la méthode traditionnelle14,15,16 de dégrader le polysaccharide en utilisant une forte concentration d’acide, puis en ajoutant un indicateur colorimétrique pour quantifier la concentration dans l’échantillon. La deuxième méthode, développée en laboratoire, utilise l’Analyse immunosorbent enzymatique (ELISA) à l’aide d’un anticorps monoclonal anti-alginate (mAb) développé par QED Biosciences. La méthode ELISA s’avère plus spécifique et plus sensible que l’indice d’acide uronique et permet une utilisation plus sûre en raison de l’évitement de l’acide sulfurique très concentré. Avec la capacité de l’ELISA d’être utilisé directement sur les échantillons d’émoi du patient pour mesurer l’alginate, il peut être développé comme un outil de diagnostic de surveillance pour suivre la quantité d’alginate présente dans les poumons à différentes périodes de l’infection.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

1. Conditions de croissance du CVS et activation physiologique de la voie de sauvetage

  1. Détection du VCS.
    1. Streak le P. aeruginosa souches PAO1, PAO1-pyrD, PAO581, et PAO581-pyrD sur préwarmed Pseudomonas isolation agar plaques (PIA) plaques et de croître à 37 oC pendant 48 h. Sur la plaque de croissance, identifier un seul isolat de colonie qui a le phénotype SCV (taille de la colonie de 1 à 3 mm par opposition à la taille normale de la colonie de 3 à 5 mm).
    2. Répétez l’étape 1.1.1 pour obtenir un isolat pur du VCS.
      REMARQUE : La croissance peut nécessiter jusqu’à 72 h en raison du taux de croissance lent des colonies de VCS.
  2. Activation physiologique de la voie de récupération.
    1. À l’aide d’une boucle d’inoculation stérile, choisissez la colonie de VCS dans la plaque PIA et faites une stries sur une ÉPL préchauffée complétée par 0,1 mm d’uracil. Faire pousser la plaque à 37 oC pour 24 à 48 h.
      REMARQUE : Toutes les plaques PIA utilisées dans ce protocole contiennent 20 ml/L de glycérol ajouté au mélange avant l’autoclage. Après l’autoclage et après que la température du mélange soit inférieure à 55 oC, ajouter 11,21 mg/L d’uracil (0,1 mm) au support liquide avant de verser les plaques. Cette méthode aiderait à identifier les mutations de pyrimidine qui causent le phénotype de SCV dans P. aeruginosa. Si le phénotype SCV est le résultat de ladite mutation, alors la croissance et la taille normales de la colonie (3 à 5 mm) seraient observées sur les plaques D’ÉFVP complétées par l’uracil. Si les souches avaient la capacité de produire de l’alginate, alors le phénotype mucoid sera également de retour sur la supplémentation uracil.

2. Test de carbazole d’acide uronique

  1. À partir d’une culture pure de souche désirée à tester, identifiez une seule colonie. À l’aide d’un cure-dent stérile, choisissez la colonie et placez le cure-dent dans un tube à essai de culture contenant 5 ml de bouillon d’isolement Pseudomonas (PIB). Cultivez dans un incubateur shaker à 37 oC pendant 24 h.
    REMARQUE : Les souches suivantes PAO581 (PAO1mucA25), PAO581carA, PAO581carB, et PAO581pyrD ont été cultivées sur des plaques PIA ou des plaques PIA complétées par 0,1 mM d’uracil pour récolter l’alginate pour la mesure.
  2. Sur une assiette PIA préchauffée, ajoutez 150 l de bouillon DE PIB cultivé (pour 15 mm x 100 mm plaques) ou 450 'L de bouillon (pour les plaques de 15 mm x 150 mm). À l’aide d’un épandeur de cellules stériles, étendre le bouillon sur l’assiette. Faire pousser la plaque à 37 oC pendant 24 h.
    REMARQUE : Aspirez tout excès de liquide, le cas échéant, de la plaque à l’aide d’un tuyau en faisant basculer la plaque d’un côté. Les plaques DE PI et PIA utilisées dans le protocole contiennent 20 ml/L de glycérol à utiliser par les cellules comme source de carbone pour faciliter la production d’alginate.
  3. À l’aide d’un contrôleur de pipette et d’une pipette stérile de 50 ml, ajouter 0,85 % de NaCl à la pelouse cultivée et recueillir l’échantillon en ferraillant la plaque à l’aide d’un épandeur de cellules. Aspirez l’échantillon à l’aide d’une tuyauterie fraîche de 50 ml dans un tube de collecte de 50 ml. Vortex l’échantillon à haute pour mélanger et placer les échantillons sur la glace.
    REMARQUE: Le volume de NaCl ajouté 0,85% varie en fonction de la taille de la plaque. Pour les plaques de 15 mm x 100 mm, utilisez 10 à 30 ml et pour les plaques de 15 mm x 150 mm, utilisez 20 à 50 ml.
  4. Mesurer la densité optique à 600 nm (OD600) des échantillons en ajoutant 1 ml de l’échantillon à une cuvette jetable et en lisant l’OD à l’aide d’un spectrophotomètre. Répétez cette étape 2x pour obtenir un triplement des lectures pour chaque échantillon.
  5. Ajouter 3 ml de la solution d’acide sulfurique/borate dans des tubes de culture et laisser s’asseoir sur la glace. Ajouter 350 L de l’échantillon recueilli SLOWLY au mélange d’acide dans les tubes à essai et vortex à basse pression.
    1. Préparer le stock de borate en ajoutant 10,099 g de poudre d’hydroxyde de potassium (KOH) à 45 ml d’eau. Ajouter 24,74 g d’acide borique (H3BO3) au mélange et porter le volume à 100 ml.
    2. Placer 1 bouteille de L dans un évier avec de la glace et remplir la bouteille de 500 ml d’acide sulfurique concentré. SLOWLY ajouter 15 ml du bouillon de borate préparé. Laisser refroidir la bouteille.
    3. Ajouter 10 ml de stock de borate pour un total de 25 ml. Une fois la bouteille refroidie, porter le volume à 1 L.
      CAUTION: Cette méthode repose sur l’utilisation d’acide sulfurique très concentré. Un équipement de protection individuelle approprié devrait être utilisé pour assurer le protocole de sécurité et d’élimination approprié de l’échantillon.
      REMARQUE : Pour un contrôle positif, une concentration connue d’acide d’acide mannuronique D et/ou d’échantillons d’alginate bactériens connus récoltés et purifiés par des souches d’alginate produisant de P. aeruginosa (p. ex. : PAO581-PAO1mucA25). Pour une utilisation négative de contrôle 0,85% solution NaCl et / ou PAO1AlgD (suppression dans le cadre du gène algD qui rend la bactérie complètement incapable de produire de l’alginate). Plusieurs tubes peuvent être fabriqués à partir de chaque échantillon pour augmenter le nombre de répétitions techniques pour faciliter l’analyse statistique. Préparer les tubes de 3 à 5 de chaque échantillon.
  6. Ajouter 100 'L de 0,1% de carbazole dans la solution d’éthanol au mélange acide/échantillon. Cap le tube et le vortex sur un réglage moyen pendant 5 s. Placer dans un bain sec à 55 oC pendant 30 min.
  7. Après l’incubation, retirer brièvement les tubes et le vortex à hauteur et laisser refroidir pendant 5 min.
    REMARQUE: La couleur à voir serait une nuance de violet. La couleur restera stable pour la mesure pendant 1/2 h.
  8. Lisez l’OD530 de chaque tube en ajoutant 1 ml du mélange à une cuvette propre et en lisant l’OD des échantillons à 530 nm sur un spectrophotomètre. Utilisez le tube avec 0,85% NaCl comme un blanc au spectrophotomètre.
  9. Préparer une courbe standard en mesurant l’OD530 des dilutions en série des concentrations connues d’acide D-Mannuronique (1 024 g/mL, 512 g/mL, 256 g/mL, 128 'g/mL, 64 'g/mL, 32 'g/mL, 16 'g/mL, et 8 'g/mL). Répéter 2x. Extraire une équation linéaire de ces lectures.
    REMARQUE : La courbe standard n’a besoin d’être faite qu’une seule fois. L’équation linéaire extraite peut être utilisée pour des tests ultérieurs.
    1. Calculer la concentration de l’alginate dans chaque échantillon en utilisant la courbe standard et diviser la concentration d’alginate de l’équation linéaire par OD600 pour obtenir la quantité totale d’alginate par OD600.

3. ELISA pour Alginate Quantitation

  1. Répétez les étapes 2.1-2.4 pour obtenir des échantillons pour la mesure de l’alginate.
    REMARQUE: Les souches utilisées étaient PAO1, PAO1AlgD, et PAO1 portant pHERD20T-algU.
  2. À l’aide d’une micropipette, ajouter 50 ll de l’échantillon prélevé à une plaque non traitée de 96 puits. Ajouter 50 l de tampon de revêtement (carbonate/bicarbonate tampon pH 9,6) aux puits. Incuber la plaque à 37 oC pendant 2 h.
    REMARQUE : Pour un contrôle positif, une concentration connue d’acide D-Mannuronique et/ou une souche stable connue produisant de l’alginate (p. ex. : PAO581-PAO1mucA25)peut être utilisée. Pour une utilisation négative de contrôle 0,85% solution NaCl et / ouAlgD PAO1 (suppression dans le cadre du gène algD rend la bactérie complètement incapable de produire de l’alginate). Plusieurs puits peuvent être fabriqués à partir de chaque échantillon pour augmenter le nombre de répétitions techniques pour faciliter l’analyse statistique. Préparer les 3 à 5 puits de chaque échantillon.
  3. À l’aide d’une bouteille d’éclaboussure, laver les puits d’assiette 2x avec 1x tampon tampon de phosphate (PBS) avec 0,05% Tween 20 (PBS-T) en remplissant les puits, puis les égoutter en renversant la plaque.
  4. À l’aide d’une micropipette, ajouter 200 l de tampon de blocage (10 % de lait écrémé en PBS-T) aux puits. Incuber à 4 oC pendant la nuit.
    REMARQUE : Enveloppez l’assiette dans un film de paraffine ou réduisez l’enveloppe pour éviter toute évaporation dans le réfrigérateur.
  5. À l’aide d’une bouteille d’éclaboussure laver les puits d’assiette 2x avec PBS-T en remplissant les puits, puis les égoutter en renversant la plaque.
  6. À l’aide d’une micropipette, ajouter 100 oL d’anticorps primaires dilués (anticorps monoclonaux anti-alginates de souris) aux puits et incuber à 37 oC pendant 1 h et demi.
    REMARQUE : L’anticorps primaire (anticorps monoclonal anti-alginate de souris) a été fourni à une concentration de 0,5 g/mL (dilution de 1:2 000 de 1 mg/mL) dans la solution diluante d’anticorps (1 % de lait écrémé dans 1 x PBS).
  7. À l’aide d’une bouteille d’éclaboussure laver les puits d’assiette 3x avec PBS-T en remplissant les puits, puis les égoutter en renversant la plaque.
  8. À l’aide d’une micropipette, ajouter 100 l d’anticorps secondaires dilués aux puits et incuber à 37 oC pendant 1 h et demi.
    REMARQUE : L’anticorps secondaire utilisé était l’anticorps poly-HRP anti-souris perçant de chèvre à une concentration de 0,25 g/mL (dilution de 1:2,000 de 0,5 mg/mL) dans la solution de diluant d’anticorps.
  9. À l’aide d’une bouteille d’éclaboussure laver les puits d’assiette 3x avec PBS-T en remplissant les puits, puis les égoutter en renversant la plaque.
  10. À l’aide d’une micropipette, ajouter 100 l de solution TMB-ELISA(Tableau des matériaux)et incuber à température ambiante pendant 30 min dans l’obscurité.
    REMARQUE: La couleur d’une réaction positive serait une nuance de bleu.
  11. À l’aide d’une micropipette, ajouter 100 l de solution d’arrêt (2 N d’acide sulfurique).
    REMARQUE : La couleur passera du bleu au jaune lorsque la solution d’arrêt sera ajoutée. La couleur est stable jusqu’à 30 min après l’arrêt de la réaction.
  12. À l’aide d’un lecteur de plaques, lisez l’OD à 450 nm.
  13. Produire une courbe standard en mesurant l’OD450 des dilutions en série des concentrations connues d’acide D-Mannuronique (1 024 g/mL, 512 g/mL, 256 g/mL, 128 'g/mL, 64 'g/mL, 32 'g/mL, 16 'g/mL, et 8 'g/mL). Répéter 2x. De ces lectures extraient une équation linéaire.
    REMARQUE : La courbe standard ne doit être effectuée qu’une seule fois. L’équation linéaire extraite peut être utilisée pour des tests ultérieurs.
    1. Calculer la concentration de l’alginate dans chaque échantillon en utilisant la courbe standard et diviser la concentration d’alginate de l’équation linéaire par OD600 pour obtenir la quantité totale d’alginate par OD600.

4. Analyse statistique de la mesure de l’alginate

  1. Dans une fiche logicielle graphique, définir une colonne avec l’équation linéaire dérivée de la courbe standard. Définir les résultats de l’axe y comme la concentration d’alginate et les résultats de l’axe X comme l’OD530 pour l’analyse de l’acide uronique et OD450 pour ELISA pour obtenir les concentrations d’alginate dans chaque échantillon.
  2. Pour normaliser la quantité d’alginate dans chaque échantillon à la quantité par 5,5 x108 CFU/mL (1 OD600),divisez la concentration de chaque échantillon obtenu ci-dessus par sa valeur OD600 respective. Si plusieurs OD600 ont été mesurés pour chaque échantillon, divisez par l’OD600moyen.
  3. Effectuer une analyse statistique à l’aide d’un logiciel statistique préféré (p. ex., GraphPad Prism 7.02).
  4. Ouvrez le logiciel. Choisissez Colonne sous nouveau tableau et graphique et choisissez l’ensemble de données ANOVA à sens unique.
  5. Nommez chaque colonne avec la souche testée et ajoutez les concentrations d’alginate en dessous.
  6. Après avoir mis toutes les données cliquez sur Analyze dans le menu supérieur. Cela ouvrira une fenêtre de paramètres d’analyse. Choisissez les paramètres appropriés pour les tests et indiquez si plusieurs comparaisons doivent être exécutés.
    REMARQUE : Après analyse, l’ensemble de données contiendra une valeur p qui aiderait à déterminer la signification statistique des données. Les données seraient considérées comme statistiquement significatives si la valeur p est inférieure à la valeur de l’ensemble (normalement, la valeur de l’étiquette est fixée pour p 'lt; 0,01).
  7. Sous l’onglet graphique, choisissez le type De graphique à barres. Cela permettra de cartographier automatiquement les données avec le titre indiqué à partir de la feuille de données d’entrée. Indiquer l’importance statistique des données au besoin en montrant le symbole ci-dessus au-dessus des lignes de connexion entre les barres d’intérêt.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

La figure 1 montre des plaques de PAO1 et PAO581 avec ou sans suppression dans le cadre dans le gène pyrD (un gène dans la voie de biosynthèse de la pyrimidine) qui a comme conséquence SCV6. Le mutant PAO1 SCV a été rétabli à la croissance normale en réponse à la supplémentation d’uracil (figure 1A,B). En outre, le mutant PAO581pyrDSCV a été retourné à la mucoidy avec le ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Le VCS et l’alginate sont des marqueurs de maladie importants impliqués dans plusieurs infections chroniques. Par conséquent, la capacité de cultiver le VHC ainsi que d’étudier la régulation et la production d’alginate par P. aeruginosa fait partie intégrante de la découverte de nouveaux traitements pour ces maladies chroniques.

Les souches de VCS sont notoirement difficiles à cultiver en raison de leur taux de croissance lent4 par rapport à d’autres souches

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

L’auteur Hongwei D. Yu est le directeur scientifique et co-fondateur de Progenesis Technologies, LLC.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les subventions R44GM113545 et P20GM103434 des National Institutes of Health (NIH).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1-Step Ultra TMB-ELISAThermo Scientific34028via Fisher Scientific
Éthanol absolu (200 proof)Fisher ScientificBP2818-4de qualité biologique
Bain sec numériqueLabnet NC0205808via Fisher Scientific
Plaques de dosage 96 puitsCoStar2021-12-20
Vortex-Genie 2de paillasseScientific IndustriesG560
l’acide boriqueInternational Corp.10043-35-3
Incubateur d’armoireVWR1540
CarbazoleSigmaC-5132
Tampon carbonate-bicarbonateSigmaC3041
Tubes à centrifuger (50 mL)Fisher Scientific05-539-13via Fisher Scientific
Culture Tubes à essaiFisher Scientific14-956-6Dvia Fisher
Cuvette scientifique Polystyrène (1,5 mL)Fisher Scientific14955127via Fisher Scientific
CytosineAcros Organics71-30-7
Boucles d’inoculation diposablesFisherScientific22-363-597
Acide D-mannuronique SodiumSigma AldrichSMB00280
FMC AlginateFMC2133
GlycérolFisher ScientificBP906-5Pour la biologie moléculaire
Souris Anti-alginate Anticorps monoclonalQED BiosciencesN/ALot # :15725/15726
Poudre saline tamponnée au phosphate (PBS)SigmaP3813
Pierce Goat Anti-souris Anticorps Poly-HRPThermo Scientific32230via Fisher Scientific
Hydroxyde de potassiumFisher Scientific1310-58-3via Fisher Scientific
Prism 7GraphPad
Pseudomonas Gélose d’isolement (PIA)Difco292710via Fisher Scientific
Pseudomonas Bouillon d’isolation (PIB)Alpha BiosciencesP16-115via Fisher
Scientific Cure-dents rondsDiamantN’importe quelle marque
Alginate d’algues (Protanal CR 8133)FMC Corporation
Lait écréméDifco232100via le
spectrophotomètre Fisher Scientific SmartSpec PlusBioRad170-2525ou le fournisseur préféré
Chlorure de sodium (NaCl)SigmaS-5886
SpectraMax i3x Lecteur de microplaques multimodeMolecular Devicesi3xou fournisseur préféré
Boîte de Pétri stérile 100 mm x 15 mmFisher ScientificFB0875713via Fisher Scientific
Acide sulfuriqueFisher ScientificA298-212de qualité technique
(2 solutions normales -stop)R& D SystemsDY994
Tween 20SigmaP2287
UracilAcros Organics66-22-8
Bloc Accu moléculaire Produits de recherche sur Acide sulfurique

Références

  1. Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).
  2. Hogardt, M., Heesemann, J. Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung. International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).
  3. Evans, T. J. Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis. Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).
  4. Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection. Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).
  5. Pestrak, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments. PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842(2018).
  6. Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition. Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).
  7. Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis. Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).
  8. Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN). Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).
  9. Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis. Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).
  10. Rehm, B. H. A. Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion. Alginates: Biology and Applications. Rehm, B. H. A. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Germany. 55-71 (2009).
  11. Remminghorst, U., Rehm, B. H. Bacterial alginates: from biosynthesis to applications. Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).
  12. Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C. Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiology Reviews. 32 (1), 38-55 (2008).
  13. Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).
  14. Bowness, J. M. Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine. The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).
  15. Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples. Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).
  16. Knutson, C. A., Jeanes, A. A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides. Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Quantification de l'alginatedosage au carbazole des acides uroniquesméthode ELISAbiosynthèse des pyrimidinesphénotype SCVproduction d'alginateéchantillons d'expectorations de patients atteints de mucoviscidosecourbe d'étalonnage
Culture de la petite colonie Variante de Pseudomonas aeruginosa et Quantitation de son Alginate
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.