Mesure de la dynamique des microtubules par la microscopie du disque filature dans des spindles mitotiques monopolaires

Résumé

Ici nous présentons une méthode robuste et détaillée d'analyse de dynamique de microtubule dans les cellules synchronisées dans prometaphase utilisant la microscopie confocale de disque de filature de cellules vivantes et le traitement d'image MATLAB-basé.

Résumé

Nous décrivons une modification d'une méthode établie pour déterminer la dynamique de microtubule dans les cellules vivantes. Le protocole est basé sur l'expression d'un marqueur génétiquement codé pour les extrémités positives des microtubules (EB3 étiquetés avec la protéine fluorescente tdTomato) et à haute vitesse, haute résolution, imagerie à cellules vivantes à l'aide de la microscopie confocale du disque filature. La synchronisation du cycle cellulaire et l'augmentation de la densité des microtubules sont obtenues en inhibant la séparation centrosomale dans les cellules mitotiques, et l'analyse de la croissance est effectuée à l'aide du logiciel Open-Track. L'utilisation d'une protéine fluorescente brillante et rouge décalée, en combinaison avec la puissance laser inférieure et le temps d'exposition réduit requis pour la microscopie de disque de rotation réduisent la phototoxicité et la probabilité des artefacts induits par la lumière. Cela permet d'imagerie d'un plus grand nombre de cellules dans la même préparation tout en maintenant les cellules dans un milieu de croissance dans des conditions de culture standard. Étant donné que l'analyse est effectuée de façon automatique supervisée, les résultats sont statistiquement robustes et reproductibles.

Introduction

Les microtubules (MT) sont des structures très dynamiques que l'on trouve dans pratiquement toutes les cellules eucaryotes et dans certaines bactéries¹. Avec l'actine et les filaments intermédiaires, ils sculptent le cytosquelette^2,3. Division cellulaire⁴, transport de molécules⁵, flagellateur battant⁶, la sensation de l'environnement environnant à travers le cilium primaire⁷, audition (kinocilium)^8,9, embryogenèse^10....

Protocole

1. Ensemencement des cellules HeLa

1. Préparer 2 ml de solution de fibronectin de 5 g/mL dans la saline tamponnée au phosphate (PBS) et en ajouter 450 l dans chaque puits d'un bordereau de couverture de 4 puits bien chambré (#1,5). Incuber la glissière pendant 15 min à 37 oC et 5 % de CO_2.
2. Rincer asynchronement les cellules HeLa en croissance asynchrone avec la saline tamponnée de phosphate (DPBS) de Dulbecco et incuber avec la trypsine-EDTA (0,05 % : 0,02 %; w:v) pendant 5 min à 37 oC. Arrêtez la réaction enzymatique par l'ajout de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 moyen complété par 10% de sérum fœtal de veau (FCS) inactivé par ....

Résultats

Suivant le protocole donné décrit dans la figure 1A,le plasmide pEB3-tdTomato a été exprimé transitoirement dans les cellules De HeLa en croissance asynchrone. Les cellules ont été synchronisées 48 h après la transfection à proméaphase par le traitement DME (Figure 1B). Cette étape a permis de s'assurer que la mesure de la dynamique mT était toujours effectuée à la même phase du cycle cellulaire. Les films en time-lapse ont été traités et analysés avec U-Track v.......

Discussion

Ici, nous décrivons une modification d'une méthode établie pour la première fois par Ertych et al.,⁴⁴. Avec plusieurs autres modifications, nous combinons cette technique d'analyse de dynamique de MT avec l'imagerie confocale de disque de rotation double. L'utilisation du disque à double filature améliore la résolution des MT en croissance tout en réduisant la phototoxicité³⁶. Nous réduisons davantage les dommages causés par le photoblanchiment et la lumière laser des cellu.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Diméthylénastron	Merck	324622
DMEM sans rouge de phénol	Gibco	31053-28
DPBS	Gibco	14190-094
Sérum fœtal bovin	Biochrom	S0415
Fibronectine Plasma bovin	Merck	F4759	Poudre stérile
GlutaMAX	Gibco	35050-038	Distributeur de glutamine stable jetPRIME
	Polyplus	114-15
EB3-TdTomato	Addgene	plasmide #50708
RPMI 1640	Gibco	61870-010
Trypan Blue	Merck	T8154-20ML
Trypsine/EDTA solution	Biochrom	L2143	0,05 %/0,02 % sans calcium et magnésium
µ ;- Diapositive	Ibidi	80426	Lame à 4 puits avec lamelle #1.5
Eclipse Ti Microscope inversé	Nikon	NA
Objectif	Nikon	MRD01991	CFI Apo TIRF 100xC Huile
ACAL Laser Excahnger	Nikon		Boîtier laser. 405, 458, 488, 514, 561 et 647 nm
Module de disque rotatif	Andor	CSU-W
Caméra	Andor	Chambre environnementale iXon Ultra 888
	Okolab		Chambre sombre équipée d’une alimentation en CO2, d’un contrôle de la température et d’un humidificateur
HeLa Cells	DSMZ	ACC-57
NIS Elements v4	Nikon		Microscope à disque rotatif. Logiciel d’acquisition
MATLAB	Mathworks		Environnement informatique
Prism 8	GraphPad		Logiciel d’analyse statistique et d’affichage