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Article de méthode

Contrôle des vitesses de débit des fluides actifs 3D à base de microtubules à l'aide de la température

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DOI :

10.3791/60484

⸱

26 novembre 2019

 ,  ,  , 
1Department of Physics, Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Physics, Brandeis University

Dans cet article

Résumé

Le but de ce protocole est d'utiliser la température pour contrôler les vitesses d'écoulement des fluides actifs tridimensionnels. L'avantage de cette méthode permet non seulement de réguler les vitesses de débit in situ, mais permet également un contrôle dynamique, comme le mise au point périodiquement des vitesses de débit de haut en bas.

Résumé

Nous présentons une méthode pour utiliser la température pour régler les vitesses d'écoulement des fluides actifs tridimensionnels (3D) à base de kinésine. Cette méthode permet de tuning les vitesses in situ sans avoir besoin de fabriquer de nouveaux échantillons pour atteindre différentes vitesses souhaitées. En outre, cette méthode permet le contrôle dynamique de la vitesse. Le cycle de la température conduit les fluides à circuler rapidement et lentement, périodiquement. Cette maniabilité est basée sur la caractéristique Arrhenius de la réaction kinesin-microtubule, démontrant une plage de vitesse moyenne contrôlée de 4 à 8 m/s. La méthode présentée ouvrira la porte à la conception de dispositifs microfluidiques où les débits dans le canal sont localement réglables sans avoir besoin d'une valve.

Introduction

La matière active est différenciée de la matière passive conventionnelle en raison de sa capacité à convertir l'énergie chimique en travaux mécaniques. Un matériau qui possède une telle capacité peut consister en des entités vivantes ou non vivantes telles que les bactéries, les insectes, les colloïdes, les grains et les filaments cytosquelettiques1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Ces entités matérielles interagissent avec leurs voisins. À plus grande échelle, ils s'auto-organisent en tourbillons turbulents (turbulence active) ou flux matériels11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Une compréhension de l'auto-organisation de la matière active a conduit à diverses applications dans les navettes moléculaires, dispositifs optiques, et le calcul parallèle21,22,23. Pour amener les applications au niveau suivant, il faut contrôler au-delà de l'auto-organisation. Par exemple, Palacci et coll. ont mis au point un colloïd encapsulé par hématite qui n'est automoteur que lorsqu'il est exposé à la lumière bleue contrôlée manuellement, ce qui a mené à l'émergence de cristaux vivants24. Morin et coll. ont établi le contrôle des colloïdes Quincke roulants à l'aide d'un champ électrique externe réglable, ce qui a entraîné un affluement colloïdal dans un canal de course25. Ces travaux antérieurs démontrent le rôle du contrôle local dans les applications et font progresser la base de connaissances de la matière active.

Dans cet article, nous nous concentrons sur la contrôlabilité des fluides actifs 3D à base de microtubule (MT) à base de kinésie. Les fluides se composent de trois composants principaux : les TM, les moteurs moléculaires de kinésie et les appauvrissements. Les appauvrissements induisent une force d'épuisement pour empaqueter les MT, qui sont plus tard comblés par des groupes moteurs. Ces moteurs marchent le long de la MTstoward l'extrémité plus. Lorsqu'une paire de MTsis pontée antiparallèle, les moteurs correspondants marchent dans des directions opposées. Cependant, les moteurs sont liés dans un cluster et sont incapables de marcher à part, de sorte qu'ils glissent en collaboration à part les paires de MTs (glissement interfilament, Figure 1A). Ces dynamiques de glissement s'accumulent, causant des faisceaux de MTsto s'étendre jusqu'à atteindre leur point d'instabilité et de rupture (faisceaux extésiles, Figure 1B)26. Les faisceaux cassés sont annealed par la force d'épuisement, qui s'étend par la suite encore, et la dynamique se répète. Pendant le processus de la dynamique de répétition, les mouvements de faisceau remuer le liquide voisin, induisant des flux qui peuvent être visualisés par le dopage avec des traceurs à l'échelle micron (Figure 1C). Sanchez et coll. et Henkin et coll. ont caractérisé les vitesses moyennes des traceurs, constatant que les vitesses étaient réglables en variant les concentrationsde triphosphate d'adénosine (ATP), d'épuisements, de grappes motrices et de MT1,27. Cependant, une telle tunability n'existait qu'avant la synthèse active des fluides. Après synthèse, l'amaigrabilité a été perdue, et les fluides auto-organisés à leur manière. Pour contrôler l'activité active des fluides après synthèse, Ross.et al. a signalé une méthode utilisant la dimérisation activée par la lumière des protéines motrices, permettant à l'activité des fluides d'être réglée et désactivée à l'aide de la lumière28. Alors que le contrôle de la lumière est pratique en termes d'activation locale des fluides, la méthode nécessite de repenser les structures des protéines motrices, ainsi que de modifier les trajectoires optiques dans un microscope. Ici, nous fournissons une méthode facile à utiliser pour contrôler localement les flux de fluides sans modification de microscope tout en gardant la structure du moteur intacte.

Notre méthode de régler localement le flux de fluide actif est basée sur la loi Arrhenius parce que la réaction kinesin-MT a été rapportée pour augmenter avec la température29,30,31,32. Nos études précédentes ont montré que la dépendance à la température de la vitesse moyenne d'un flux de fluide actif a suivi l'équation D'Arrhenius: v - A exp(-Ea/RT), où A est un facteur pré-exponentiel, R est la constante du gaz, Ea est l'énergie d'activation, et T est la température du système33. Par conséquent, l'activité des fluides est sensible à l'environnement de température, et la température du système doit être cohérente pour stabiliser les performances du moteur, et par conséquent, la vitesse d'écoulement du fluide34. Dans cet article, nous démontrons l'utilisation de la dépendance à la température du moteur pour régler en permanence les vitesses d'écoulement des fluides actifs en ajustant la température du système. Nous démontrons également la préparation d'un échantillon actif de fluide, suivi par le montage de l'échantillon sur une étape de microscope dont la température est commandée par l'intermédiaire du logiciel d'ordinateur. L'augmentation de la température de 16 à 36 oC accélère la vitesse moyenne d'écoulement de 4 à 8 m/s. De plus, l'advisibilité est réversible : augmenter et diminuer à plusieurs reprises la température accélère et ralentit séquentiellement le débit. La méthode démontrée s'applique à un large éventail de systèmes où les principales réactions obéissent à la loi Arrhenius, comme l'assay MT29,30,31,32.

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Protocole

1. Préparation des MT

CAUTION: Dans cette étape, nous purifions les tubulines à partir de tissus cérébraux bovins. Le cerveau bovin peut causer la variante de la maladie de Creutzfeldt-Jakob (vMCJ)35. Par conséquent, les déchets cérébraux et les solutions connexes, les bouteilles et les pointes de pipette doivent être collectés dans un sac de biodéchets et éliminés comme déchets biodangereux selon les règles de l'institution.

  1. Purifier les tubulines du cerveau bovin (modifié à partir de Castoldi et al.,36).
    1. Transportez environ 1,5 kg de cerveaux de bovins frais d'un abattoir local à une chambre froide universitaire. Pendant le transport, entreposez les cerveaux dans un tampon de phosphate (20 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7,2) sur glace.
      REMARQUE : Pour maximiser le rendement final de la tubuline, la quantité initiale de tubuline fonctionnelle dans le tissu nouveau de cerveau est la clef. Les cerveaux plus frais contiennent plus de tubuline fonctionnelle. Pour obtenir les cerveaux les plus frais de l'abattoir, nous recommandons de demander au boucher de fournir des cerveaux des vaches les plus récemment abattues. Les cerveaux ne doivent pas être plus âgés que 3 h au début de la procédure, parce que la réduction du temps entre l'abattage et le début de la procédure produira de meilleurs rendements.
    2. Homogénéiser et clarifier le cerveau.
      1. Nettoyez le cerveau en utilisant des scalpels pour couper les vaisseaux sanguins et les tissus conjonctifs en petits morceaux et les retirer du cerveau à la main.
        REMARQUE : Les cerveaux nettoyés doivent être roses.
      2. Immerger le tissu cérébral nettoyé dans 1 L de tampon de dépolymérisation (DB: 50 mM 2-(N-morpholino) acide éthanesulfonique, 1 mM CaCl2, pH 6,6) par kilogramme de cerveau.
      3. Homogénéiser le cerveau avec un mélangeur de cuisine.
      4. Centrifugeuse solution cérébrale homogénéisée à 10 000 x g et 4 oC pendant 150 min.
    3. Polymériser les MT (première polymérisation).
      1. Recueillir et mélanger le supernatant avec des volumes égaux des solutions suivantes à 37 oC : glycérol, tampon PIPES à haute molarité (HMPB : 1 M PIPES, 10 mM MgCl2, 20 mM d'éthylène glycol-bis (éthylité aminoehyl)-N,N,N',N'-tétraacetic acid [EGTA], pH 6.9)
      2. Ajouter 1,5 mM D'ATP et 0,5 mM de guanosine triphosphate (GTP) au mélange.
      3. Incuber le mélange à 37 oC pendant 1 h.
    4. Dépolymériser les MT (première dépolymérisation MT).
      1. Pellet MT en centrifuge à 151 000 x g et 37 oC pendant 30 min.
      2. Jeter le supernatant et resuspendre chaque granule de MT dans 10 ml de 4 OC DB.
      3. Incuber sur glace pendant 30 min.
      4. Agiter le mélange toutes les 5 min avec une pointe de pipette pour éviter la sédimentation MT.
        REMARQUE: Le mélange doit se dégager en 30 min, ce qui indique l'achèvement de la dépolymérisation MT.
    5. Polymériser les MT (deuxième polymérisation MT).
      1. Clarifier la solution en centrifugeant à 70 000 x g et 4 oC pendant 30 min.
      2. Recueillir et mélanger le supernatant avec des volumes égaux de 37 oC de glycérol et de HMPB.
      3. Ajouter 1,5 mM ATP et 0,5 mM GTP au mélange.
      4. Incuber le mélange à 37 oC pendant 30 min.
    6. Répéter l'étape 1.1.4, en remplaçant le HMPB par le tampon de réassemblage De brinkley (BRB) 80 (80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8), puis en clarifiant le mélange défriché en centrifuant à 79 000 x g et 4 oC pendant 30 min.
    7. Recueillir le supernatant. Mesurer l'absorption de 280 nm à l'égard d'un spectromètre. Déterminer la concentration de tubuline à l'aide de la loi Beer-Lambert (coefficient d'extinction de la tubuline : 1,15 (mg/mL)-1cm-1)37,38.
    8. Conserver la protéine à -80 oC.
  2. Recycler les tubulines (modifiées à partir de Castoldi et coll.36).
    REMARQUE : Pour améliorer la pureté de la tubuline, la tubuline purifiée est polymérisée et dépolymérisée à nouveau.
    1. Polymériser les MT en mélangeant la tubuline purifiée (étape 1.1.7) avec 500 M dithiothreitol (DTT) et 20 'M GTP, suivie de 30 min d'incubation à 37 oC.
    2. Pellet les MTs.
      1. Chargez 1 mL de coussin de glycérol (80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 60% v/v glycérol, pH 6.8) dans le fond d'un tube de centrifugeuse.
      2. Déposer les MT polymérisés sur le dessus du coussin.
      3. Centrifugeuse à 172 000 x g pendant 90 min à 37 oC.
    3. Dépolymériser les MT.
      1. Retirer le supernatant et le coussin.
      2. Resuspendre chaque granule de MT dans 150 'L de 4 'C MT tampon (M2B: 80 mM PIPES, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8).
      3. Incuber le mélange sur glace pendant 30 min.
      4. Agiter le mélange avec une pointe de pipette toutes les 5 min. Le mélange doit être clair.
    4. Clarifier le mélange en centrifugeant à 172 000 x g et 4 oC pendant 30 min.
    5. Recueillir le supernatant. Mesurer la concentration en protéines. Conserver à -80 oC.
  3. Étiqueter la tubuline avec un colorant fluorescent39.
    1. Polymériser les MT. Mélanger la tubuline purifiée (étape 1.1.7) avec 500 M DTT et 16,7 M GTP, et incuber le mélange à 37 oC pendant 30 min.
    2. Pellet les MTs.
      1. Placer 1 ml de coussin à pH élevé de 37 oC (0,1 M NaHEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 60 % v/v glycérol, pH 8,6) dans un tube de centrifugeuse.
      2. Déposer les MT polymérisés sur le coussin.
      3. Centrifugeuse à 327 000 x g pendant 50 min à 37 oC.
    3. Étiquette tubuline.
      1. Resuspendre chaque granule de MT avec 700 oL de tampon d'étiquetage de 37 oC (0,1 M NaHEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 40 % v/v glycérol, pH 8,6).
      2. Mélanger la suspension avec un excès de 10 à 20 molaires de colorant fluorescent rouge lointain fonctionnalisé avec un ester succinimidyl.
      3. Incuber le mélange à 37 oC pendant 30 min dans l'obscurité pour permettre aux MT de réagir avec l'ester du colorant fluorescent.
      4. Arrêtez la réaction d'étiquetage en saturant l'ester du colorant suspendu avec 50 mM k-glutamate, en couve pendant 5 min à 37 oC.
    4. Pelletles les MT étiquetés : Répétez l'étape 1.3.2, en remplaçant le coussin à pH élevé par un coussin à faible pH (80 mM de tuyaux, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 60% v/v glycerol, pH 6.8).
    5. Dépolymériser les MT.
      1. Jeter le supernatant et le coussin.
      2. Resuspendre la pastille en 700 oL de 4 oC M2B.
      3. Incuber la suspension sur glace.
      4. Agiter toutes les 5 min avec une pointe de pipette jusqu'à ce que la solution soit claire.
    6. Clarifier la solution défrichée en centrifugeant à 184 000 x g et 4 oC pendant 35 min.
    7. Améliorez la pureté de la solution de tubuline étiquetée en répétant les étapes 1.2.1-1.2.4.
    8. Mesurer la concentration de protéines et de colorant fluorescent. Utilisez ces mesures pour déterminer la concentration de tubuline et les fractions de tubuline étiquetée, définie comme le rapport des concentrations de colorant fluorescent à la tubuline.
    9. Conserver la solution de tubulin étiquetée à -80 oC.
  4. Polymériser les MT (adoptés par Sanchez etal.19):
    1. Mélanger la tubuline recyclée (étape 1.2.5) avec la tubuline étiquetée (étape 1.3.9) dans un rapport qui donne une fraction de tubulin étiquetée de 3%.
    2. Mélanger le mélange de tubuline de 8 mg/ml avec 1 mM de TNT et 0,6 mM de guanosine-5'[,)-méthyleno)-triphosphate (GMPCPP), suivi de 30 min d'incubation à 37 oC.
    3. Après l'incubation, anneal les MTs à température ambiante dans l'obscurité pendant 6 h.
    4. Aliquot et magasin à -80 oC.

2. Synthétiser les grappes de kinésie

REMARQUE : Les bactéries existent de façon omniprésente et peuvent se développer dans les médias et contaminer le processus de préparation. Pour prévenir la contamination, les actions impliquant un contact avec les cultures cellulaires (p. ex., le tuyauterie) DOIVENT être effectuées près d'une flamme. Les outils tels que les flacons, les pipettes, les pointes de pipette, les supports et les plaques DOIVENT être autoclaved avant utilisation.

  1. Moteurs de kinésie express dans Escherichia coli40.
    1. Transformez les cellules.
      1. Pipette 1 l du plasmide K401-BCCP-H6 en 10 l de cellules compétentes.
      2. Incuber sur glace pendant 5 min.
      3. Choc thermique à 42,5 oC pour 45 s.
      4. Incuber les cellules sur la glace pendant 2 min pour permettre la récupération.
      5. Mélanger les cellules avec 300 l de 2XYT sans antibiotiques (5 g/L NaCl, 10 g/L extrait de levure, 16 g/L tryptone).
      6. Incuber les cellules à 37 oC pendant 1 h.
        REMARQUE : Sauf indication, la surveillance de la croissance cellulaire n'est pas nécessaire pendant l'incubation.
    2. Inoculer les supports de plaque.
      1. Étendre la culture cellulaire sur une plaque de 2XYT (10 g/L NaCl, extrait de levure de 5 g/L, 10 g/L tryptone, 15 g/L agar, 100 g/mL d'ampicilline, 25 g/mL de chloramphenicol).
      2. Incuber la plaque à l'envers à 37 oC pendant la nuit.
    3. Inoculer les supports liquides.
      1. De la plaque de nuit, récoltez une colonie isolée avec une pointe de pipette.
      2. Éjecter la pointe dans un flacon contenant 50 ml de 2XYT.
      3. Incuber et secouer les médias de culture à 37 oC et 200 tr/min pour 12 à 16 h.
    4. Élargir les cellules.
      1. Mélanger 2,5 ml de la culture cellulaire en 500 ml de 2XYT.
      2. Incuber et secouer la culture de 500 ml à 37 oC et 250 tr/min pendant 3 à 6 h.
    5. Induire l'expression des protéines.
      1. Pendant l'incubation, surveillez la croissance cellulaire en mesurant l'absorption à 600 nm, en utilisant 2XYT comme référence. Mesurer l'absorption toutes les 60 min, jusqu'à ce qu'elle atteigneOD 600 -0,3. Ensuite, mesurez l'absorption toutes les 30 min jusqu'à ce qu'elle atteigne 0,5 à 0,6.
      2. Permettre aux cellules de se développer jusqu'à ce que l'absorption atteigneoD 600 - 0,5 à 0,6
      3. Ajouter 24 'g/mL de biotine et 1 mM d'isopropyl '-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à la culture cellulaire.
        REMARQUE : L'IPTG est utilisé pour induire l'expression des protéines des moteurs de kinésie, qui sont marqués avec la protéine porteuse de carboxyl de biotine (BCCP) et six histidines (H6). L'étiquette H6 est utilisée dans le processus de purification (étape 2.2), tandis que BCCP se lie aux molécules de biotine ajoutées pour biotinylate les moteurs de kinésie exprimés.
      4. Incuber et secouer la culture cellulaire à 20 oC et 250 tr/min pendant 12 à 20 h.
    6. Récolter les cellules en centrifuge à 5 000 x g et 4 oC pendant 10 min. Jeter le supernatant. Entreposer les granulés de cellules à -80 oC.
  2. Purifier la protéine moteur kinesicine (modifiée à partir de Spriestersbach etal.41):
    1. Suspendre le granule cellulaire (étape 2.1.6) avec un volume égal de tampon de lyse (50 mM PIPES, 4 mM MgCl2, 50 M ATP, 10 mM 2-mercaptoethanol (ME), 20 mM imidazole, pH 7,2), suivi par l'ajout d'un comprimé d'inhibiteur de la protéase, 2 mg de fluorure de méthyle phénylthyle (PMSF), et 2 mg de lysozyme.
    2. Lyser les cellules en gelant au flash dans l'azote liquide (LN) 3x et en dégelant le mélange cellulaire.
      REMARQUE : Après lysing, le mélange devrait devenir visqueux.
    3. Clarifier le mélange de cellules lysées en centrifugeant à 230 000 x g et 4 oC pendant 30 min.
    4. Recueillir le supernatant et le couler à travers une colonne de gravité, suivie par le lavage de la colonne avec 10 ml de tampon de lyse.
      REMARQUE : Les protéines munis d'une étiquette H6, comme la kinésie K401-BCCP-H6, doivent rester dans la colonne.
    5. Élitez la protéine étiquetée avec 5 ml de tampon d'élution (50 mM PIPES, 4 mM MgCl2, 50 M ATP, 500 mM imidazole, pH 7,2). Recueillir le flux à travers séquentiellement en 1 ml fractions. Pour déterminer les fractions contenant des protéines, mélangez 3 ll de chaque fraction avec 100 l de colorant triphenylmethane. Les fractions contenant des protéines devraient devenir bleues. Combinez ces fractions et diluez par 5x avec le tampon de lyse.
    6. Concentrez la solution protéique.
      1. Chargez la solution dans un tube de filtre centrifuge.
      2. Centrifugeuse à 3 000 x g pendant 10 min à 4 oC.
      3. Secouez doucement le tube et la centrifugeuse à nouveau jusqu'à ce que le volume de la solution soit de 3 ml.
    7. Mesurer la concentration protéique à l'aide d'un spectromètre (coefficient d'extinction : 0,549 (mg/mL)-1cm-1)42,43. Diluer la protéine à 1 mg/mL tout en ajoutant 35% w/v sucrose.
    8. Conserver à -80 oC.
  3. Mesurer les concentrations de kinésie à l'égard d'un gel électrophoresis (modifié à partir de Taylor et coll.44).
    REMARQUE : Pour mesurer la concentration de kinésie avec un gel d'électrophoresis, la tubuline est une échelle de concentration idéale en raison de sa grande pureté et de sa concentration mesurable par l'intermédiaire d'un spectromètre (figure 2A)36.
    1. Préparer des échantillons de tubuline avec des concentrations de 0,25, 0,5, 0,75, 1,00 et 1,25 mg/mL. Mélanger séparément 15 l de chaque échantillon de tubuline et de kinésie (étape 2,2,8) avec 5 ll de tampon d'échantillon (200 mM Tris-HCl, 8 % de sulfate de dodecyl de sodium (SDS), 400 mM DTT, 0,2 % de bleu bromophéol, 40 % de glycérol, pH 6,8) et incubé à 90 min 3 min.
    2. Préparer l'électrophoresis.
      1. Verrouillez un gel d'électrophoresis dans la boîte de gel.
      2. Remplissez la boîte d'un tampon de fonctionnement (50 mM MOPS, base De 50 mM Tris, 0,1 % SDS, 1 mM d'acide éthylènediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 7,7).
        REMARQUE : Assurez-vous que le niveau tampon est au-dessus de l'ouverture supérieure du gel.
    3. Chargez 10 L d'échelle standard protéique, d'échantillons de tubuline et de kinésine dans des puits séparés et appliquez 200 V sur le gel pendant 45 min.
    4. Gel coloration.
      1. Incuber et bercer le gel avec la solution de tache bouillie (environ 95 oC) A (0,5 g/L de tréphénylméthane, 10 % d'acide acétique v/v, 25 % d'isopropanol) pendant 5 min, puis rincer le gel avec de l'eau déionisée (DI).
      2. Répétez avec des solutions de taches B (0,05 g/L de colorant triphenylmethane, 10% v/v acide acétique, 10% d'isopropanol), C (0,02 g/L de colorant triphenylmethane, 10% v/v acide acétique), et D (10% v/v acide acétique), séquentiellement. Incuber et bercer le gel dans l'eau DI pendant la nuit.
    5. Scanne zetle le gel. Convertissez l'image de gel à une image à l'échelle grise, suivie d'une inversion noir et blanc et d'une amélioration du contraste pour révéler des bandes de protéines brillantes sur le fond noir.
    6. Mesurez la luminosité de chaque bande en résumant les valeurs de pixels. Appliquer l'ajustement linéaire C ' aB 'b, où B est la luminosité d'une bande de tubuline, C est la concentration correspondante, et a et b sont des paramètres de montage. Déterminer la concentration de kinésie Ck en utilisant la luminosité de la bande de kinésie Bk pour calculer l'équation linéaire: Ck ' aBk 'b.
  4. Regroupez les moteurs de kinésie.
    1. Mélanger 1,5 M kinesin (étape 2.2.8) avec 120 M DTT et 120 nM streptavidin. Incuber sur glace pendant 30 min.
    2. Conserver à -80 oC.

3. Préparer des lames et des couvercles en verre recouverts de polyacrylamide (modifiés à partir de Lau et al.,45)

  1. Chargez de nouvelles lames en verre et des couvercles en verre dans des contenants correspondants. Immerger les lames et les couvercles dans un détergent v/v de 1 % dans de l'eau DI, puis faire bouillir l'eau au micro-ondes.
  2. Sonicate les diapositives et les couvercles pendant 5 min, puis rincer à l'eau DI pour enlever le détergent.
  3. Immerger et sonicate les glissières et les couvercles en éthanol pendant 5 min. Rincer à l'eau DI.
  4. Immerger et sonicate les lames et les couvercles dans 100 mM d'hydroxyde de potassium (KOH) pendant 5 min. Rincer à l'eau DI.
  5. Incuber les lames et les couvercles dans une solution sinétique (1% d'acide acétique et 0,5% 3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate dans l'éthanol) pendant 15 min, puis rincer avec de l'eau DI.
  6. Incuber les diapositives et les couvercles dans la solution d'acrylamide (2% w/w acrylamide, 0.7 mg/mL de persulfate d'ammonium, et 0.0035% v/v tetramethylethylenediamine dans l'eau de DI) pendant 3 h.
  7. Conservez les diapositives et les couvertures dans la solution acrylamide.

4. Préparer des fluides actifs à base de kinésie, à base de MT

  1. Préparer les fluides actifs (modifiés à partir de Sanchez et coll.19).
    REMARQUE : Les étapes suivantes démontrent le processus de préparation de 100 L d'un fluide actif à l'aide d'exemples de stocks. Le volume final est évolutif, et les concentrations des stocks d'exemple peuvent être ajustées tant que la concentration finale de chaque composant est maintenue.
    1. Mélanger 16,7 ML de 8 mg/mL De TM (étape 1,4,4) avec 6,7 l de grappes motrices kinesinM (étape 2,4,2), et 1,1 l de 500 mL de MTT en M2B à haute teneur en sel (M2B - 3,9 mM MgCl2).
    2. Regroupez les MT en ajoutant 11,4 L de 7 % w/w de polyéthylène glycol (PEG).
    3. Activez les moteurs de kinésie en ajoutant 2,8 L de 50 mM ATP.
    4. Maintenir les concentrations d'ATP en ajoutant 2,8 l de pyruvate de stock kinase/lactate dehydrogenase (PK/LDH) et 13,3 'L de 200 mM de pyruvate phosphénol (PEP).
    5. Réduire l'effet de photoblanchiment en ajoutant 10 'L de 20 mM Trolox, 1,1 'L de 3,5 mg/mL de catalase, 1,1 'L de 20 mg/mL de glucose oxidase, et 1,1 'L de 300 mg/mL de glucose.
    6. Suivez le mouvement du fluide en ajoutant 1,6 L de 0,025 % v/v particules traceurs.
    7. Ajouter le M2B à haute teneur en sel pour atteindre un volume total de 100 L.
      REMARQUE : Les ordres de mélange dans les étapes 4.1.1-4.1.6 sont interchangeables. Cependant, une fois que l'ATP, les MT et les moteurs sont mélangés, les moteurs commencent à consommer de l'ATP tout en marchant le long des MT. L'échantillon est activé avec une durée de vie limitée en raison des carburants limités (ATP et PEP), de sorte que l'expérience doit être commencée rapidement. Le liquide actif final doit contenir 1,3 mg/mL MT, 120 nM clusters moteurs kinesin, 5,5 mM DTT, 0,8 % w/w PEG, 1,4 mM ATP, 2,8 % v/v PK/LDH, 27 mM PEP, 2 mM Trolox, 0,038 mg/mL catalase, 0,22 mg/mL glucose oxidase, 3,3 mg/mL de glucose, et 0,0004% v/v colloid en m2B.
  2. Préparer un échantillon dans un canal d'écoulement (modifié à partir de Chandrakar etal.46):
    1. Rincer un toboggan en verre recouvert de polyacrylamide et un bordereau (étape 3.7) avec de l'eau DI. Séchez les verres avec de l'air sous pression. Placer sur une surface propre et plane.
    2. Couper deux bandes de films de cire d'une largeur de 3 mm et de la même longueur que la feuille de verre (20 mm). Insérez les bandes entre la glissière et la glissière de couverture comme espaceurs de canal.
    3. Adhérer le verre à l'épile de cire en plaçant le complexe de cire de verre sur une plaque chaude de 80 oC pour faire fondre la cire. Pendant la fonte, appuyez doucement sur la couverture avec une pointe de pipette pour adhérer uniformément le film de cire aux surfaces en verre. Après l'adhérence, refroidir le complexe de verre à température ambiante.
    4. Chargez les fluides actifs (étape 4.1) vers le canal d'écoulement. Sceller le canal avec de la colle UV.

5. Contrôler la température de l'échantillon

  1. Construire une configuration de contrôle de la température (modifiée à partir de dessins dans Lowensohn et al. et Wu etal. 47,48,49).
    1. Préparer un bloc de refroidissement en aluminium.
      1. Moudre une plaque d'aluminium d'une capacité d'environ 30 mm et 30 mm et 5 mm.
      2. Percer un canal interne à travers la plaque (Figure 3A) et installer des raccords de tuyau aux extrémités du chenal.
      3. Accrochez chaque raccord à un tube d'eau.
      4. Connectez un tube à une pompe de réservoir de poisson dans un réservoir d'eau tout en étendant l'autre tube au réservoir.
        REMARQUE : La pompe fera circuler l'eau du réservoir à travers les canaux internes en aluminium pour maintenir la température du bloc à environ la température ambiante.
    2. Filez un refroidisseur thermoélectrique (TEC) et un thermocapteur à un contrôleur de température. Connectez le contrôleur à un ordinateur à l'aide d'un port USB (Figure 3B).
    3. Câblez le contrôleur de température à une alimentation à courant direct (DC). Allumez le contrôleur en branchant l'alimentation électrique à une prise électrique.
    4. Effectuer la mise en place initiale du TEC suivant le guide du contrôleur du fabricant. Testez la sortie TEC. Il est recommandé de contrôler le contrôleur de température via un logiciel fourni par le fabricant, permettant l'enregistrement des données thermocapteurs et une manipulation plus facile du contrôleur de température.
    5. Identifiez les côtés chauffants et de refroidissement du TEC.
    6. Fixez le côté de refroidissement du TEC sur le bloc de refroidissement (étape 5.1.1) à l'aide de pâte thermique.
    7. Fixez un disque de saphir au côté chauffant du TEC à l'aide de pâte thermique.
    8. La configuration est terminée. La surface du saphir et le thermocapteur peuvent entrer en contact avec un échantillon pour refroidir et chauffer l'échantillon en fonction de sa température et de sa température cible.
      REMARQUE : Il est recommandé que le TEC et le bloc de refroidissement aient un trou central aligné pour l'imagerie des échantillons à l'aide d'une microscopie à champ lumineux(figure 3C).
  2. Utilisez la configuration de contrôle de la température pour contrôler la température de l'échantillon33.
    1. Montez l'échantillon jusqu'à la configuration.
      1. Placez l'échantillon de liquide actif (étape 4.2.4) sur la surface du saphir avec le côté de la glissière qui entre en contact avec la surface.
      2. Fixer la glissière en verre avec du ruban adhésif en papier.
      3. Fixez le thermocapteur à la surface de la couverture à l'aide de ruban adhésif en cuivre.
    2. Monter la configuration sur une scène de microscope avec le côté de couverture faisant face vers les objectifs. Par exemple, sur un microscope inversé, le côté de la couverture doit faire face vers le bas. Fixez la configuration avec du ruban adhésif en papier et les pinces à aiguilles de stade de microscope, le cas échéant.
      REMARQUE : L'étape de température présentée devrait fonctionner avec les microscopes communs qui sont inversés ou droits. Pour s'assurer que le stade de température n'est pas déplacé pendant l'expérience, il est préférable de fixer le stade de température à l'étape du microscope avec du ruban adhésif.
    3. Contrôlez la température de l'échantillon.
      1. Allumez le contrôleur de température et la pompe de réservoir de poisson.
      2. Suivez le guide du fabricant pour définir la température cible et permettre le contrôle de la température. Le contrôleur ajustera la puissance de chauffage ou de refroidissement en fonction de la température cible et de la température de l'échantillon, tel qu'évalué par le thermocapteur.
    4. Enregistrez les températures de l'échantillon.
      1. Suivez le guide du fabricant pour enregistrer les données sur la température des thermocapteurs pendant l'expérience.
        REMARQUE : La température de l'échantillon doit maintenant être contrôlée par le contrôleur et enregistrée par l'ordinateur(figure 3D).

6. Caractériser l'activité active du fluide (modifiée à partir de méthodes par Henkin et al. et Wu etal. 20,27)

REMARQUE : Les sections précédentes sont utilisées pour préparer des échantillons de fluides actifs (sections 1 à 4) et contrôler leur température (section 5). Démontrer l'utilisation de la température pour contrôler l'activité active des fluides, observer les comportements fluides, analyser leurs activités et caractériser leur réponse à la température.

  1. Surveillez les traceurs.
    1. Imagez l'échantillon à l'aide d'une fluorescence à partir de protéines fluorescentes vertes (GFP) pour capturer le mouvement des particules du traceur.
      REMARQUE :Il faut choisir le mouvement du traceur pour permettre le suivi du mouvement du traceur. Les grandes valeurst, telles que les 100 s, entraînent la perte des trajectoires du traceur, tandis que les valeurs courtest, telles que 0,1 s, empêchent l'algorithme de suivi de détecter le mouvement du traceur entre les images. Un t de travaildoit permettre au déplacement du traceur entre les images d'être à moins de 9 pixels. Pour les traceurs d'imagerie se déplaçant à 10 m/s à l'aide d'un objectif 4x, let est recommandé d'être de 1 à 5 s.
    2. Enregistrez les images sous forme de fichiers TIFF, nommez les fichiers en fonction du numéro d'image et stockez-les dans un dossier séparé. Ces processus sont nécessaires pour s'assurer que les images acquises seront correctement analysées avec le script MATLAB fourni (étape 6.2.2).
  2. Traceurs adoptant le logiciel de suivi développé par Ouellette et coll.50,51):
    1. Téléchargez le logiciel de suivi de l'Environmental Complexity Laboratory de l'Université Stanford (https://web.stanford.edu/~nto/software.shtml). Assurez-vous que chaque fichier MATLAB est dans le même dossier.
    2. Traceurs de piste à l'aide d'un script MATLAB personnalisé : particle_tracking.m. Le script lit des images traceurs (étape 6.1) et suit le mouvement des traceurs à l'aide du logiciel de Ouellette et coll.50,51. Il produit deux fichiers : 1) background.tif, représentant le fond de l'image, et 2) Tracking.mat, contenant les trajectoires et les vitesses des particules dans chaque image (Figure 4A).
  3. Analyser les vitesses moyennes du traceur à l'aide d'un script MATLAB personnalisé : analysis.m. Le script lit le fichier de suivi (Tracking.mat) et produit la vitesse moyenne des traceurs par rapport au temps, ainsi qu'une vitesse moyenne dans le temps avec des fenêtres moyennes spécifiées (Figure 4B)33.
  4. Enregistrez la vitesse moyenne dans le temps.
  5. Mesurez la vitesse moyenne dans le temps en répétant l'expérience (étapes 4, 5,2 et 6,1-6,4) à 10 à 40 oC. Utilisez les vitesses moyennes enregistrées pour tracer la vitesse moyenne par rapport à la température (Figure 4C)33.

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Résultats

La préparation des fluides actifs à base de kinésie, à base de MT, nécessite à la fois de la kinésie et des TM. Les TM ont été polymérisés à partir de tubulines étiquetées (étapes 1.3 et 1.4) qui ont été purifiées à partir de cerveaux bovins (étape 1.1, Figure 2A),suivies du recyclage pour améliorer la pureté (étape 1.2, Figure 2B). Les protéines motrices kinesin ont été exprimées et purifiées à partir de E. coli (étape...

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Discussion

Le contrôle de la matière active in situ ouvre la porte à l'auto-organisation dirigée de la matière active4,5,24,28,54. Dans cet article, nous présentons un protocole pour l'utilisation de la température pour contrôler la kinésine, à base de MT fluides actifs in situ, basé sur la caractéristique Arrhenius du système29,

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Plasmid K401-BCCP-H6 était un cadeau du Dr Zvonimir Dogic. Cette recherche a été soutenue par le fonds de démarrage du Dr Kun-Ta Wu à l'Institut polytechnique de Worcester. Nous remercions le Dr Zvonimir Dogic pour les protocoles visant à purifier et à étiqueter la tubuline et à synthétiser les fluides actifs. Nous sommes reconnaissants au Dr Marc Ridilla pour son expertise dans l'expression et la purification des protéines. Nous remercions le Dr William Benjamin Roger de nous avoir aidés à construire la scène à température contrôlée. Nous reconnaissons Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) pour l'utilisation de la Facilité des matériaux biologiques (BMF). Nous remercions la Royal Society of Chemistry d'avoir adapté les chiffres de Bate et coll. sur Soft Matter33.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
(± ;)-Acide 6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthylchromane-2-carboxyliqueSigma-Aldrich238813Trolox
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
3-(Trimethoxysilyl)propyl méthacrylate, 98 %, ACROS OrganicsFisher ScientificAC216550050
3,2mm I.D. Tygon Tubing R-3603HACH2074038Tubes d’eau
31,75 mm de diamètre non revêtu, fenêtre saphirEdmund Optics43-637Disque saphir
3M 1181 Ruban de cuivre - 1/2 IN Largeur X 18 YD Longueur - 2,6 MIL Épaisseur totale - 27551R.S. HUGHES054007-27551Ruban de cuivre
Acide acétiqueSigma-AldrichA6283
Solution d’acrylamide (40 %/électrophorèse), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP1402-1
Adénosine 5'-triphosphate dipotassique sel hydratéSigma-AldrichA8937ATP Alexa
Fluor 647 NHS Ester (ester succinimidylique)Thermo Fisher ScientificA20006Colorant fluorescent rouge lointain. Alexa 647 peut être pré-suspendu dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) avant d’être mélangé avec des microtubules (1.3.3.2.)
Unité de filtre centrifuge Amicon Ultra-4Sigma-AldrichUFC801024Tube filtrant centrifuge. Poids moléculaire de coupure : 10 kDa
Persulfate d’ammonium, 100g, MP BiomedicalsFisher ScientificICN802829Sel de
sodium d’ampicilline APS (poudre cristalline), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP1760d’ampicilline
Nikon63-7590S
Avanti J-E CentrifugeuseBeckman Coulter369001
Agent de soudure Bacto Agar, BD DiagnosticsVWR90000-760Agar
BiotineAlfa AesarA14207
Seau-plastique blanc - 2 gallonsBon84-715Seau d’eau
Chlorure de calciumSigma-Aldrich746495CaCl2
Catalase du foie bovinSigma-AldrichC40
CFI Plan Apo Lambda 4x ObjNikonMRD000454x objectif pneumatique
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero ShiftNikon96372Cube de filtre GFP
CH-109-1.4-1.5TE TechnologyCH-109-1.4-1.5Refroidisseur thermoélectrique (TEC)
Chloramphénicol, 98 %, ACROS OrganicsFisher ScientificC0378
Bloc de refroidissementN/AN/AAluminium fraisé sur mesure
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400Bio-Rad1610400Colorant triphénylméthane
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG7528
Dimethyl Sulfoxide (certifié ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificD128DMSO
DL-1,4-Dithiothreitol, 99 %, pour la biochimie, ACROS OrganicsFisher ScientificAC165680050DTT
DOWSIL 340 Dissipateur thermique ComposéDow1446622Pâte thermique
ALCOOL ÉTHYLIQUE, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBEPharmco by Greenfield Global111000200CB05Éthanol
Éthylène glycol-bis(2-aminoéthyléther )-N,N,N',N'-acide tétraacétiqueSigma-AldrichE3889EGTA
Acide éthylènediaminetétraacétiqueSigma-Aldrich798681EDTA
Fisher BioReagents Milieux de microbiologie Additifs : TryptoneFisher ScientificBP1421Tryptone
Fisher BioReagents Additifs de milieux de microbiologie : Extrait de levureFisher ScientificBP1422Extrait de levure
Fluoresbrite YG Microsphères, Étalonnage Grade 3.00 µ ; mPolysciences18861Particules traceuses
Glucose oxydase d’Aspergillus nigerSigma-AldrichG2133
GlycérolSigma-AldrichG5516
GpCppJena BioscienceNU-405LGuanosine-5'[ (&alpha ;,&beta ;)-méthyléno]triphosphate (GMPCPP)
GS Power’s calibre 18 (True American Wire Ga), 100 pieds, 99,9 % toronné sans oxygène Cuivre OFC, rouge / noir 2 conducteurs Câble électrique d’alimentation/haut-parleur pour voiture, audio, cinéma maisonAmazonB07428NBCWFil de cuivre
Guanosine 5'-triphosphate hydrate de sel de sodiumSigma-AldrichG8877GTP
Hellmanex IIISigma-AldrichZ805939Détergent
HEPES Sodium Salt (poudre blanche), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP410NaHEPES
Blender haute performanceAIMORESAS-UP1250Blender
His GraviTrapGE Healthcare11003399Gravity Column
ImidazoleSigma-AldrichI5513
IPTGSigma-AldrichI6758Isopropyl &beta ;-D-1-thiogalactopyranoside
Alcool isopropylique 99 %Pharmco by Greenfield Global231000099Isopropanol
JA-10 rotorBeckman Coulter369687
L-Glutamic sel de potassium monohydratéSigma-AldrichG1501K-Glutamate Lysozyme
de blanc d’oeuf de pouleSigma-AldrichL6876
Chlorure de magnésium hexahydratéSigma-AldrichM2670MgCl2&bull ; 6H2O
MES sel de sodiumSigma-AldrichM5057Acide 2-(N-Morpholino)éthanesulfonique sel de sodium
MOPSSigma-AldrichM1254Acide 3-(N-Morpholino)propanesulfonique
MP-3022TE TechnologyMP-3022Thermocouple
N,N,N',N'-Tétraméthyléthylènediamine 99 %, ACROS OrganicsFisher ScientificAC138450500TEMED
Spectrophotomètre UV-VIS Nanodrop 2000c SpectromètreE112352Thermo Fisher ScientificNikon
Ti2-E Microscope inversé NikonMEA54000
Norland Adhésif optique 81Norland ProductsNOA81Colle UV
Novex Sharp Étalon de protéines pré-coloréesThermo Fisher ScientificLC5800Échelle étalon de protéines
NuPAGE 4-12 % Bis-Tris Protein Gels, 1,5 mm, 10 puitsThermo Fisher ScientificNP0335BOXSDS gel
Optima L-90K UltracentrifugeuseBeckman Coulter365672
Parafilm PM996 Wrap, 4" de large ; 125 pi/rouleauCole-ParmerEW-06720-40Film de cire
Pe 300 ultra Système d’éclairage Simple bande, 3mm Contrôle du guide de lumière Bloc d’alimentationNikonPE-300-UT-L-SB-40Illuminateur LED froid Fluorure
de phénylméthanesulfonyleSigma-Aldrich78830PMSF
Sel monopotassique d’acide phosphoénolpyruvique, 99 %BeanTown Chemical129745PEP
Pierce Coomassie (Bradford) Kit de dosage des protéinesThermo Fisher Scientific23200
Mini comprimés d’inhibiteur de protéase PierceThermo Fisher ScientificA32953
TUYAUXSigma-AldrichP6757Acide 1,4-Pipérazinediethanesulfonic
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443
Poly(éthylène glycol)Sigma-Aldrich81300PEG. Poids moléculaire moyen 20 000 Da
Hydroxyde de potassium (granulés/certifié ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificP250-500KOH
PowerEase Alimentation 300W (115 VAC)ThermoFisher ScientificPS0300Alimentation DC de la boîte de gel
PS-12-8.4ATE TechnologyPS-12-8.4AAlimentation DC du régulateur
de températureEnzymes Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase du muscle de lapinSigma-AldrichP-0294PK/LDH
Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296 gallons par heureAmazonB005JWA612Pompe d’aquarium
Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells - NovagenMillipore Sigma71403Competent Cells
Four à micro-ondes Sharp ZSMC0912BS Four à micro-ondes de comptoir Sharp 900W, 0,9 pied cube, acier inoxydableAmazonB01MT6JZMRMicro-ondes pour faire bouillir l’eau
Chlorure de sodium (cristallin/certifié ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificS271-500NaCl
Dodécylsulfate de sodiumSigma-AldrichL3771SDS
Phosphate de sodium monobasiqueSigma-AldrichS8282NaH2PO4
Protéine de streptavidineThermo Fisher Scientific21122
SucroseSigma-AldrichS7903
TC-720TE TechnologyTC-720Régulateur de température
Tris Base, Biologie moléculaire Grade - CAS 77-86-1 - CalbiochemSigma-Aldrich648310Tris-HCL
Type 45 Ti rotorBeckman Coulter339160
Type 70 Ti rotorBeckman Coulter
Rotor Type 70.1 TiBeckman Coulter342184
VWR Ruban d’étiquetage de laboratoire à usage généralVWR89097-916Rubans en papier
VWR Micro Cover Glass, carrés, n° 1 1/2VWR48366-227Lamelles en verre
VWR Plain and Frosted Micro Slides, PremiumVWR75799-268Lames en verre
XCell SureLock Mini-CellThermoFisher ScientificEI0001Boîte de gel
ZYLA 5.5 USB3.0 Appareil photoNikonZYLA5.5-USB3Appareil photo CCD monochrome
Table antivibratoire 337922

Références

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