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Article de méthode

Mesure quantitative des protéines synthétisées intrathéquement chez les souris

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DOI :

10.3791/60495

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29 novembre 2019

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1Department of Neurology, Geisel School of Medicine & Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Program in Experimental and Molecular Medicine, Dartmouth College

Dans cet article

Résumé

Les niveaux élevés de protéine de fluide spinal peuvent être le résultat de la diffusion de la protéine de plasma à travers une barrière hémato-encéphalique altérée ou la synthèse intrathécale. Un protocole d'essai optimisé est présenté dans cet article qui aide à discriminer les deux cas et fournit des mesures quantitatives des protéines synthétisées intrathécally.

Résumé

Le liquide céphalo-rachidien (CSF), un fluide trouvé dans le cerveau et la moelle épinière, est d'une grande importance pour la science fondamentale et clinique. L'analyse de la composition des protéines du FSC fournit des informations cruciales dans la recherche fondamentale en neurosciences ainsi que dans les maladies neurologiques. Une mise en garde est que les protéines mesurées dans CSF peuvent dériver de la synthèse intrathécale et la transudation du sérum, et l'analyse des protéines de CSF ne peut déterminer la somme de ces deux composants. Pour faire la distinction entre la transudation des protéines dans le sang et les protéines produites par voie intrathéque dans les modèles animaux ainsi que chez les humains, les mesures de profilage des protéines CSF à l'aide d'outils conventionnels d'analyse des protéines doivent inclure le calcul du quotient d'albumine CSF/sérum (Qalbumin), un marqueur de l'intégrité de l'interface sang-cerveau (BBI), et l'indice protéique (Qprotein/Qalbumin), une estimation de la synthèse intrathécale. Ce protocole illustre l'ensemble de la procédure, du CSF et de la collecte de sang aux quotients et aux calculs d'indices, pour la mesure quantitative de la synthèse intrathécale de protéine et de l'affaiblissement de BBI dans des modèles de souris des désordres neurologiques.

Introduction

Le liquide céphalo-rachidien (CSF), un liquide clair et incolore entourant le cerveau et la moelle épinière, détient une grande importance clinique et scientifique fondamentale. Le CSF préserve l'environnement électrolytique du système nerveux central (SNC), équilibre le statut systémique acide-base, fournit des nutriments aux cellules neuronales et gliales, fonctionne comme un système lymphatique pour le SNC, et transporte des hormones, neurotransmetteurs, cytokines et autres neuropeptides tout au long du SNC1. Ainsi, comme la composition du CSF reflète l'activité du SNC, ce fluide offre un accès précieux, bien qu'indirect, pour caractériser l'état physiologique et pathologique du SNC.

CSF a été utilisé pour diagnostiquer les conditions qui affectent le SNC depuis plus de cent ans, et pour la plupart de ce temps, il a été principalement étudié par les cliniciens comme un outil de diagnostic. Cependant, au cours des dernières années, les neurobiologistes ont reconnu le potentiel de la FSC pour l'étude de la physiopathologie du SNC. En particulier, plusieurs outils d'analyse des protéines à haut débit ont été introduits dans le domaine des neurosciences, ce qui a permis une étude détaillée de la composition des protéines du CSF, dans l'espoir que cette analyse pourrait aider à mieux comprendre les changements dynamiques. se produisent au sein du SNC.

Les développements technologiques dans les techniques d'immuno-analyse multiplex telles que Luminex et Simoa technologies2,3, fournissent aux chercheurs d'aujourd'hui la capacité de détecter des centaines de protéines à de très faibles concentrations. En outre, ces mêmes technologies permettent l'utilisation de petits volumes d'échantillons, favorisant ainsi des études chez les petits animaux, y compris les souris, dans lesquelles des volumes d'échantillons limités de CSF ont empêché des caractérisations détaillées du fluide jusqu'à récemment.

Néanmoins, une mise en garde est que les protéines mesurées dans CSF peuvent dériver de la synthèse intrathécale et / ou la transudation du sérum en raison d'une interface sang-cerveau endommagée (BBI). Malheureusement, l'analyse des protéines de CSF seul ne peut déterminer la somme de ces deux composants. Pour faire la distinction entre les protéines transudées et les protéines produites par voie intrathéque, les mesures des protéines CSF à l'aide de tout outil d'analyse des protéines disponible doit être ajustée en fonction de la variabilité individuelle des concentrations de sérum ainsi que de l'intégrité de la barrière. Cependant, bien que cet ajustement soit couramment utilisé dans la pratique clinique, par exemple, l'indice IgG de CSF, qui a la sensibilité élevée pour détecter la synthèse intrathécale d'IgG4,5,6, à ce jour très peu d'études de recherche ont corrigé des concentrations de protéine de CSF pour la concentration de sérum et l'intégrité de barrière7,8.

Actuellement, l'approche Reibergram est le meilleur moyen de déterminer la fonction de barrière et la synthèse intrathécale des protéines. Il s'agit d'une évaluation graphique dans les diagrammes du quotient cSF/sérum qui analyse, de manière intégrée, à la fois la fonction barrière (dys) et la synthèse des protéines intrathécales, se référant à une protéine exclusivement dérivée du sang9,10. L'albumine protéique très abondante est généralement choisie comme protéine de référence parce qu'elle est produite seulement dans le foie et parce que sa taille, approximativement 70 kDa, est intermédiaire entre les petites et grandes protéines11. Le diagramme d'analyse a été défini pour la première fois par Reiber et Felgenhauer en 1987 pour les principales classes d'immunoglobulines (Igs)11, étant empiriquement basé sur les résultats obtenus à partir de l'analyse de milliers d'échantillons humains9. L'approche a ensuite été confirmée par l'application des deux lois de diffusion de Fick dans la théorie de la diffusion moléculaire/taux de débit12. Une telle théorie démontre la diffusion d'une protéine à travers la barrière a une distribution hyperbolique et peut expliquer quantitativement la dynamique des protéines dans le SNC9,13. Dans l'ensemble, l'avantage d'utiliser le Reibergram pour démontrer la synthèse des protéines intrathécales est qu'il identifie simultanément la fraction de protéines qui pénètre dans le CSF à partir du sérum ainsi que la quantité de protéines trouvées dans le CSF en raison de la production locale.

Le présent article et le protocole connexe décrivent l'ensemble de la procédure, du CSF et de la collecte de sang aux calculs finaux corrigeant les niveaux de protéine de CSF, pour la mesure quantitative de la synthèse intrathécale de protéine dans les modèles de souris de neurologique Troubles. Cette procédure fournit une ligne de base contre laquelle évaluer (1) l'origine pathophysiologique de toute protéine de CSF et (2) la stabilité et la signification fonctionnelle de l'intégrité de barrière. Cette procédure et ce protocole sont non seulement utiles pour évaluer les échantillons de CSF de souris, mais sont également utiles dans l'analyse de CSF dans une multitude de modèles animaux des maladies neurologiques et des patients humains.

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Protocole

Tous les travaux sur les animaux utilisent des protocoles examinés et approuvés par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de la Geisel School of Medicine de Dartmouth.

1. Collection de fluides

REMARQUE : Le sérum et le CSF sont exigés. Deux protocoles pour chaque collecte de fluides sont nécessaires pour la survie et l'autopsie.

  1. Collecte de sérum et de CSF en utilisant des procédures de survie
    REMARQUE : Pour la collecte de fluide de survie, la collecte de sérum devrait précéder la collection de CSF car c'est une procédure moins envahissante. CSF doit être obtenu dans la semaine suivant le tirage du sérum.
    1. Procédure de saignement rétro-orbital e pour la collecte de sérum.
      REMARQUE: Cette procédure est pour le saignement de survie des souris14. La procédure décrite s'applique à n'importe quel âge, sexe et souche de souris. Étant donné que les règles de l'IACUC stipulent qu'un volume sanguin maximal de 1 % du poids corporel peut être enlevé en tant qu'un seul prélèvement sanguin, il est recommandé que la procédure ne soit effectuée que sur des souris pesant plus de 15 g.
      1. Déplacez les cages contenant des souris de la grille à une zone de travail appropriée. Préparer la machine à gaz d'anesthésie en allumant le compteur d'oxygène à 1 L/min.
      2. Placer l'animal dans la chambre d'induction et fermer le couvercle hermétiquement. Allumez le vaporisateur d'isoflurane à 3,5 % et surveillez l'animal jusqu'à ce qu'il soit couché.
      3. Retirez l'animal de la chambre et évaluez le niveau d'anesthésie par réflexe de pédale, c'est-à-d., pincement ferme de pied. Assurer une profondeur adéquate de l'anesthésie avant d'effectuer la procédure: l'absence de réponse à une pincée ferme indique une anesthésie adéquate.
      4. Retenez la souris anesthésiée en saisissant la peau lâche derrière les oreilles avec le pouce et l'index de la main non dominante. Enbulge les yeux en utilisant l'index pour dessiner la peau au-dessus de l'œil et le pouce pour dessiner la peau sous les yeux.
      5. Placez la pointe d'une pipette Pasteur dans la douille de l'œil sous le globe oculaire(figure 1, panneau gauche), en dirigeant la pointe à environ 45 degrés vers le milieu de la prise oculaire(figure 1, panneau droit). Faites pivoter la pipette entre les doigts pendant le passage vers l'avant. Appliquer une pression douce, puis libérer jusqu'à ce que le sang pénètre dans la pipette.
        REMARQUE : La quantité maximale de sang qui peut être retirée à un moment donné de cet endroit est d'environ 1% du poids corporel, par exemple, 0,2 ml d'une souris de 20 g.
      6. Retirez délicatement le capillaire pour éviter les blessures à l'œil et placez le sang recueilli dans un tube centrifugeur de 1,5 ml. Fermez la paupière et appliquez une légère pression avec de la gaze pour éviter d'autres saignements. Une fois complètement alerte et mobile (généralement de 3 à 5 min), retournez la souris dans sa cage de retenue.
      7. Laisser le sang coaguler de 30 à 60 min à température ambiante (RT), puis centrifuger le sang pendant 10 min à 2 000 x g dans une centrifugeuse réfrigérée de 4 oC. À l'aide d'une technique de pipette propre, recueillir le sérum dans un nouveau flacon de 0,5 ml étiqueté. Congeler immédiatement la fiole de sérum à -80 oC.
    2. Collecte de CSF avec procédure de survie
      REMARQUE: Cette procédure est pour la chirurgie de survie, et il est basé sur le protocole publié par Liu et Duff en 200815. Les souris sont anesthésiés par un cocktail de kétamine (20 mg/mL), de xylazine (0,5 mg/mL) et d'acépromazine (0,5 mg/mL) administré par voie intrapéritone.
      1. Déplacez les cages contenant des souris du rack vers une zone de travail de chirurgie désignée. Préparer l'espace chirurgical dans un environnement stérile. Assurez-vous que tous les instruments et matériaux utilisés sont stérilisés avant la chirurgie.
      2. Peser la souris et calculer le volume d'anesthésie nécessaire (0,1 ml de cocktail d'anesthésie pour une souris de 20 g). Injecter l'anesthésie intrapéritone116. Après quelques minutes, testez la souris en pinçant le pavé pour assurer une anesthésie adéquate. Si plus d'anesthésique est nécessaire, injectez davantage 0,01 à 0,03 ml du cocktail anesthésique.
      3. Utilisez des ciseaux ou un rasage pour raser une petite zone de la tête, à l'extrémité caudale, médiale sur le crâne, pour exposer une zone de travail assez grande pour la collecte CSF. Placez la souris en position couchée sur l'instrument stéréotaxique, et stabilisez la tête en utilisant des barres d'oreille (Figure 2A).
        REMARQUE : La souris est posée de façon à ce que la tête forme un angle de près de 135 degrés avec le corps (Figure 2A). Une fois que l'animal est placé, un drapé chirurgical est employé pour maintenir un champ stérile au site chirurgical. Les rideaux adhésifs clairs sont préférés pour la collecte de CSF chez les souris, car ils permettent la visualisation directe et plus ciblée de l'animal.
      4. Swab le site chirurgical avec 30% de chlorhexidine diacétate. À l'aide d'un scalpel stérile, faire une incision sagittale de la peau inférieure à l'occiput pour exposer les muscles qui recèlent la cisterna magna.
      5. Par dissection émoussée avec des forceps, séparer le tissu sous-cutané et les muscles pour exposer la cisterna magna (Figure 2B). Utilisez des microrétracteurs pour maintenir les muscles à part (Figure 2B) et exposer la couche méningée dura mater sur la cisterna magna.
      6. Laver délicatement avec de la saline stérile tamponnée par le phosphate (PBS) pour éliminer toute contamination sanguine possible. Blot sécher le dura mater avec un coton-tige stérile et perforer doucement la membrane couvrant la cisterna magna avec une aiguille de 30 G. Insérez rapidement et doucement un petit tube capillaire en verre pour recueillir cSF (Figure 2C).
        REMARQUE : La pression intracrânienne permet à CSF de s'écouler spontanément dans le capillaire(figure 2C). Selon l'âge et la taille de la souris, environ 5 à 12 L de CSF sont obtenus à partir de chaque souris.
      7. Retirez soigneusement le tube capillaire de la membrane. Connectez le tube à une seringue de 3 ml à travers un tube en polyéthylène(tableau des matériaux)et injectez le CSF collecté dans un tube étiqueté de 0,5 ml (Figure 2D). Gardez les flacons dans la glace.
      8. Fermer l'incision en utilisant la suture de polydioxanone (PDS) avec l'aiguille jetable et en utilisant des sutures enterrées17. Nettoyez la zone de tout sang ou tissu séché.
      9. Injecter des souris, sous-cutanéeouillement ou intrapéritonement16, avec 0,05 à 0,1 mg/kg d'hydrochlorure de buprénorphine comme traitement analgésique. En outre, injecter sous-cutanée1 ml de saline stérile pour prévenir la déshydratation.
      10. Placez la souris dans une cage propre et chaude pour la récupération. Une fois que la souris est mobile et capable d'atteindre la nourriture et l'eau, placez la cage de nouveau sur le support.
      11. Centrifugeuse CSF pendant 10 min à 1 000 x g dans une centrifugeuse réfrigérée de 4 oC. Vérifier le degré de contamination sanguine par inspection visuelle pour l'identification de la xanthochromie et la présence d'une pastille rouge dans le fond du tube. Jetez les échantillons contaminés par le sang.
        REMARQUE : La formule utilisée pour la correction des quantités de protéines cSF dans les échantillons contaminés par le sang est basée sur des paramètres d'équation qui incluent la teneur en protéines dans le CSF et le sérum, l'hématocrit (HCT), et les globules rouges (RBC) comptent dans cSF et sang18. Cependant, une telle stratégie de correction ne peut pas être facilement appliquée aux spécimens de CSF de souris en raison du petit volume, limitant ainsi la stratégie de correction à une inspection visuelle.
      12. À l'aide d'une technique de pipette propre, collectez le CSF dans un nouveau tube de 0,2 ml, laissant derrière lui le granule avec des cellules. Diluer CSF 1:3 avec PBS pour réduire la perte de volume due à l'aérosol. Congeler immédiatement le flacon de CSF à -80 oC.
  2. Collecte de sérum et de FSC selon des procédures de non-survie
    REMARQUE : Pour la collecte de fluides non-survie, la collecte de CSF précède la collecte de sérum car la souris a besoin d'avoir une impulsion.
    1. Collection CSF chez necropsy
      REMARQUE : Cette procédure est pour la chirurgie de non-survie, et approximativement 10-20 l de CSF est obtenue de chaque souris. Un champ chirurgical stérile est recommandé, mais pas nécessaire pour la chirurgie de non-survie.
      1. Déplacez les cages contenant des souris de la grille à un espace de travail confortable. Suivez les étapes 1.1.2-1.1.2.7 et 1.1.2.11-1.1.2.12 pour la collecte CSF. Passez à la section 1.2.2 pour la collecte du sérum.
    2. Collecte de sang par perforation intracardiaque (approche ouverte)
      REMARQUE : Les volumes de sang attendus sont d'environ 3 % du poids corporel, par exemple, 0,6 ml à partir d'une souris de 20 g.
      1. Après la collecte CSF assurez-vous que la souris est encore suffisamment anesthésié en pinçant le pavé. Si une réaction est observée, administrer une deuxième dose d'anesthésique. Si aucune réaction n'est observée, procédez.
      2. Placez l'animal sur le dos et écouvillonnez la peau sur l'abdomen avec 70% d'alcool. À l'aide de ciseaux chirurgicaux, ouvrez la cavité thoracique et exposez le cœur. Insérer une aiguille de 25 G (attachée à une seringue de 3 ml) dans le ventricule gauche et appliquer délicatement une pression négative sur le piston à seringues. Retirez l'aiguille après la collecte de sang.
      3. Effectuez une méthode secondaire d'euthanasie comme la décapitation ou la luxation cervicale pour s'assurer que l'animal est décédé.
      4. Poussez le piston de la seringue vers le bas et injectez le sang recueilli dans un flacon de 1,5 ml. Laisser le sang clotpendant de 30 à 60 min à RT, puis le centrifuger pendant 10 min à 2 000 x g dans une centrifugeuse réfrigérée de 4 oC.
      5. En utilisant la technique de pipette propre, recueillir le sérum dans un nouveau flacon de 0,5 ml étiqueté. Congeler immédiatement la fiole de sérum à un congélateur de -80 oC.

2. Analyse des protéines

  1. Utilisez une méthode préférée, par exemple, la technologie Luminex, pour quantifier les protéines cibles et l'albumine dans les échantillons de sérum et de FSC assortis.
    REMARQUE : Ici, un exemple est donné avec la technologie magnétique DeLuminex, mais pratiquement n'importe quelle technique qui mesure des quantités de protéine, y compris les essais immunosorbent enzymatiques (ELISAs), peut être appliquée au protocole actuel. Idéalement, les échantillons de CSF et de sérum sont exécutés pour l'albumine et les protéines cibles sur la même plate-forme. Les conditions d'essai doivent être optimisées pour les étapes cruciales du protocole telles que la concentration d'accouplement de perles d'antigène, les dilutions d'échantillons de sérum et de CSF, les courbes standard les mieux adaptées pour chaque analyte et la composition tampon pour réduire la réactivité non spécifique. Si un kit commercial est utilisé pour la mesure des protéines, par exemple, le kit d'isotypage de l'immunoglobuline (Tableau des matériaux) utilisé pour obtenir des données présentées dansFigure 3, les instructions des fabricants doivent être suivies.
    1. Lors de la décongélation et avant l'analyse, centrifugez les échantillons de CSF et de sérum (2 000 x g pendant 10 min) et utilisez le supernatant pour empêcher l'engorgement des plaques de filtre et/ou de la sonde. Suivez la procédure d'assiduie fournie avec le kit pour les dilutions appropriées de l'échantillon. Sinon, déterminez la dilution appropriée pour chaque analyte et fluide. Diluer les échantillons dans PBS en conséquence.
      REMARQUE : S'il n'y a pas de directives ou d'instructions spécifiques, des dilutions pour chaque analyte et liquide doivent être établies avant le test d'étude, en déterminant les plages de dilution appropriées nécessaires pour obtenir des estimations de concentration qui se situent dans la plupart des gamme fiable d'une courbe standard. Connaître les caractéristiques de l'échantillon biologique à analyser, par exemple, les concentrations physiologiques et pathologiques dans le fluide, permet d'essayer différentes dilutions avec des échantillons de faible, moyenne, et haute teneur en analytes. Si l'étendue prévue des concentrations dans les échantillons est connue a priori, les dilutions peuvent être sélectionnées après avoir calculé combien de fois l'échantillon doit être dilué afin d'être dans la plage de courbe standard choisie.
      CAUTION: En calculant les facteurs de dilution, rappelez-vous que CSF a déjà été dilué 1:3.
    2. Préparer une courbe standard pour chaque protéine d'intérêt, par exemple, l'albumine et l'IgG utilisées pour générer des données dans la figure 3, en diluant en série les protéines standard de référence. Pendant la préparation des courbes standard, mélanger soigneusement chaque concentration plus élevée avant de faire la prochaine dilution.
      REMARQUE : Quelle que soit la méthode de quantification choisie, il est essentiel d'inclure une courbe standard chaque fois que l'analyse est effectuée pour estimer la concentration en protéines dans les échantillons. Le meilleur choix pour une norme de référence est une concentration épurée et connue de la protéine d'intérêt. Décider des dilutions spécifiques, ainsi que du nombre de points de données et de répliques utilisés pour définir la courbe standard, dépend du degré de non-linéarité dans la courbe standard.
    3. Sélectionnez les ensembles de perles magnétiques couplés à l'anticorps appropriés (Tableau des matériaux). Pour les flacons individuels de perles, sonicate chaque flacon pendant 30 s et vortex pendant 1 min. Préparer un « mélange de perles de travail » en diluant les stocks de perles à une concentration finale de 50 perles de chaque ensemble/l dans le tampon d'analyse/lavage (PBS, 1 % d'albumine de sérum bovin [BSA]). Ajouter 50 l de perles mélangées à chaque puits dans une assiette plate de 96 puits(tableau des matériaux).
      CAUTION: Les perles fluorescentes sont sensibles à la lumière. Par conséquent, ils doivent être protégés contre une exposition prolongée à la lumière tout au long de la procédure.
    4. Diagramme le placement des arrière-plans, des normes et des échantillons sur une feuille de travail de carte de puits.
    5. Ajoutez 50 ll de tampon d'analyse/lavage à chaque puits d'arrière-plan, et 50 l de chaque norme aux puits pour la courbe standard. Chargez 50 ml de chaque échantillon dilué dans les puits appropriés en dernier. Envelopper l'assiette de papier d'aluminium et couver d'agitation (800 tr/min) sur un shaker de plaque pendant 30 min à RT.
    6. Placez la plaque sur un aimant de poche (Table of Materials) et reposez la plaque sur l'aimant pendant 60 s pour permettre un réglage complet des perles magnétiques. Enlever le contenu du puits en décantant délicatement la plaque et en tapant sur les coussinets absorbants pour enlever le liquide résiduel.
    7. Laver la plaque en la retirant de l'aimant, en ajoutant 200 L de tampon d'assay/wash, en secouant pour 30 s, et enfin en le rattachant à l'aimant. Répéter le lavage 3x.
    8. Diluer l'anticorps de détection biotinylated, c.-à-d., anticorps étiquetés biotine élevés contre l'espèce hôte de protéine, à 4 'g/mL dans le tampon d'analyse/lavage. Ajouter 50 l l de l'anticorps de détection dilué à chaque puits. Couvrir l'assiette et couver pendant 30 min à RT sur le shaker à 800 tr/min. Placez la plaque sur l'aimant et répétez les étapes 2.1.6 et 2.1.7.
    9. Diluer la streptavidtine conjuguée à la phycoérythrine (PE) (SAPE) à 4 g/mL dans le tampon d'analyse/lavage. Ajouter 50 L de SAPE dilué à chaque puits. Couvrir l'assiette et couver pendant 30 min à RT sur le shaker à 800 tr/min. Placez la plaque sur l'aimant et répétez les étapes 2.1.6 et 2.1.7.
    10. Retirez la plaque de l'aimant et suspendez les perles dans 100 l de tampon d'assay/lavage. Lisez les puits à l'aide d'un double instrument de détection à flux laser qui permet de détecter l'ampleur de l'intensité de la fluorescence DE l'EP (FI).
      REMARQUE : Le signal, p. ex., FI, généré est proportionnel à la quantité d'antigène cible fixée à la surface des perles.
    11. Exporter des données brutes et créer des courbes standard en graphique signal de détection FI par rapport aux concentrations de protéines standard. Utilisez la courbe standard pour calculer la concentration de l'analyte dans les échantillons.
      REMARQUE : L'albumine est exprimée de préférence en g/dL, tandis que les protéines d'intérêt sont exprimées de préférence en mg/dL.

3. Calculs de l'indice intrathécal

  1. Organisez les valeurs de concentration de protéines dans une feuille de calcul et analysez les résultats en appliquant les formules suivantes.
  2. Calculer Qalbumin:
    Équation pour le quotient d’albumine, formule pour Q_albumin, relation entre le LCR et les taux d’albumine sérique.
    oùl'albumine CSF etl'albumine de sérum sont des concentrations d'albumine dans les spécimens assortis de sérum et de CSF, respectivement.
  3. Calculer laprotéineQ :
    Équation du rapport de concentration en protéines Q_protein=(CSF_protein/Serum_protein), analyse biochimique.
    où lesprotéines CSF etles protéines sériques sont des concentrations de protéines cibles dans des échantillons de sérum et de FSC appariés, respectivement.
  4. Calculer l'indice protéique :
    Formule de l’indice protéique, équation, Q_protein/Q_albumin, analyse biochimique.

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Résultats

Cette expérience représentative visait à comparer la synthèse intrathécale d'IgG dans deux modèles de rongeurs cliniquement pertinents de la sclérose en plaques (MS) : l'encéphalomyélite expérimentale expérimentale induite par le PLP 139-151 (R-EAE) et la maladie demyélinisation induite par le virus de la maladie d'Inthesélinisation induite par le virus PLP139-151(TMEV-IDD). R-EAE est un modèle utile pour comprendre la SP cyclique, tandis que le modèle TMEV-IDD présente une SP progressive chronique

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Discussion

Les méthodes quantitatives pour l'évaluation des concentrations accrues de protéines De CSF sont des outils utiles dans la caractérisation de l'état physiologique et pathologique du SNC. Cependant, au-delà de la quantification fiable des niveaux de protéines CSF, la détection des protéines CSF nécessite une expression de résultats qui discrimine entre les fractions dérivées du sang et du SNC dans le CSF. Cependant, à ce jour, les tests de quantification des protéines couramment utilisés ne permettent pas de discriminatio...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Les auteurs remercient le personnel du Center for Comparative Medicine and Research (CCMR) de Dartmouth pour les soins qu'ils ont soignés aux souris utilisées pour ces études. Le Fonds de recherche De Bornstein a financé cette recherche.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Seringue à insuline de 1 mLBD329650
Seringue de 1 mLBD329622
aiguille de calibre 25BD305122
seringue de 3 mLde calibre 30 BD309582
calibre 30305106
Coussinets absorbantsN’importe quelle marque
AcépromazinePatterson Vet Supply Inc
BioPlex Laveuse magnétique portableBioRad171020100Magnet
BioPlex MAGPIX Lecteur multiplexBioRad171015001
BioPlex Pro Flat Bottom Plates AnticorpsBioRad171025001
BiotinilatedDetection Anticorps Toute sourceL’anticorps doit être dirigé contre l’espèce de la protéine d’intérêt.
Albumine sérique bovine (BSA)SigmaA4503
Chlorhydrate de buprénorphinePAR PharmaceutiqueNDC 42023-179-05
Tubes capillairesInstrument de sutterB100-75-10OD : 1,0 mm, ID : 0,75 mm Verre borosilicaté 10 cm ; dessiné sur Bunsen pour réduire l’ID.
Tube à centrifuger, 0,2 mLVWR20170-012
Tube à centrifuger, 0,5 mLVWR87003-290
Tube à centrifuger, 1,5 mLVWR87003-294
Diacétate de chlorhexidineNolvasanE004272
Pointes de pipettes jetablesN’importe quelle marque
Barres auriculairesKOPF Instruments1921 ou 1922
EthanolKopterV1001
CongélateurVWRVWR32086A
GazeMedlineNON25212
Coussin chauffantSunbeamXL King Size SoftTouch, 4 réglages de chaleur avec arrêt automatique, Sarcelle, Chambre d’induction 12 pouces x 24 pouces
VETEQUIP
IsofluranePatterson Vet Supply IncNDC 14043-704-06
Kétamine (KetaVed)Patterson Vet Supply Inc
MagPlex Microspheres (couplée aux anticorps)BioRadde microplaques à billes magnétiques couplées
aux anticorps Southwest ScientificSBT1500
MicroretractorsCarfill QualityACD-010Blunt - 1 mm
Microsoft Microsoft MilliPlex
MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead PanelEMD MilliporeMGAMMAG-300KKit commercial pour la quantification par Luminex d’un panel d’isotypes et de sous-classes d’immunoglobulines dans les fluides de souris.
Kit ELISA de capture d’albuminede souris Novus BiologicalNBP2-60484Kit commercial pour la quantification par ELISA de l’albumine dans les fluides de souris.
Pipette multicanauxEppendorf3125000060
Écouvillons non stérilesMediChoiceWOD1002Besoin d’être autoclavé pour la stérilité
OxygèneAIRGASOX USPEA
Pasteur PippettesFisher13-678-20ASuture 5 & 3/4"
PDS avec aiguille jetable, 6-0 ProlenPatterson Vet8695GP-3 Découpe inversée, 18"
PE-StreptavidinBD Biosciences554061
PipettersEppendorfResearch Seriers
Tube en
Centrifugeuse réfrigéréeBeckman CoulterALLEGRA X-12R
ScaleUlineH2716
ScalpelFeatherEF7281
RasoirAppareil de Harvard52-5204
Protéines étalonsToute sourceLe meilleur choix pour un étalon de référence est une concentration purifiée et connue de la protéine d’intérêt.
Instrument stéréotaxiqueKOPF InstrumentsModèle 900LSAccessoires standard
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Références

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