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Article de méthode

Quantification des cellules proliférantes et mortes chez les entéroïdes

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DOI :

10.3791/60501

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31 janvier 2020

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1Jiangsu Key Laboratory of Neuropsychiatric Diseases and Cambridge-Suda (CAM-SU) Genomic Resource Center, Medical College of Soochow University, Department of Oncology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 2Department of Pathology, University of Chicago, 3Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital–Harvard Medical School

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Le protocole présenté utilise la cytométrie de flux pour quantifier le nombre de cellules proliférantes et mortes dans les entéroïdes de souris cultivés. Cette méthode est utile pour évaluer les effets du traitement médicamenteux sur la prolifération et la survie des organoïdes.

Résumé

L'épithélium intestinal agit comme une barrière qui empêche le contenu luminal, comme le microbiote pathogène et les toxines, d'entrer dans le reste du corps. La fonction de barrière épithéliale exige l'intégrité des cellules épithéliales intestinales. Tandis que la prolifération épithéliale de cellules maintient une couche continue de cellules qui forme une barrière, les dommages épithélial mènent au dysfonctionnement de barrière. En conséquence, le contenu luminal peut traverser la barrière intestinale par une voie sans restriction. La dysfonction de la barrière intestinale a été associée à de nombreuses maladies intestinales, telles que les maladies inflammatoires de l'intestin. Les cryptes intestinales isolées de souris peuvent être cultivées et maintenues comme structures crypt-villus-like, qui sont appelées organoïdes intestinaux ou « entéroïdes ». Les entéroïdes sont idéaux pour étudier la prolifération et la mort cellulaire des cellules épithéliales intestinales in vitro. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode simple pour quantifier le nombre de cellules prolifératives et mortes dans les entéroïdes cultivés. 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) et propidium iodide sont utilisés pour étiqueter la prolifération et les cellules mortes dans les entéroïdes, et la proportion de cellules proliférantes et mortes sont ensuite analysées par cytométrie de flux. Il s'agit d'un outil utile pour tester les effets du traitement médicamenteux sur la prolifération épithéliale intestinale et la survie cellulaire.

Introduction

Une fonction fondamentale des cellules épithéliales intestinales est de protéger l'entrée de contenus luminaltels tels que les bactéries pathogènes et les toxines1,2. Pour remplir une telle fonction, les cellules souches intestinales prolifèrent et se différencient continuellement en une variété de cellules épithéliales, y compris les entéroocytes et les cellules sécrétrices, qui forment une barrière en formant des connexions serrées3. Le renouvellement rapide des cellules épithéliales intestinales exige la coordination stricte de la prolifération cellulaire, de la différenciation cellulaire, et de la mort cellulaire4,5. La prolifération cellulaire réduite ou la mort cellulaire excessive entraîne des dommages épithéliales et une fonction de barrière compromise1,6. La dysfonction de la barrière intestinale a été associée aux maladies inflammatoires d'entrailles7,8.

Une méthode de culture des cryptes intestinales a déjà été développée. En utilisant cette technique, les cryptes de souris isolées se développent en organoïdes intestinaux (entéroïdes), qui ont des crypte-villus comme des structures et contiennent toutes les lignées épithéliales intestinales9,10. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) est un analogue thymidine qui est capable de remplacer la thymine (T) dans l'ADN qui subit une réplication pendant la prolifération cellulaire. Les cellules proliférantes peuvent être rapidement et avec précision étiquetées par la coloration EdU. Propidium iodide (PI) est un analogue du bromure d'éthidium qui libère la fluorescence rouge lors de l'insertion dans l'ADN à double brin. PI détecte spécifiquement les cellules mortes, car il ne passe à travers la membrane cellulaire endommagée.

Dans ce protocole, nous décrivons d'abord comment isoler des cryptes de l'intestin grêle murine puis les culture comme entéroïdes in vitro. Nous décrivons ensuite comment analyser les cellules proliquaires et mortes dans les entéroïdes par l'incorporation et la cytométrie d'écoulement d'EdU et d'IP.

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Protocole

Ce protocole a été approuvé par le Comité des soins et de l'utilisation des animaux du Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU) de l'Université Soochow.

1. Isolation et culture organoïdes intestinaux

  1. Isolement des cryptes intestinales et de la culture entéroïde
    1. Euthanasiez une souris sauvage de 8 semaines avec inhalation de CO2. Utilisez des forceps tissulaires et des ciseaux fins à l'iris pour disséquer environ 8 cm d'ilém.
    2. Rincer à l'aide d'une seringue avec une aiguille d'alimentation gavage avec environ 40 ml de salin tamponné par le phosphate (DPBS) de Dulbecco, puis couper dans le sens de la longueur avec des ciseaux et ouvrir l'ilum.
    3. Couper l'ilédès en petits morceaux (0,5 à 1,0 cm). Placer les morceaux dans 5 ml de DPBS stérile glacé dans un tube conique de 15 ml, puis se balancer pendant 5 min sur glace.
    4. Utilisez un contrôleur de pipette pour aspirer le DPBS et le remplacer par 10 ml de tampon froid 1 (2 mM EDTA en DPBS). Roche pendant 30 min sur glace.
    5. Utilisez le contrôleur de pipette pour aspirer le tampon 1 et remplacer par 10 ml de tampon froid 2 (54,9 mM D-sorbitol, 43,4 mM de saccharose en DPBS). Agiter pendant 2 à 3 min à la main (80 secousses/min).
    6. Prendre une gouttelette de 20 llet de 2 contenus tampon après avoir tremblé et inspecter sous un microscope.
    7. Filtrer le contenu tampon 2 avec une passoire à cellules stériles de 70 m, puis recueillir le tampon filtré avec un tube conique de 50 ml.
    8. Pipette 20 l de filtrate sur la diapositive pour compter les cryptes. Transférer un volume suffisant de tampon 2 à partir de l'étape 1.1.7 pour s'assurer qu'il y a 500 cryptes/puits.
    9. Faire tourner à 150 x g pendant 10 min à 4 oC. Une fois la filature terminée, aspirez soigneusement le supernatant.
    10. Suspendre les cryptes dans 50 L de matrice membranaire du sous-sol (p. ex. Matrigel) par 500 cryptes, pipette de haut en bas (en prenant soin d'éviter les bulles), puis placez une gouttelette de 50 llet de matrice de membrane de sous-sol / mélange de crypte au centre d'un puits dans une plaque de 24 puits. Incuber pendant 30 min à 37 oC pour polymériser la matrice membranaire du sous-sol.
    11. Après 30 min de polymérisation, ajoutez soigneusement 600 l de minigut media (advanced Dulbecco's modified Eagle medium [DMEM]/F12, 2 mM L-alanine-L-glutamine, pen/strep [100 unités/mL], 10 mM Hepes, supplément N2 [1:100], supplément B27 [1:50] avec facteur de croissance épidermique [EGF; 50 ng/mL], Noggin [100 ng/mL], R-spondin [500 ng/mL], et Y27632 [10 M]) à chaque puits, puis retournent la plaque à l'incubateur 37 oC. Observez au microscope chaque jour et changez les médias tous les deux à trois jours.
  2. Passaging Enteroid
    REMARQUE : Pour les cultures longues, les entéroïdes doivent être divisés environ chaque semaine.
    1. Pour passer les entéroïdes, placez la plaque de culture tissulaire sur la glace. Aspirez les médias et ajoutez 1 ml de DPBS froid à chaque puits. Utilisez une pointe P1000 pour faire monter et descendre jusqu'à ce qu'il ne reste plus de morceaux solides de matrice de membrane de sous-sol.
    2. Passer de haut en bas une fois à travers une seringue à insuline de 1 ml (27 G) et dans un tube conique de 15 ml. Faire tourner vers le bas pendant 5 min à 150 x g à 4 oC.
    3. Utilisez pipette pour supprimer DPBS. Resuspendre dans 50 L de matrice/puits de membrane de sous-sol.
    4. Placer la plaque dans un incubateur de 37 oC pendant 30 min pour permettre à la matrice de membrane du sous-sol de polymériser. Regroupez chaque puits de 600 oL de supports ENR (minigut media, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL Noggin, 500 ng/mL R-spondin), puis retournez la plaque à l'incubateur.

2. Analyse de cytométrie de flux des cellules EdU-positives dans les entéroïdes

REMARQUE : La figure 1 montre le flux de travail pour l'analyse de cytométrie de flux des cellules EdU-positives dans les entéroïdes.

  1. Incubation d'entéroïdes avec EdU
    1. Cultivez les entéroïdes à partir de l'étape 1.2.4 pendant 5 à 7 jours. Passage enteroids dans une nouvelle plaque de 24 puits dans un rapport de fractionnement de 1:2. Ajouter 600 l de milieu ENR à chaque puits. Incuber les entéroïdes pendant 4 à 5 jours dans un incubateur de 37 oC.
    2. Définir le groupe témoin (entéroïdes non traités) et le groupe expérimental (entéroïdes traités avec 5 ng/mL d'interleukine 22 [IL-22]). Préparer au moins trois répliques pour chaque groupe.
    3. Ajouter de l'EdU au support ENR pour préparer le milieu EdU avec une concentration de 50 M. Ajouter 600 oL de milieu EdU à chaque puits et incuber pendant 2 h dans un incubateur de 37 oC. Définir un puits d'entéroïdes sans traitement EdU comme un contrôle négatif pour la soustraction de fond.
  2. Récolte des entéroïdes de la matrice de membrane de sous-sol
    1. Utilisez un contrôleur de pipette pour aspirer le milieu EdU et laver 1x avec DPBS. Ajouter 1 ml de DPBS.
    2. Utilisez la pointe de pipette P1000 et la pipette de haut en bas jusqu'à ce qu'il ne reste plus aucun morceau solide de matrice de membrane de sous-sol. Transférer dans un tube de 15 ml et faire tourner à 300 x g pendant 5 min. Jeter le supernatant.
    3. Ajouter 500 l d'enzymes de dissociation cellulaire(tableau des matériaux)et incuber pendant 15 min à 37 oC. Utilisez la pointe de pipette P200 et la pipette de haut en bas pour décomposer les entéroïdes en cellules simples.
    4. Ajouter 3 mL de milieu DMEM contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et une pipette répétée avec une pointe de pipette P1000.
    5. Faites tourner à 300 x g pendant 5 min et aspirez le milieu supernatant. Resuspendre les cellules avec 1 ml de DPBS.
  3. Fixation et perméabilisation des cellules
    1. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 1,5 ml, faire tourner à 300 x g pendant 5 min, et jeter le supernatant.
    2. Resuspendre les cellules avec 1 ml de paraformaldéhyde de 4 % (PFA), fixer pendant 15 min à température ambiante (RT) et descendre à 300 x g pendant 5 min. Aspirez le supernatant avec une pointe de pipette, lavez 1x avec DPBS, et faites tourner vers le bas pour enlever le supernatant.
    3. Resuspendre les cellules avec 1 ml de 0,5% de surfactant nonionique. Incuber pendant 10 min à RT.
    4. Faites tourner à 300 x g pendant 5 min et aspirez le supernatant. Laver 1x avec DPBS et tourner vers le bas pour enlever le supernatant.
  4. Détection de l'EdU
    1. Préparer des solutions de stock pour chaque composant à l'avance: 1) solution de travail de l'azide Alexa Fluor, 2) solution de travail de 1x tampon de réaction EdU, et 3) 10x solution de stock de l'additif tampon EdU.
    2. Préparer 1x Additif tampon EdU en diluant la solution 10x 1:10 dans de l'eau déionisée. Préparer cette solution fraîche.
    3. Préparer le cocktail de réaction selon le tableau 1.
      REMARQUE : Ajouter les ingrédients dans l'ordre indiqué dans le tableau. Utilisez le cocktail de réaction dans les 15 minutes suivant la préparation.
    4. Ajouter 100 l de cocktails de réaction à chaque tube de 1,5 ml. Resuspendre les cellules, protéger de la lumière, incuber pendant 30 min à RT.
    5. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min et aspirelaz doucement la solution de réaction avec une pointe de pipette.
    6. Ajouter 0,5% de pénétrant nonionic surfactant à chaque tube pour laver 1x à RT. Centrifuge à 300 x g pendant 5 min, aspirer le supernatant avec la pointe de pipette doucement, et resuspendre les cellules dans 1 ml de DPBS.
  5. Analyse des cellules par cytométrie de flux
    1. Filtrer les cellules suspendues à l'air d'une passoire de 40 m, puis recueillir les cellules filtrées avec un tube conique de 15 ml. Effectuer la détection FACS sur machine dès que possible.
      REMARQUE : Si les conditions sont limitées, les échantillons tachés de cellules doivent être stockés dans l'obscurité à 4 oC et testés dans les 3 jours.
    2. Sélectionnez le canal approprié (selon le type d'azide Alexa Fluor dans le kit EdU; ici, canal rouge) et la tension (ici, 150 à 350 V) pour l'analyse de cytométrie de flux.
    3. Stratégie de gating
      1. Dessinez une parcelle pseudo-couleur FSC-A (x-axe) vs SSC-A (y-axe) et distribuez la plupart des cellules à la plage visible de la carte à points en ajustant la tension. Sélectionnez la population cellulaire (R1) et excluez les débris cellulaires dans le coin inférieur gauche.
      2. De la population de cellules R1, établir un FSC-A (x-axe) vs. FSC-H (y-axe) pseudocolor plot, et définir la porte pour sélectionner les cellules uniques (R2) pour exclure les amas cellulaires.
      3. De la population de cellules R2, établir l'intensité de fluorescence (x-axe) vs. nombre de cellules (y-axe) trace, et utiliser le contrôle négatif pour définir la porte. La région du signal fluorescent est une région cellulaire positive (R3). Comparez le rapport des cellules EdU-positives (R3) entre les groupes expérimentaux et témoins.

3. Analyse de cytométrie de flux des cellules PI-positives dans les entéroïdes

REMARQUE : La figure 2 montre le flux de travail pour l'analyse de cytométrie de flux des cellules PI-positives dans les entéroïdes.

  1. Incubation de cellules entéroïdes avec PI
    1. Cultivez les entéroïdes à partir de l'étape 1.2.4 pendant 5 à 7 jours. Passage enteroids dans une nouvelle plaque de 24 puits dans un rapport de fractionnement de 1:2. Ajouter 600 l de milieu ENR à chaque puits. Incuber les entéroïdes pendant 4 à 5 jours dans un incubateur de 37 oC.
    2. Définir le groupe témoin (non traité) et le groupe expérimental (traité IL-22), en utilisant au moins trois répliques pour chaque groupe.
    3. Ajouter PI au milieu ENR pour préparer le milieu PI avec une concentration de 3 M.
    4. Ajouter 600 ll de PI moyen à chaque puits et couver pendant 30 min dans un incubateur de 37 oC. Définir un puits d'entéroïdes sans traitement IP comme un contrôle négatif pour la soustraction de fond.
  2. Récolte des entéroïdes à partir de la matrice membranaire du sous-sol suivant les étapes 2.2.1-2.2.5.
  3. Analyse des cellules par cytométrie de flux
    1. Filtrer les cellules suspendues à l'intérieur d'une passoire de 40 m et recueillir les cellules filtrées à l'abri d'un tube conique de 15 ml.
    2. Effectuer la détection FACS sur machine dès que possible.
      REMARQUE : Si les conditions sont limitées, les échantillons tachés de cellules doivent être stockés dans l'obscurité à 4 oC et testés dans les 3 jours.
    3. Sélectionnez le canal approprié (ici, canal rouge) et la tension (ici, 150 à 350 V) pour l'analyse de cytométrie du débit.
    4. Utilisez la même stratégie de gating que décrite à la section 2.5.3.

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Résultats

Les petites cryptes intestinales ont été isolées et cultivées comme entéroïdes dans la matrice de membrane de sous-sol. Les entéroïdes ont commencé à former des bourgeons 2 jours après l'isolement. Le jour 6, les entéroïdes avaient beaucoup de bourgeons avec beaucoup de débris (cellules mortes) dans le lumen. Les entéroïdes étaient prêts à être adoptés à ce stade (figure 3).

De nombreuses études ont montré que les cytokines inflammatoires sont essentielles pour le...

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Discussion

Ce protocole détaille les étapes nécessaires à la culture des entéroïdes in vitro et à la quantification des cellules EdU et PI-positives dans les entéroïdes par cytométrie de flux. Cette stratégie présente plusieurs avantages. Tout d'abord, l'étiquetage EdU est utilisé pour détecter les cellules proliférantes dans les entéroïdes. Par rapport à l'analyse BrdU traditionnelle, la méthode d'étiquetage EdU est plus rapide, plus sensible et plus précise. L'EdU est très similaire à la thymine (T), qui remplace la thymine dans ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Ce travail est soutenu par la National Natural Science Foundation of China (31971062, 31900326, et 31601022), The Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20190043, BK20180838), Research Fund of State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, Université de Nanjing (KF-GN-202004). La Fondation des sciences naturelles des Jiangsu Higher Education Institutions of China (19KJB320003), le Livelihood and Technology Program of Suzhou City (SYS2019030) et le Research Innovation Program for College Graduates of Jiangsu Province (KYCX19-1981) . Ce travail est également soutenu par Tang Scholar de l'Université de Soochow.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube à centrifuger 15 mlCorning430791
22 G Aiguille à gavageVWR20068-608
Plaque à 24 puitsNunc142475
40 mm Filtre à cellules stérilesBD352340
Tube à centrifuger de 50 mlCorning430829
70 mm Filtre à cellules stérilesBD352350
Advanced DMEM/F-12GIBCO12634010
Attune NxT Acoustic Focusing CytometerInvitrogenA24863
B-27 SupplementGIBCO17504044
Buffer 12 mM EDTA dans DPBS
Buffer 254,9 mM D-sorbitol, 43,4 mM de saccharose chez les
sourisDPBS C57/B6Institut de recherche biomédicale de Nanjing de l’Université
Enzymes de dissociation cellulaire (TrypLE)Life technologies12605-010
CentrifugeuseEppendorf5424
CentrifugeuseEppendorf5424R
CentrifugeuseEppendorf5810R
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Kit d’imagerieLife technologiesC10639
Incubateur CO2PanasonicMCO-18AC
DPBSGIBCO
D-sorbitolBBISB0491
EDTABBIEB0185
MédiaMédia Minigut, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin
Sérum fœtal bovin (FBS)Gibco10270-106
Ciseaux à iris finTansoole2037454
Microscope à fluorescenceOlympusFV1000
GlutaMAX SupplementGIBCO35050-061
Goat SerumLife technologies16210-064
HDMEMHycloneSH30243.01B
HEPESSigmaH4034
MatrigelCorning356231
Minigut médiaAdvanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 unités/ml), 10 mM Hepes, supplément N2 (1:100), supplément B27 (1:50)
Supplément N2R& DAR009
Tensioactif non ionique (Triton X)BBITB0198-500ML
Ciseaux opératoires (12,5 cm)Tansoole2025785
Paraformaldéhyde (PFA)sigma158127-500g
Penn/StrepInvitrogen15140-148
Microscope à contraste de phaseNikonTS1000
Iodure de propidiumSigmaP4170-25MG
EGF recombinantPeproTech315-09
Cornege de souris recombinantePeproTech250-38
Souris recombinante R-Spondin 1R& D3474-RS-050
Souris recombinante IL-22PeproTech210-22-10
SaccharoseBBISB0498
Pince à tissusTansoole2026704
Y-27632 2HC1SelleckS1049
de Nanjing 14190144 ENR

Références

  1. Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).
  2. Buckley, A., Turner, J. R. Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).
  3. Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).
  4. Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
  5. Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut. Frontiers in Immunology. 10, 1094(2019).
  6. Li, B. R., et al. In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032(2018).
  7. Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).
  8. Graham, W. V., et al. Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis. Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).
  9. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  10. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
  11. Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease. Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).
  12. Zha, J. M., et al. Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).

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Réimpressions et autorisations

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Culture d ent ro desCytom trie en fluxMarquage l EdUIodure de propidiumCellules pith liales intestinalesProlif ration cellulaireMort cellulaireIsolation des cryptesMatrice de membrane basaleTraitement l IL 22
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