Article de méthode

Microdissection de capture laser du cartilage embryonnaire de souris et de l'os pour l'analyse d'expression génique

DOI :

10.3791/60503

⸱

18 décembre 2019

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1Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Icahn Institute for Data Science and Genomic Technology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit la microdissection de capture de laser pour l'isolement du cartilage et de l'os des sections congelées fraîches de l'embryon de souris. Le cartilage et l'os peuvent être rapidement visualisés par la coloration violette de cresyl et rassemblés précisément pour produire l'ARN de haute qualité pour l'analyse transcriptomique.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microdissection de capture au laser (LCM) est un outil puissant pour isoler des types de cellules ou des régions d'intérêt spécifiques des tissus hétérogènes. La complexité cellulaire et moléculaire des éléments squelettiques augmente avec le développement. L'hétérogénéité tissulaire, comme à l'interface des éléments cartilagineux et osseux les uns avec les autres ou avec les tissus environnants, est un obstacle à l'étude du développement du cartilage et des os. Notre protocole fournit une méthode rapide de traitement des tissus et l'isolement du cartilage et des os qui donne un ARN de haute qualité pour l'analyse de l'expression génique. Les tissus congelés frais des embryons de souris sont sectionnés et de brèves taches violettes cresyl est utilisée pour visualiser le cartilage et les os avec des couleurs distinctes des tissus environnants. Les glissements sont alors rapidement déshydratés, et le cartilage et l'os sont isolés par la suite par LCM. La minimisation de l'exposition aux solutions aqueuses au cours de ce processus maintient l'intégrité de l'ARN. Le cartilage et l'os mandibulaire de Mouse Meckel à E16.5 ont été avec succès rassemblés et l'analyse d'expression de gène a montré l'expression différentielle des gènes de marqueur pour des ostéoblastes, des osteocytes, des osteoclastes, et des chondrocytes. L'ARN de haute qualité a également été isolé à partir d'une gamme de tissus et d'âges embryonnaires. Ce protocole détaille la préparation de l'échantillon pour le LCM, y compris la cryoembedding, le sectionnement, la coloration et la déshydratation des tissus frais congelés, et l'isolement précis du cartilage et de l'os par LCM ayant pour résultat l'ARN de haute qualité pour l'analyse transcriptomique.

Introduction

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Le système musculo-squelettique est un système multicomposant composé de muscle, tissu conjonctif, tendon, ligament, cartilage et os, innervé par les nerfs et vascularisé par les vaisseaux sanguins1. Les tissus squelettiques se développent avec l'hétérogénéité cellulaire croissante et la complexité structurale. Le cartilage et l'os se développent à partir de la même lignée osteochondroprogenitor et sont fortement liés. Le cartilage et l'os embryonnaires se développent en association avec des muscles, des nerfs, des vaisseaux sanguins, et le mésenchyme indifférencié. Le cartilage peut également être entouré par l'os, tel que le cartilage de Meckel et le cartilage condylar dans l'os mandibulaire. Ces tissus sont anatomiquement associés et interagissent les uns avec les autres par des signaux extracellulaires au cours du développement. Dans l'étude de l'expression génique dans le développement du cartilage et de l'os, un obstacle est l'hétérogénéité des structures squelettiques composées de plusieurs types de tissus. L'isolement précis du tissu spécifique d'intérêt est la clé pour l'analyse transcriptionnelle réussie.

La microdissection de capture au laser (LCM) est un outil puissant pour isoler les types de cellules ou les régions d'intérêt dans les tissus hétérogènes, et est reproductible et est sensible au niveau cellulaire unique2. Il peut précisément cibler et capturer des cellules d'intérêt pour un large éventail d'essais en aval dans la transcriptomique, la génomique et la protéomique3,4. La qualité de l'ARN, de l'ADN ou de la protéine isolés peut être évaluée à l'aide d'un bioanalyseur ou d'une plate-forme équivalente. Par exemple, la qualité de l'ARN est indiquée par le numéro d'intégrité de l'ARN (RIN)5.

Ici, nous fournissons un protocole pour la coloration rapide et l'isolement du cartilage et de l'os par LCM des tissus congelés frais. Nous utilisons l'embryon de souris pour démontrer que ce protocole donne de l'ARN de haute qualité pour l'analyse transcriptomique ultérieure, comme le séquençage de l'ARN (ARN-seq).

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Protocole

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Les tissus de souris ont été obtenus conformément au National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, et les protocoles d'étude ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'École de médecine Icahn du Mont Sinaï.

1. Préparation de spécimens congelés frais

  1. Disséquer l'embryon ou le tissu d'intérêt. Intégrer l'échantillon dans un moule d'intégration jetable avec une température de coupe optimale (OCT). Ajuster l'orientation du spécimen à l'aide d'une pointe ou d'une aiguille.
  2. Congelez rapidement les échantillons dans un bain de glace sèche/méthyl-2-butane. Continuer jusqu'à l'étape suivante ou conserver à -80 oC.
    REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.

2. Cryosectioning pour la microdissection de capture de laser

  1. Décongeler le cryostat et nettoyer les surfaces internes avec 70 % d'éthanol. Traiter la plaque anti-rouleau et une paire de forceps avec l'agent de décontamination RNase. Fixer le cryostat à la température de coupe désirée (-18 à -22 oC). Préparer un contenant à couvercle avec de la glace sèche, en plaçant une feuille de papier d'aluminium sur la glace sèche pour le stockage temporaire des glissières d'échantillon sectionnées pendant la cryosection.
    MISE EN GARDE: La glace sèche est extrêmement froide. Manipulez toujours de la glace sèche avec soin et portez des gants isolés lorsque vous la manipulez.
  2. Transférer le spécimen congelé frais dans un seau de glace sèche. Placez une couche de composé OCT sur un porte-spécimen de cryostat et placez immédiatement le spécimen sur le dessus de l'OCT avec une légère pression. Lorsque l'OCT est complètement congelé, attachez le support avec le spécimen dans le bras de coupe de cryostat.
  3. Laisser l'échantillon dans le cryostat pendant 15 min pour l'équilibre à la température de coupe.
  4. Sectionnez le tissu et collectez les tranches sur les glissières de membrane de naphtalate de polyéthylène (PEN) à une épaisseur de 12 m. Aligner les sections consécutives sur la membrane. Une fois la diapositive terminée, laisser sécher les sections pendant quelques minutes et transférer la glissière sur le papier d'aluminium dans le contenant de glace sèche jusqu'à ce que toutes les glissières requises soient ramassées.
  5. Conserver les diapositives à -80 oC dans une boîte à diapositives.
    REMARQUE: L'épaisseur de la section est choisie pour maximiser la quantité de tissu recueillie tout en permettant une coupe efficace du tissu, et peut varier en fonction du tissu d'intérêt. Le protocole peut être mis en pause ici. Gardez les glissières exemptes de contamination par la RNase. Évitez les changements de température. Bien que les RIN de l'ARN des diapositives stockées pendant jusqu'à 6 mois puissent encore indiquer la haute qualité de l'ARN, nous recommandons d'utiliser des glissières dès que possible.

3. Préparation d'échantillon pour la microdissection de capture de laser

  1. Préparer des solutions pour la coloration et la déshydratation.
    1. Placer 45 ml d'éthanol à 80 % dans chacun des trois tubes centrifugeuses de 50 ml sur la glace. Étiquetez-les comme #1, #2 et #3. Diluer l'éthanol avec de l'eau libre RNase/DNase.
    2. Placer 45 ml d'éthanol à 95 % dans un tube de centrifugeuse de 50 ml sur la glace.
    3. Placer 45 ml d'éthanol à 100 % dans un tube de centrifugeuse de 50 ml sur la glace.
    4. Placer 45 ml de xylène dans un tube de centrifugeuse de 50 ml à température ambiante.
      MISE EN GARDE: Xylène doit être utilisé dans une hotte de fumée.
  2. Décongeler brièvement une glissière à membrane PEN en la plaçant contre une main gantée, puis laver deux fois pendant 30 s chacune dans 45 ml d'éthanol à 80 % (#1 et #2) avec de l'agitation dans des tubes centrifugeurs de 50 ml pour enlever l'OCT.
    REMARQUE: Il est important d'enlever l'OCT avant la coloration, pour empêcher OCT desserré pendant la coloration d'obscurcir les sections. Forceps peut être utilisé pour faciliter l'enlèvement de l'OCT qui n'est pas lavé par l'agitation.
  3. Déposer la glissière sur une feuille de papier d'aluminium. Pipette 0,8 ml de 0,1 % de cresyl violet dans 50 % d'éthanol sur la glissière et tache pendant 30 s. Laver la glissière en 45 ml d'éthanol à 80 % (#3) pour 30 s, puis déshydrater par passage pour 30 s chacun à 45 ml d'éthanol à 95 %, 100 % d'éthanol et xylène dans des tubes de 50 ml centrifugeuses.
  4. Tenez les glissières sur un essuie-glace délicat pendant 5 min pour égoutter les sections xylène et sèches.
    REMARQUE: Les glissières doivent être séchées complètement avant l'OrC.

4. Microdissection de capture de laser

REMARQUE: Portez des gants nitriles sans poudre tout en effectuant LCM.

  1. Allumez le microscope LCM, le laser et l'ordinateur. Connectez-vous à l'ordinateur et démarrez le logiciel. Tournez la clé de la position "On" pour démarrer le laser. Lorsque la lumière verte (Laser) est allumée, appuyez sur le bouton rouge pour activer le laser, puis la lumière (Laser) devient rouge indiquant laser est prêt à utiliser.
    REMARQUE: Le laser a besoin d'environ 10 min pour se réchauffer.
  2. Configurez les tubes de collecte.
    1. Insérer le bouchon d'un tube de réaction en chaîne de polymérase (PCR) de 0,5 mL dans le collecteur.
      REMARQUE: Choisissez le collecteur correspondant pour les tubes PCR désirés (0,2 ou 0,5 ml).
    2. Pipette 50 'L de tampon d'extraction (fourni par le kit d'isolement de l'ARN énuméré dans le tableau des matériaux) dans le bouchon du tube de collecte de 0,5 ml.
    3. Insérer le dispositif de collecte dans le microscope.
    4. Dans la fenêtre De change Collector Device, cliquez sur le bouton Move to Reference Point pour déplacer le collecteur vers le point de référence (RP). Ajuster la mise au point pour afficher clairement le RP. Cliquez sur les flèches pour déplacer le RP vers le centre de la vue.
  3. Chargez les diapositives de spécimen.
    1. Cliquez sur le bouton déchargement gauche dans la barre d'outils pour abaisser le support de diapositive.
    2. Placez la glissière dans le support, avec la section de tissu orientée vers le bas.
      REMARQUE: Cette orientation garantit que les sections de tissu capturées tombent dans le bouchon du tube de collecte par gravité.
    3. Insérez le support dans la scène.
  4. Configurez les paramètres laser.
    1. Sélectionnez l'option Contrôle du menu Laser ou cliquez sur l'icône Laser.
    2. Ajuster ces paramètres comme vous le souhaitez: Puissance, la puissance du laser; Ouverture, la largeur du laser; et Speed, la vitesse de coupe en mode Dessiner et Coupe.
      REMARQUE: Testez le laser dans une zone hors d'intérêt. Une puissance plus élevée ou une ouverture plus grande facilite la coupe, mais cause plus de dommages aux cellules. Ajuster la combinaison de puissance, d'ouverture et de vitesse pour obtenir une coupe efficace et des dommages minimes du tissu. Par exemple, puissance 40, Ouverture 5 et Vitesse 7 pour le tissu cartilagineux sur une section de 12 m.
  5. Sélectionnez et coupez les zones d'intérêt.
    1. Commencez avec 5x objectif et trouver les zones d'intérêt, puis passer à l'objectif (5x, 10x, ou 40x) qui montre le mieux la zone d'intérêt.
      REMARQUE: Après la coloration violette cresyl, les cartilages sont magenta souillés et les tissus minéralisés semblent bruns ou noirs, se distinguant des autres tissus. Les images peuvent être enregistrées à l'aide de Save Image As du menu Fichier.
    2. Choisissez le tube pour la collecte (A, B, C, D) en cliquant sur la marque au collecteur.
    3. Choisissez Move and Cut or Draw and Cut. En mode Déplacer et couper, le spécimen est coupé manuellement, à l'aide de la souris ou du stylo à écran tactile pour dessiner des formes à main levée. En mode Dessiner et Couper, les formes peuvent être dessinées à main levée avec la souris ou le stylo à écran tactile pour la coupe ultérieure. Cliquez sur le bouton Démarrer la coupe pour lancer la découpe au laser.
    4. Une fois la coupe terminée, le tissu cible avec membrane PEN tombe dans le bouchon du tube de collecte par gravité. Répétez 4.5 pour mettre en commun plusieurs domaines d'intérêt si nécessaire.
      REMARQUE: Répéter des coupures ou augmenter la puissance ou l'ouverture peut être nécessaire si le tissu ne tombe pas dans le bouchon du tube de collecte en raison de la coupe incomplète. L'os minéralisé (brun ou noir) ne peut pas être coupé directement au laser.
  6. Déchargez le collecteur et fermez soigneusement le tube PCR. Placer les tissus microdissés dans de la glace sèche. Continuer jusqu'à l'étape suivante ou conserver à -80 oC.
    REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Répétez 4,2 à 4,6 pour l'échantillon suivant.

5. Lysis des tissus microdissés et de l'isolement d'ARN

  1. Décongeler les tissus microdissés à température ambiante. Centrifugeuse brièvement et incuber les échantillons pendant 30 min à 42 oC.
  2. Après l'incubation, faites tourner le tampon de lyse vers le bas dans le tube PCR de 0,5 ml. Effectuer le traitement de DNase et l'extraction d'ARN à l'aide d'un kit d'isolement d'ARN (voir le tableau des matériaux) suivant les instructions du fabricant.

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Résultats

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Des sections coronales des tissus congelés frais de souris à E16.5 ont été employées pour démontrer l'isolement et la collection du cartilage de Meckel (MC), du cartilage condylar, et de l'os mandibulaire par LCM. Les embryons de souris à E16.5 ont été disséqués et incorporés dans des moules cryogéniques avec composé d'OCT. Les échantillons dans les moules ont été rapidement congelés dans un bain de glace sèche et de méthyl-2-butane et stockés à -80 oC.

Pour démontrer la coloration violette de...

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Discussion

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LCM permet l'isolement des populations cellulaires enrichies ou homogènes des tissus hétérogènes. Ses avantages incluent la capture rapide et précise des cellules dans leur contexte in vivo, tandis que les inconvénients potentiels incluent qu'il est long, coûteux, et limité par la nécessité pour l'utilisateur de reconnaître les sous-populations distinctes dans un échantillon spécifié30. Ce protocole fournit des détails de LCM du cartilage embryonnaire de souris et de l'os, soulignant l'ut...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par le National Institute of Dental and Craniofacial Research (R01DE022988) et l'Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (P01HD078233). Les auteurs remercient le Biorepository and Pathology Core pour l'accès à la plate-forme Leica LMD 6500 à l'école de médecine Icahn à Mount Sinai.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2-MéthylbutaneThermoFisher ScientificO3551-4
BioanalyseurAgilentG2939BA
Tube à centrifugerThermoFisher Scientific339653Tubes à centrifuger coniques stériles en polypropylène, 50 mL
Acétate de violet de crésyleSigma-AldrichC5042
CryostatLeica BiosystemsCM3050 S
Essuie-glace ThermoFisherScientific06-666
Moule d’encastrement jetableThermoFisher Scientific1220
Eau distilléeInvitrogen10977-015Éthanol sans DNase/RNase
, absolu (200 proof)ThermoFisher ScientificBP2818Lame
de membrane en verre PEN de qualité biologie moléculaireLeica Microsystems11505158
système LCMLeica Microsystems Leica MicrosystemsLeica LMD6500
Microscope en verreThermoFisher Scientific12-545FP
Lames de microscopeThermoFisher Scientific12-550-15
OCT compoundElectron Microscopy Sciences102094-106
Tube PCR avec capuchon plat, 0,5 mLAxygenPCR-05-CLCM Tubes de
prélèvement Milieu de montage permanentVector LaboratoriesH-5000
Kit d’isolement de l’ARNThermoFisher ScientificKIT0204
Agent de décontamination RNaseSigma-AldrichR2020Agent de décontamination RNase pour le nettoyage des surfaces
XyleneSigma-Aldrich214736

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

Isolation du tissu osseuxColoration au violet de cresylPr servation de l int grit de l ARNTechnique de cryosectionnementProtocole de d shydratation des tissusCartilage de MeckelOs mandibulaire

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