Les épingles à cheveux et les boucles d'ARN peuvent fonctionner comme amorces pour la transcription inverse (RT) en l'absence des amorces séquence-spécifiques, interférant avec l'étude des transcriptions antisense de chevauchement. Nous avons mis au point une technique capable d'identifier l'ARN spécifique aux brins, et nous l'avons utilisée pour étudier la protéine antisens HIV-1 ASP.
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Article de méthode
Détection des transcriptions de l'ARN de type 1 (VIH-1) de protéine antisens (ASP) de détection du virus de l'immunodéficience humaine
Dans cet article
Résumé
Résumé
Dans les rétrovirus, la transcription d'antisense a été décrite dans le type 1 de virus d'immunodéficience humaine (HIV-1) et le virus T-lymphotropic humain 1 (HTLV-1). Dans LE VIH-1, le gène ASP de protéine antisens est situé sur le brin négatif de l'env, dans le cadre de lecture -2, couvrant la jonction gp120/gp41. Dans le sens de l'orientation, la fin de 3' du cadre de lecture ouverte ASP chevauche avec les régions hypervariables gp120 V4 et V5. L'étude de l'ARN ASP a été contrecarrée par un phénomène connu sous le nom de RT-auto-amorçage, par lequel les structures secondaires d'ARN ont la capacité de premier rinçage RT en l'absence de l'amorce spécifique, générant des cDNAs non spécifiques. L'utilisation combinée de la dénaturation à haut ARN avec des amorces inverses biotinylated dans la réaction de RT, avec la purification d'affinité de l'ADNc sur les perles magnétiques streptavidin-enduites, nous a permis d'amplifier sélectivement l'ARN d'ASP dans les cellules De T CD4MD dérivées des individus infectés par HIV-1. Notre méthode est relativement peu coûteuse, simple à exécuter, très fiable et facilement reproductible. À cet égard, il représente un outil puissant pour l'étude de la transcription antisens non seulement dans le VIH-1, mais aussi dans d'autres systèmes biologiques.
Introduction
Le gène de protéine antisens (ASP) est un cadre de lecture ouvert (ORF) situé sur le brin négatif du gène de l'enveloppe du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) (env), couvrant la jonction gp120/gp411. Au cours des 30 dernières années, plusieurs rapports ont montré que le gène DUVIH est en effet transcrit et traduit2,3,4,5,6,7,8,9. Bien que les transcriptions anti....
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Protocole
Cette étude a été approuvée par la Commission d'examen institutionnel du Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV).
1. Infection des cellules mononucléaires sanguines périphériques (PBMC) par soucheHXB2 VIH-1
-
Jour 1: PBMCs STIMULATION
- Isoler les PBMC d'un pelage velauve de donneur sain.
- Compter et resuspendre les PBMC à une concentration de 1x106/mL dans le milieu complet du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine (R-10), avec l'ajout de 50 U/mL d'interleukine-2 (IL-2) et de 3 g/mL ph....
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Résultats
La dénaturation à haute température de l'ARN couplée à la purification d'affinité de l'ADNc biotinylated empêche l'amplification des produits ASP non spécifiques pendant PCR dans les PBMCs infectés in vitro et dans les cellules T CD4MD isolées des patients. RT auto-amorçage a été montré pour se produire lors de la transcription inverse des ARN antisens10,14,15,16,
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Discussion
Dans ce rapport, nous décrivons un essai de RT spécifique au brin appliqué à la détection de l'ARN ASP dans les cellules T CD4MD isolées chez des personnes infectées par le VIH-1. L'occurrence de l'amorçage non spécifique pendant RT entrave la détection des transcriptions d'ARN avec la polarité droite, menant à l'interprétation erronée des résultats. Les groupes précédents ont développé plusieurs stratégies visant à empêcher la synthèse d'ADNc amorce-indépendante pendant la réaction de RT. Le marquage de l'amorce inverse.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu'il n'y a pas de conflitdds d'intérêts.
Remerciements
Nous remercions Patrizia Amelio, Alessandra Noto, Craig Fenwick et Matthieu Perreau d'être toujours disponibles pour discuter de notre travail et de toutes les personnes du Laboratoire d'immunopathogenèse du sida pour leur précieuse assistance technique. Nous tenons également à remercier John et Aaron Weddle de VSB Associated Inc. qui ont contribué avec d'excellentes œuvres d'art. Enfin, un grand merci à tous les patients, sans qui ce travail n'aurait pas été possible. Ces travaux n'ont reçu aucune subvention spécifique d'un organisme de financement.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| BD LSR II | Becton Dickinson | ||
| BigDye Terminator v1.1 Kit de séquençage de cycle | Biosystème appliqué, Thermo Fisher Scientific | 4337450 | |
| dNTP Set (100 mM) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 10297018 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
| EasySep Human CD4+ Lymphocyte T Kit d’isolement | Stemcell Technologies | 19052 | |
| Sérum bovin fœtal | Biowest | S1010-500 | |
| Kit de solution de fixation/perméabilisation | Becton Dickinson | 554714 | |
| HIV Gag p24 anticorps de cytométrie en flux - Kc57-FITC | Beckman Coulter | 6604665 | |
| Human IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-743 | |
| Lectine de Phaseolus vulgaris (PHA) | Sigma-Aldrich | 61764-1MG | |
| LIVE/DEAD Kit de coloration à cellules mortes jaunes fixables, pour excitation à 405 nm | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | L34967 | |
| Souris anti-humaine CD28 | Becton Dickinson | 55725 | |
| Souris anti-humaine CD3 | Becton Dickinson | 55329 | |
| Amorces et sondes | ADN intégré Technologies (IDT) | ||
| Pénicilline-Streptomycine | BioConcept | 4-01F00-H | |
| Platinum Taq ADN polymérase Haute Fidélité | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11304011 | |
| Polybrene Infection / Transfection Réactif | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 | Medium Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 18080044 | |
| TaqMan Gene Expression Master | Mix Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | ||
| Kit de clonage TOPO TA pour le sous-clonage, avec des cellules E. coli chimiquement compétentes One Shot TOP10 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | K450001 | |
| TURBO DNase (2 U/µ ; L) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | AM2238 | |
| Veriti Thermocycleur | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4375786 |
Références
- Miller, R. H. Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand. Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).
- Vanheebrossollet, C., et al. A Natural Antisense ....
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Réimpressions et autorisations
