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Article de méthode

Détection des transcriptions de l'ARN de type 1 (VIH-1) de protéine antisens (ASP) de détection du virus de l'immunodéficience humaine

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DOI :

10.3791/60511

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27 novembre 2019

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1Division of Immunology and Allergy, Lausanne University Hospital, 2Department of Fundamental Neuroscience, University of Lausanne, 3Department of Biochemistry, Erasmus Medical Center, 4Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratories, 5Department of Biochemistry, University of Lausanne

Dans cet article

Résumé

Les épingles à cheveux et les boucles d'ARN peuvent fonctionner comme amorces pour la transcription inverse (RT) en l'absence des amorces séquence-spécifiques, interférant avec l'étude des transcriptions antisense de chevauchement. Nous avons mis au point une technique capable d'identifier l'ARN spécifique aux brins, et nous l'avons utilisée pour étudier la protéine antisens HIV-1 ASP.

Résumé

Dans les rétrovirus, la transcription d'antisense a été décrite dans le type 1 de virus d'immunodéficience humaine (HIV-1) et le virus T-lymphotropic humain 1 (HTLV-1). Dans LE VIH-1, le gène ASP de protéine antisens est situé sur le brin négatif de l'env, dans le cadre de lecture -2, couvrant la jonction gp120/gp41. Dans le sens de l'orientation, la fin de 3' du cadre de lecture ouverte ASP chevauche avec les régions hypervariables gp120 V4 et V5. L'étude de l'ARN ASP a été contrecarrée par un phénomène connu sous le nom de RT-auto-amorçage, par lequel les structures secondaires d'ARN ont la capacité de premier rinçage RT en l'absence de l'amorce spécifique, générant des cDNAs non spécifiques. L'utilisation combinée de la dénaturation à haut ARN avec des amorces inverses biotinylated dans la réaction de RT, avec la purification d'affinité de l'ADNc sur les perles magnétiques streptavidin-enduites, nous a permis d'amplifier sélectivement l'ARN d'ASP dans les cellules De T CD4MD dérivées des individus infectés par HIV-1. Notre méthode est relativement peu coûteuse, simple à exécuter, très fiable et facilement reproductible. À cet égard, il représente un outil puissant pour l'étude de la transcription antisens non seulement dans le VIH-1, mais aussi dans d'autres systèmes biologiques.

Introduction

Le gène de protéine antisens (ASP) est un cadre de lecture ouvert (ORF) situé sur le brin négatif du gène de l'enveloppe du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) (env), couvrant la jonction gp120/gp411. Au cours des 30 dernières années, plusieurs rapports ont montré que le gène DUVIH est en effet transcrit et traduit2,3,4,5,6,7,8,9. Bien que les transcriptions antisense d'ASP aient été entièrement caractérisées in vitro,jusqu'à récemment l'information au sujet de la production réelle de l'ARN d'ASP dans les patients était toujours manquante.

La séquence de l'ASP est inversée et complémentaire à env. Cela représente un obstacle majeur lorsque vous essayez de détecter les transcriptions pour ASP. Les méthodes standard de réaction en chaîne de transcription-polymérase inverse (RT-PCR) utilisent des amorces antisens spécifiques aux gènes pour synthétiser les ANN complémentaires (CDNA) de la polarité droite. Cette approche, cependant, ne permet pas de déterminer l'orientation (sens ou antisens) du modèle initial d'ARN, puisque les épingles à cheveux ou les boucles d'ARN peuvent primer RT dans les deux directions en l'absence des amorces10,un phénomène connu sous le nom d'auto-amorçage de RT. La plupart des chercheurs de l'ASP écartent le problème de l'auto-amorçage de RT à l'aide d'amorces étiquetées avec des séquences qui ne sont pas liées au VIH-111,12. Toutefois, cette stratégie n'élimine pas l'occurrence du phénomène et peut entraîner un report potentiel des ADCD non spécifiques dans le PCR11.

Nous avons récemment mis au point un nouvel essai RT-PCR spécifique au brin pour l'étude de l'ARN antisens et nous l'avons utilisé pour la détection de l'ARN ASP dans une cohorte de six patients infectés par le VIH, comme le montre le tableau 1. La procédure décrite ci-dessous a déjà été publiée par Antonio Mancarella et coll.13. Dans notre protocole, nous évitons la production de CDNA non spécifiques par une double approche. Tout d'abord, nous éliminons les structures secondaires de l'ARN en dénaturant l'ARN à haute température (94 oC), et deuxièmement, nous rincions l'ARN ASP à l'aide d'une amorce spécifique à l'ASP biotinylated et l'affinité purifie l'ADNc résultant. Par cette approche, nous sommes en mesure d'amplifier seulement notre cDNA cible, puisque d'autres produits NON spécifiques de RT sont empêchés d'être générés (dénaturation à haute température de l'ARN) ou éliminés avant PCR (purification d'affinité).

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Protocole

Cette étude a été approuvée par la Commission d'examen institutionnel du Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV).

1. Infection des cellules mononucléaires sanguines périphériques (PBMC) par soucheHXB2 VIH-1

  1. Jour 1: PBMCs STIMULATION
    1. Isoler les PBMC d'un pelage velauve de donneur sain.
    2. Compter et resuspendre les PBMC à une concentration de 1x106/mL dans le milieu complet du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine (R-10), avec l'ajout de 50 U/mL d'interleukine-2 (IL-2) et de 3 g/mL phytomagglutine (PHA).
    3. Pipet de haut en bas et diviser les cellules en deux plaques de six puits (3 ml de suspension cellulaire / puits).
    4. Incuber pendant 3 jours à 37 oC et 5 % de CO2.
  2. Jour 3: PBMCs INFECTION
    REMARQUE : Utilisez l'une des deux plaques comme à l'étape 1.1.3 comme contrôle négatif (ne pas infecter ces cellules).
    CAUTION: Effectuer l'ensemble de la procédure dans un laboratoire de niveau de biosécurité III (P3).
    1. Mettre en commun les PBMC d'une assiette dans un tube de faucon de 50 ml et une centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min.
    2. Jeter le supernatant et resuspendre les cellules dans 2,2 mL de R-10 contenant 20 U/mL d'IL-2 et 2 polybrenes g/mL.
    3. Décongeler les flacons contenant le virusVIH-1 HXB2 et ajouter 1,8 ml de suspension virale (0,376 ng/L) aux cellules.
    4. Incuber les cellules pendant 2 h à 37 oC, en faisant tourbillonner doucement le tube toutes les 30 minutes.
    5. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 10 min.
    6. Jeter le supernatant et resuspendre les cellules à 1x106/mL dans R-10 contenant IL-2 (50 U/mL).
    7. Transférer la suspension cellulaire dans une plaque de 24 puits à une concentration de 1 ml/puits et incuber pendant 5 jours à 37 oC et 5 % de CO2.
    8. Récoltez 1 puits chaque jour et transférez les cellules dans un tube de 1,5 ml (étiqueté le jour de l'infection).
      REMARQUE : Avant la centrifugation, transférer 150 l de suspension cellulaire dans un tube de cytométrie d'écoulement pour le contrôle de la qualité de l'infection par les PBMC (voir l'étape 1.3)
    9. Centrifuger les tubes à 400 x g pendant 10 min et jeter le supernatant.
    10. Congeler les granulés de cellules à -80 oC jusqu'à l'utilisation.
  3. Infection des PBMC : contrôle de la qualité
    1. Pour chaque jour d'infection, collectez 150 L de PBMC infectés et transférez-les dans un tube de cytométrie d'écoulement.
    2. Ajouter 1 ml de saline tamponnée en phosphate (PBS) et centrifugeuse à 400 x g pendant 5 min.
    3. Jeter le supernatant et ajouter 50 OL de PBS contenant 1 l de colorant Aqua vivant/mort (précédemment dilué 1:10 avec PBS).
    4. Incuber à 4 oC pendant 15 min.
    5. Ajouter 1 mL de PBS, centrifugeuse à 400 x g pendant 5 min, et jeter le supernatant.
    6. Ajouter 250 l de solution de fixation/perméabilisation et incuber pendant 20 min à température ambiante dans l'obscurité.
    7. Ajouter 1 ml de 1x Perm/Wash Buffer (10x solution de bouillon contenant à la fois FBS et saponin eillue 1:10) et centrifugeuse à 400 x g pendant 5 min.
    8. Jetez le supernatant et ajoutez 50 L de PBS contenant le VIH Gag p24 isorescéine isothiocyanate (FITC) anticorps conjugués (dilué 1:10).
    9. Incuber pendant 20 min à température ambiante dans l'obscurité.
    10. Ajouter 1 ml de PBS, centrifugeuse à 400 x g pendant 5 min, et jeter le supernatant.
    11. Ajouter 150 l de x CellFIX (10x solution de stock contenant 10% de formaldéhyde, 3,55% de méthanol, 0,93% d'azide de sodium dilué 1:10) et analyser les cellules par cytométrie de flux.

2. Stimulation des lymphocytes T CD4MD humains avec des anticorps anti-CD3/CD28

  1. Isoler les lymphocytes T CD4MD des PBMC des patients infectés par le VIH-1 et des donneurs en bonne santé.
  2. Préparer le mélange humain d'anticorps anti-CD3/CD28 en diluant les anti-CD3 (1:100) et les anti-CD28 (1:50) en PBS.
  3. Enrober une assiette de 48 puits en ajoutant 200 l de mélange d'anticorps par puits à un nombre approprié de puits et incuber à 37 oC pendant 2 h.
  4. Aspirez la solution d'anticorps et ajoutez 1 mL de cellules CD4-T à 1x106/mL aux puits anti-CD3/CD28 enduits d'anticorps.
    REMARQUE : Stimulez les lymphocytes T CD4MD jusqu'à 5 jours.

3. Transcription inversée

REMARQUE : Pour obtenir des amorces spécifiques au patient, l'ADN proviral isolé des cellules CD4-T de chaque patient a été amplifié à l'aide d'amorces DE PNS PanHXB2 VIH-1. Les amorces spécifiques aux patients ont été conçues à l'aide de la séquence provirale interne aux amorces Pan ASP. Toutes les amorces et sondes utilisées dans cette étude sont énumérées dans le tableau 2.

  1. Isoler l'ARN total des cellules
    1. Quantifier l'ARN et éliminer la contamination par l'ADN en traitant les échantillons avec dNase.
    2. Effectuer des réactions de RT dans un volume de 50 L. Transférer 0,1-1 g d'ARN total dans un nombre approprié de puits d'une plaque PCR de 96 puits. Préparer le mélange d'ARN en ajoutant les composants suivants à l'ARN :
      5 L d'amorce inverse ASP biotinylated (20 M)
      2,5 L de triphosphates de désoxynucléotide (dNTP) (10 mM)
      25 ldddadien (DEPC) d'eau distillée traitée par diethylpyrocarbonate (dH2O).
      Préparer les contrôles RT endogènes en ajoutant 5 L d'eau sans nucléane à la place de l'amorce inverse ASP biotinylated.
    3. Placer la plaque DE 96 puits PCR dans un thermocycler et chauffer le mélange d'ARN à 94 oC pendant 5 min.
    4. Refroidir immédiatement le mélange d'ARN dans l'eau glacée pendant au moins 1 min.
    5. Préparer le mélange de réaction en ajoutant les composants suivants à un tube de 1,5 ml (calculer le nombre total d'échantillons plus 1) :
      10 l de tampon DE 5x RT
      2,5 L de 0,1 M de 1,4-dithiothreitol (TNT)
      2,5 L de RNase out (40 unités/L)
      2,5 l d'enzyme RT (200 unités/L)
    6. Transférer 17,5 L de ce mélange dans chacun des puits contenant de l'ARN. Préparer les commandes RT-moins remplaçant la transcriptase inverse par 2,5 L d'eau sans nucléane.
    7. Mélanger délicatement et incuber la plaque à 55 oC pendant 60 min à l'aide d'un thermocycleur.
    8. Inactiver les réactions en chauffant à 70 oC pendant 15 min.

4. Purification d'affinité de l'ADNc biotinylated ASP

REMARQUE : Ne purifie pas les réactions RT-moins.

  1. Préparer 1 L de 2x tampon de lavage/liaison contenant 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM d'acide éthylènediaminetetraacetic (EDTA) et 2 M NaCl. Filtrer la solution.
    1. Préparer 50 ml de tampon de lavage/liaison 1x à l'aide d'eau de qualité PCR.
    2. Pour chaque réaction, utilisez 10 L de perles magnétiques conjuguées à la streptavidine. Sur la base du nombre de réactions, transférer un volume approprié de perles dans un tube de 1,5 ml.
    3. Laver les perles en ajoutant un volume égal de 2x tampon de lavage/ de liaison et de vortex pendant 15 s.
    4. Placer le tube dans un support de séparation magnétique et couver pendant 3 minutes à température ambiante.
    5. Retirez soigneusement le supernatant sans déranger les perles et ajoutez le même volume de tampon 2x de lavage/liaison que le volume initial de perles.
    6. Vortex pour 30 s et transférer 10 l de la suspension de perles à un nombre approprié de tubes de 1,5 ml.
    7. Placer les tubes dans un support de séparation magnétique et couver pendant 3 min à température ambiante.
    8. Jeter le supernatant et ajouter 50 l de tampon de lavage/liaison 2x.
    9. Ajouter 50 L d'ADNc biotinylated aux tubes correspondants contenant les perles.
    10. Incuber pendant 30 min à température ambiante en tournant doucement.
    11. Séparer les perles du supernatant par un support de séparation d'aimant pendant 3 min à température ambiante.
    12. Laver les perles en ajoutant 200 ll de 1x tampon de lavage/liaison. Placer les tubes dans un support de séparation de l'aimant pendant 3 min à température ambiante et jeter le supernatant. Répétez deux fois.
    13. Resuspendre les perles dans 10 L d'eau de qualité PCR.

5. PCR standard

REMARQUE : Le but du PCR standard est d'amplifier l'ensemble de l'ORF du gène ASP. Les produits d'amplification sont ensuite clonés en plasmide pCR2.1 pour développer des courbes standard pour la quantification de l'ARN ASP par PCR en temps réel (voir le paragraphe PCR en temps réel).

  1. Effectuez des PCR standard dans un volume total de 50 L. Préparer un volume approprié de mix principal PCR (nombre d'échantillons plus 1). Pour chaque échantillon, ajouter les composants suivants à un tube de 1,5 ml :
    1 L de 10 amorces ASP M (avant et inverse)
    1 L de 10 mL dNTP
    Chlorure de magnésium (MgCl2) (la concentration dépend des amorces utilisées)
    dH2O à un volume final de 49 L
    1. Bien mélanger, faire tourner rapidement le contenu et transférer 49 L/puits du mix PCR master sur une plaque PCR de 96 puits.
    2. Vortex soigneusement les tubes contenant les perles utilisées pour la purification d'affinité ASP cDNA pour 15 s.
    3. Ajouter 1 l de perles dans les puits correspondants et exécuter le PCR en utilisant le programme suivant : 95 oC pendant 2 min, 40 cycles de 95 oC pour 30 s, 55 oC pour 30 s et 68 oC pour 40 s, puis 68 oC pour 7 min.
    4. Séparez les produits PCR sur le gel agarose à 1 %, coupez les bandes et clonez les produits amplifiés en plasmide pCR2.1.
    5. Séquenceetetet et analyse des séquences de chaque clone.

6. PCR quantitatif en temps réel (qPCR)

REMARQUE : Développer des amorces et des sondes spécifiques au patient à l'aide de l'approche décrite à l'étape 3 « Transcription inversée ». Pour qPCR inclure ASP dilutions plasmide pour les courbes standard. Les plasmides contenant des inserts spécifiques au patient sont développés comme mentionné dans la note au début de l'étape 5 « PCR standard ».

  1. Préparer la courbe standard à l'aide de 1:10 ASP plasmides dilutions série à partir de 3 x 106 copies / L jusqu'à 3 copies / L.
    1. Premier tour PCR (pré-ampli). Effectuer des réactions dans un volume total de 25 L. Préparer un volume approprié de mix principal PCR (nombre d'échantillons plus 1). Pour chaque échantillon, ajouter les composants suivants à un tube de 1,5 ml :
      0,5 L de mélange d'APA ou d'env (concentration finale de 0,2 M chacun) (avant et revers)
      0,5 l de mélange de dNTP (concentration finale de 0,2 mM chacun)
      MgCl2 (la concentration dépend des paires d'amorces)
      dH2O à un volume final de 24 L
    2. Transférer 24 L de mélange maître PCR à un nombre approprié de puits d'une plaque PCR de 96 puits.
    3. Vortex soigneusement les tubes contenant les perles avec l'ADNc pendant 15 s.
    4. Ajouter 1 l de perles aux puits correspondants. Faites de même pour les dilutions plasmides.
    5. Exécuter le PCR à l'aide de l'algorithme suivant : dénaturation pendant 2 min à 95 oC ; 30 s à 95 oC, 30 s à 55 oC, 40 s à 68 oC pendant 18 cycles; extension à 68 oC pendant 7 min.
    6. Diluer les réactions pcR premier tour 1:5 avec l'eau de qualité PCR.
    7. Deuxième tour qPCR. Effectuer des réactions dans un volume total de 20 L. Préparer un volume approprié de mix principal PCR (nombre d'échantillons plus 1). Pour chaque échantillon, ajouter les composants suivants à un tube de 1,5 ml :
      1,8 L 10 M amorces (avant et revers)
      1 l de sonde de 5 M
      6,2 l de dH2O
    8. Transférer 19 l de mélange de maître qPCR dans un nombre approprié de puits d'une plaque qPCR de 96 puits et ajouter 1 L des réactions PCR diluées du premier tour aux puits correspondants. Faites de même pour les dilutions plasmides.
    9. Exécuter le qPCR avec l'algorithme suivant : dénaturation pendant 10 min à 95 oC; 15 s à 95 oC, 1 min à 60 oC pendant 40 cycles.

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Résultats

La dénaturation à haute température de l'ARN couplée à la purification d'affinité de l'ADNc biotinylated empêche l'amplification des produits ASP non spécifiques pendant PCR dans les PBMCs infectés in vitro et dans les cellules T CD4MD isolées des patients. RT auto-amorçage a été montré pour se produire lors de la transcription inverse des ARN antisens10,14,15,16,

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Discussion

Dans ce rapport, nous décrivons un essai de RT spécifique au brin appliqué à la détection de l'ARN ASP dans les cellules T CD4MD isolées chez des personnes infectées par le VIH-1. L'occurrence de l'amorçage non spécifique pendant RT entrave la détection des transcriptions d'ARN avec la polarité droite, menant à l'interprétation erronée des résultats. Les groupes précédents ont développé plusieurs stratégies visant à empêcher la synthèse d'ADNc amorce-indépendante pendant la réaction de RT. Le marquage de l'amorce inverse...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'il n'y a pas de conflitdds d'intérêts.

Remerciements

Nous remercions Patrizia Amelio, Alessandra Noto, Craig Fenwick et Matthieu Perreau d'être toujours disponibles pour discuter de notre travail et de toutes les personnes du Laboratoire d'immunopathogenèse du sida pour leur précieuse assistance technique. Nous tenons également à remercier John et Aaron Weddle de VSB Associated Inc. qui ont contribué avec d'excellentes œuvres d'art. Enfin, un grand merci à tous les patients, sans qui ce travail n'aurait pas été possible. Ces travaux n'ont reçu aucune subvention spécifique d'un organisme de financement.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
BD LSR IIBecton Dickinson
BigDye Terminator v1.1 Kit de séquençage de cycleBiosystème appliqué, Thermo Fisher Scientific4337450
dNTP Set (100 mM)Invitrogen, Thermo Fisher Scientific10297018
Dynabeads M-280 StreptavidinInvitrogen, Thermo Fisher Scientific11205D
EasySep Human CD4+ Lymphocyte T Kit d’isolementStemcell Technologies19052
Sérum bovin fœtalBiowestS1010-500
Kit de solution de fixation/perméabilisationBecton Dickinson554714
HIV Gag p24 anticorps de cytométrie en flux - Kc57-FITCBeckman Coulter6604665
Human IL-2Miltenyi Biotec130-097-743
Lectine de Phaseolus vulgaris (PHA)Sigma-Aldrich61764-1MG
LIVE/DEAD Kit de coloration à cellules mortes jaunes fixables, pour excitation à 405 nmInvitrogen, Thermo Fisher ScientificL34967
Souris anti-humaine CD28Becton Dickinson55725
Souris anti-humaine CD3Becton Dickinson55329
Amorces et sondesADN intégré Technologies (IDT)
Pénicilline-StreptomycineBioConcept4-01F00-H
Platinum Taq ADN polymérase Haute FidélitéInvitrogen, Thermo Fisher Scientific11304011
Polybrene Infection / Transfection RéactifSigma-AldrichTR-1003-G
RNeasy Mini KitQiagen74104
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640Medium Gibco, Thermo Fisher Scientific11875093
StepOnePlus Real-Time PCR SystemApplied Biosystem, Thermo Fisher Scientific4376600
SuperScript III Reverse TranscriptaseInvitrogen, Thermo Fisher Scientific18080044
TaqMan Gene Expression MasterMix Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific
Kit de clonage TOPO TA pour le sous-clonage, avec des cellules E. coli chimiquement compétentes One Shot TOP10Invitrogen, Thermo Fisher ScientificK450001
TURBO DNase (2 U/µ ; L)Invitrogen, Thermo Fisher ScientificAM2238
Veriti ThermocycleurApplied Biosystem, Thermo Fisher Scientific4375786
4369016

Références

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Amorces biotinyl esd naturation de l ARNbilles magn tiques de streptavidined tection de l ARN ASPlymphocytes T CD4pr vention de l ADNc non sp cifiqueanalyse par qPCRlectrophor se sur gel
Détection des transcriptions de l'ARN de type 1 (VIH-1) de protéine antisens (ASP) de détection du virus de l'immunodéficience humaine
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