Caractérisation fonctionnelle des ligases d'ubiquitine RING-Type E3 In Vitro et In Planta

La grande majorité des ligases d'ubiquitine E3 appartiennent à RING (Really Interesting New Gene) -type protéines. Le domaine RING-doigt a été identifié à l'origine par Freemont et al. ¹ et fonctionnellement décrit comme un domaine de médiation des protéines-protéines interaction². Le doigt canonique RING est un type spécial de domaine de coordination du zinc défini comme une séquence consensuelle de huit Cys conservés (C) et Son (H) spécifiquement espacé par d'autres résidus d'acides aminés (X), C-X₂-C-X_9-39-C-X_1-3-H-X_2-3-C/H-X₂-C-X_4-48-C-X₂-C. Deux ions Zn^{2 sont} stabilisés par les résidus cœur C et H grâce à une topologie unique « cross-brace » avec C₁/C₂ et C/H₅/C₆ coordonnant le premier ion Zn^2, tandis que C₃/H₄ et C₇/C₈ lient la seconde (Figure 1A)^3,4. Selon la présence de C ou de H dans le cinquième site de coordination Zn^2,deux sous-classes canoniques de protéines RING-doigt ont été définies : C3HC4 et C3H2C3 (RING-HC et RING-H2, respectivement). Parce que le domaine RING de l'E3 ubiquitine ligase médiateur de l'interaction entre les enzymes et les substrats conjugués E2, la mutation de ces résidus essentiels C et H a été montré pour perturber l'activité ligase⁵. Cinq autres sous-classes moins courantes de ligases RING E3 ont été décrites (RING-v, RING-C2, RING-D, RING-S/T et RING-G)⁶. Les ligases d'ubiquitine E3 de type RING peuvent être subdivisées en enzymes E3 simples et complexes. Les simples ligases RING E3 de sous-unité unique contiennent à la fois le site de reconnaissance du substrat et le domaine RING reliure E2. En revanche, le complexe E3 multisubunit de type RING est soit le substrat de la recrue, soit la liaison intermédiaire e2-ubiquitin au complexe E3. Le domaine RING Lys résidus (s) qui sert de site d'attachement ubiquitine primaire (s) pour l'auto-ubiquitination pourrait également être important pour l'activité de ligase E3.

Toutes les protéines contenant du RING ne fonctionnent pas comme des ligases E3. Ainsi, la prédiction bioinformatique du domaine RING-doigt et la capacité d'ubiquitination des protéines dépendantes de l'E2 doivent être validées biochimiquement et liées au rôle biologique de la protéine testée. Ici, nous décrivons un protocole étape par étape décrivant comment détecter et caractériser fonctionnellement l'activité enzymatique des ligases d'ubiquitine E3 de type RING, in vitro et dans le planta, par une approche mutagenesis dirigée par le site. Les résultats représentatifs de ce pipeline sont indiqués pour le RHA1B de ligase E3 de type RING. RHA1B est une protéine effectrice produite par le nématode de kyste parasite des plantes Globodera pallida pour supprimer l'immunité des plantes et manipuler la morphologie des cellules racinaires végétales. Pour se protéger contre l'invasion d'agents pathogènes/parasites, les plantes ont évolué dans le domaine liant les nucléotides et les récepteurs immunitaires de type répéter riche en leucine (NB-LRR) qui détectent la présence d'un agent pathogène ou d'un parasite et, par conséquent, développent la réponse hypersensible (HR), qui est une forme de mort cellulaire rapide et localisée sur le site de l'infection pour arrêter la colonisation des agents pathogènes. L'un de ces récepteurs immunitaires est la protéine Gpa2 de la pomme de terre qui confère une résistance à certains isolats de G. pallida (populations de champ D383 et D372)⁷.

En utilisant les protocoles présentés, il a été récemment constaté que RHA1B interfère avec la signalisation immunitaire des plantes d'une manière E3-dépendante en ciblant la plante Gpa2 immunorécepteur pour l'ubiquitination et la dégradation⁸.

1. Mutagénèse dirigée par le site (Figure 1)

1. Identifier les Cys et ses acides aminés conservés dans le domaine RING (Figure 1A) et concevoir des amorces portant le codon de substitution d'intérêt flanqué de 15 paires de base de chaque côté du site de mutation (Figure 1B).
2. Introduire la mutation souhaitée par l'amplification à base de PCR du plasmide hébergeant le gène d'intérêt à l'aide d'amorces mutagènes et de polymérase d'ADN haute fidélité contenant du Pfu dans 50 'L du volume total de réaction PCR comme indiqué dans le tableau 1 et le tableau 2 selon le protocole du fabricant.
3. Diger l'Escherichia coli-dérivéparent méthylé et semi-méthylé de l'ADN en ajoutant 3 L d'enzyme de restriction DpnI directement à la réaction PCR (étape 1.2) et l'incubation à 37 oC pendant 2 h.
   REMARQUE : La méthylation est une modification de protéine posttranscriptional qui est ajoutée au plasmide produit et isolée des bactéries. Les nouvelles copies de plasmide PCR-généré s'absenter ont, par conséquent, les nouvelles copies resteront intactes pendant le traitement de DpnI.
4. Purifez les plasmides mutagérisés à l'aide d'un kit commercial d'extraction d'ADN basé sur la technologie des colonnes de spin et élichez l'ADN avec 50 l'eau.
5. Transformez les cellules chimiquement compétentes de DH5MD E. coli avec 0,5 L de l'ADN plasmide mutagérisé récupéré selon le protocole du fabricant. En bref, incuber des cellules compétentes avec de l'ADN sur la glace pendant 30 min, puis les choquer à la chaleur pendant 20 s à 42 oC, et placer les tubes à nouveau sur la glace pendant 2 min. Incubate les cellules avec 500 l de bac LB à 37 oC pour 1 h à 250 tr/min, puis les étalez sur des pâtés sélectifs.
6. Vérifier la mutation souhaitée par le séquençage de Sanger des plasmides d'ADN isolés de E. coli.

2. Purification recombinante des protéines et ubiquitination in vitro

1. Cloner le type sauvage RING et les gènes RING mutés d'intérêt dans le vecteur pMAL-c2 (suivez le protocole du fabricant; Tableau 3) pour fusionner ces gènes avec l'étiquette d'épitope MBP qui permet une purification en une seule étape à l'aide de résine d'amylose. Introduire les constructions résultantes dans la souche E. coli BL21 décrite à l'étape 1.5.
2. Cultivez la souche E. coli BL21 abritant la construction désirée dans un milieu liquide lb de 50 ml à 37 oC pendant 2 à 3 h jusqu'à ce qu'elle atteigne la phase logarithmique (OD₆₀₀ de 0,4 à 0,6).
3. Ajoutez iPTG à une concentration finale de 0,1 à 1 mM pour induire l'expression d'une protéine recombinante étiquetée MBP d'intérêt et incuber la culture E. coli pendant 2 à 3 h à 28 oC. Placer la culture sur la glace après l'incubation.
   REMARQUE : Effectuez des étapes 2.4-2.13 sur la glace pour protéger les protéines contre la dégradation.
4. Pour vérifier l'efficacité de l'induction, recueillir 1,5 ml de cellules induites, les faire tourner vers le bas à 13 000 x g pendant 2 min, retirer le supernatant et resuspendre les cellules en 20 l de 2 x SDS-PAGE (24 mM Tris-HCl pH 6,8, 0,8 % SDS, 10 % (v/v) glycérol, 4 mM DTT, 0,04 % (w/v) bromopheno bluel).
5. Faire bouillir les échantillons pendant 5 min et les faire fonctionner sur un gel SDS-PAGE de 10 %. Pour évaluer visuellement l'accumulation de protéines MBP-fusion (poids moléculaire de la protéine d'intérêt - 42,5 kDa MBP), tacher le gel pendant 20 min en agitant avec le tampon de coloration DeCoomassie (50% de méthanol, 10% d'acide acétique, 0,1% de bleu Coomassie) et en se desatteignant du jour au lendemain avec tampon de détacité (20% de méthanol, 10% d'acide acétique).
6. Récoltez les cellules E. coli restantes par centrifugation à 1 350 x g pendant 6 min, jetez le supernatant et suspendez la pastille cellulaire avec 5 ml de tampon de colonne (20 mM Tris HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, inhibiteur de la protéase bactérienne).
   REMARQUE: C'est un bon endroit pour arrêter le protocole pendant la nuit. Les cellules congelées peuvent être stockées jusqu'à 1 semaine à -20 oC.
7. Décomposez les cellules E. coli en plaçant le tube contenant les bactéries dans un bain d'eau glacée et en appliquant 10 cycles de sonication : 10 s sonication à 30% d'ampli suivi de 20 s pauses.
8. Échantillon de centrifugeuse à 13 000 x g à 4 oC pendant 10 min et enregistrer le supernatant (extrait brut).
9. Préparer 500 l de résine d'amylose dans un tube de 15 ml. Laver la résine en ajoutant 10 ml de tampon de colonne froide et en centrifuge à 1 800 x g, 4 oC pendant 5 min. Faites-le 2x.
10. Ajouter 5 ml d'extrait de brut dans le tube avec la résine d'amylose et incuber toute la nuit à 4 oC.
11. Centrifugeuse à 1 800 x g à 4 oC pendant 5 min et jetez le supernatant.
12. Ajouter 10 ml de tampon de colonne à la granule de résine et couver pendant 20 min. Puis centrifugeuse à 1 800 x g à 4 oC pendant 5 min. Répétez cette étape 2x.
13. Éluter la protéine de fusion avec 0,5 ml de tampon de colonne contenant 10 mM de maltose en couve un échantillon pendant 2 h à 4 oC. Centrifugeuse à 1 800 x g à 4 oC pendant 5 min et recueillir la protéine élucée. Répétez cette étape 2x.
14. Dialyser 1 ml de la fraction protéique contre le PBS froid. Protéine Aliquot en tubes à usage unique (10 à 20 l) pour éviter le gel-dégel et stocker à -80 oC jusqu'à ce que nécessaire.
15. Mesurer la concentration protéique à l'aide de l'assay^{Bradford 9}.
16. Configurez la réaction d'ubiquitination in vitro dans un volume total de 30 L en mélangeant 40 ng d'E1 (p. ex. AtUBA1), 100 ng d'E2 (p. ex., AtUBC8, SlUBC1/4/6/7/12/13/17/20/22/27/32), 1 g de protéine de type MBP,et 2 g FLAG-Ub (ou HA-Ub) dans le tampon d'ubiquitination (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 2 mM ATP, 5 mM MgCl₂, 30 mM de phosphate de créatine, 50 g/mL de phosphokinase créatine). Incuber le mélange à 30 oC pendant 2 h.
    REMARQUE : Préfaites 20x tampon d'ubiquitination et stockez-le jusqu'à 6 mois à -20 oC dans de petits aliquots pour un usage unique. La créatine phosphokinase perd facilement son activité enzymatique lorsque le tampon est décongelé et congelé à plusieurs reprises.
17. Terminez la réaction en mélangeant les échantillons de 30 l avec 7,5 l de tampon de chargement SDS-PAGE 5x (60 mM Tris-HCl pH 6,8, 2 % SDS, 25 % (v/v) glycérol, 10 mM DTT, 0,1 % (w/v) bleu bromenol de phénophilol) et ébullition pendant 5 min.
18. Séparez les protéines avec 7,5% D'électrophoresis de gel SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE), puis transférez-les sur la membrane PDVF, et détectez l'ubiquitination par le ballonnement occidental à l'aide de l'anti-FLAG (ou anti-HA).
19. Tainer la membrane PVDF avec le bleu Coomassie pour vérifier le chargement égal de la protéine testée de type MBP-RING.

3. Agrobacterium-expression de protéine transitoire médiée dans les feuilles de Nicotiana benthamiana et dans l'évaluation d'ubiquitination de planta

1. Stries appropriées Agrobacterium tumefaciens souches portant le gène d'intérêt épitope-marqué (par exemple, HA-RHA1B, HA-RHA1B^C135S, HA-RHA1B^K146R, HA-Ub) et vecteur vide comme un contrôle sur le milieu LB contenant les antibiotiques de sélection appropriés.
2. Après 2 jours de croissance à 28 oC, prenez des colonies simples et cultivez-les dans le milieu liquide LB avec les antibiotiques appropriés à 28 oC/250 tr/h pendant 24 h.
3. Transférer 100 l de culture agrobactérienne à 3 ml de LB frais avec les antibiotiques appropriés et incuber la culture pendant 4 à 6 h supplémentaires à 28 oC avec rotation (250 tr/min) jusqu'à la phase de croissance exponentielle tardive.
4. Faire tourner les cellules agrobactériennes à 1 800 x g pendant 6 min, jeter le supernatant et resuspendre les cellules avec 3 ml de tampon de lavage (50 mM MES pH 5,6, 28 mM de glucose, 2 mM NaH₂PO₄). Répétez cette étape 2x.
5. Après le deuxième lavage, resuspendre les cellules dans le tampon d'induction (50 mM MES pH 5,6, 28 mM de glucose, 2 mM NaH₂PO_4, 200 M acetosyringone, 37 mM NH₄Cl, 5 mM MgSO₄.7H₂O, 4 mM KCl, 18 MM FeSO₄.7H₂O, 2 mM CaCl₂). Incuber les cellules avec un tampon d'induction pendant 10 à 12 h supplémentaires à 28 oC.
   REMARQUE : L'acétosyringone induit le transfert de T-ADN.
6. Centrifuger les cellules à 1 800 x g pendant 6 min, jeter le supernatant et resuspendre les cellules avec 2 ml de tampon d'infiltration (10 mM MES pH 5,5, 200 m acetosyringone).
   REMARQUE : Si les agrobactéries s'agrégent après l'incubation avec un tampon d'induction, laissez les cellules agrégées s'enfoncer au fond du tube en le laissant sur le banc pendant quelques minutes, et transférez la suspension Claire d'Agrobacterium dans un nouveau tube avant de procéder à l'étape 3.6.
7. Mesurer la concentration de bactéries à l'aide de la valeur OD₆₀₀ (la densité optique à l'absorption de 600 nm). Ajustez les valeurs OD₆₀₀ aux valeurs souhaitées.
   REMARQUE : Habituellement, une valeur OD₆₀₀ entre 0,2 et 0,4 fonctionne mieux pour une seule expression de tache agrobactérienne. Si une combinaison de différentes souches agrobactériennes est appliquée, les valeurs totales oD₆₀₀ des souches agrobactériennes ne doivent pas dépasser 1.
8. Agroindin 4-week-old N. bethamiana leaves by gently pricking them with a needle, followed by hand-injecting Agrobacterium with a syringe without the needle. Encerclez la zone infiltrée de la feuille avec le marqueur (habituellement 1 à 2 cm de diamètre).
9. Recueillir les tissus foliaires infiltrés 36 h après l'infiltration. Broyer le tissu en poudre fine avec de l'azote liquide.
10. Poudre de tissu rechargée avec 300 l de tampon d'extraction de protéines (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 10% glycérol, 1% polyvinylpolypyrrolidone, 1 mM PMSF, cocktail inhibiteur de la protéase végétale) et centrifugeuse à 15 000 x g pendant 15 min à 4 oC.
11. Transférer le supernatant dans un nouveau tube. Ajouter 5x tampon de chargement SDS-PAGE à une concentration finale de 1x et faire bouillir pendant 5 min.
12. Séparer les protéines brutes sur les gels SDS-PAGE de 10 %, les transférer sur les membranes PVDF et sonder les anti-HA pour détecter l'ubiquitination planta.

4. Établir le lien entre l'activité enzymatique et la fonction dans les planta

REMARQUE : Par exemple, RHA1B favorise la dégradation de la protéine résistante Gpa2 pour supprimer la mort des cellules HR. Cette étape montre comment vérifier que ces activités virulentes de RHA1B sont e3-dépendants.

1. Streak approprié Agrobacterium tumefaciens souches portant des gènes marqués d'intérêt (dans cet exemple HA-RHA1B, HA-RHA1B^C135S, HA-RHA1B^K146R, myc-Gpa2, RBP1) et vecteur vide comme un contrôle. Suivez les étapes 3.1-3.8 pour la préparation et l'injection d'Agrobacterium sur les feuilles de N. bethamiana.
2. Pour la dégradation des protéines du substrat dépendante de l'E3, suivez les étapes 3.9-3.12 et effectuez le ballonnement occidental à l'aide d'anticorps appropriés pour détecter l'accumulation de protéines dans les cellules végétales (p. ex., anti-HA et anti-MYC).
3. Pour l'inhibition de la mort cellulaire par médiation de la réponse hypersensible dépendante de l'E3 (HR), surveillez les feuilles infiltrées pour les symptômes de mort des cellules HR 2 à 4 jours après l'infiltration.

Dans cette section, les résultats représentatifs sont fournis pour le protocole utilisé pour l'examen d'une seule sous-unité E3 ubiquitin ligase RHA1B qui a un domaine de type RING-H2 PROSITE-prévu (132-176 acides aminés)10. Comme le montre la figure 1, afin d'obtenir une protéine mutante déficiente e3, au moins l'un des huit C ou H conservés dans le domaine RING (Figure 1A) doit être mutagé (Figure 1B). Ainsi, dans un premier temps, deux versions mutantes de RHA1B, RHA1BC135S (une substitution de Cys par Ser dans le C3 conservé du domaine RING) et RHA1BK146R (une substitution de Lys par Arg dans le seul Lys présent dans RHA1B) ont été générées. Bien que les ligases E3 de subunit unique mediate ubiquitin transfert de l'ubiquitine hébergeant E2 au substrat plutôt que d'interagir directement avec l'ubiquiitin, l'auto-ubiquitination de l'E3 à Lys pourrait être nécessaire pour son activité enzymatique maximale.

Les résultats de l'analyse de l'Ouest dans la figure 2A montrent un résultat typique positif d'analyse d'ubiquitination in vitro, avec un frottis multibande commençant au poids moléculaire de la protéine testée (par exemple, MPB-fused RHA1B '100 kDa) et progressant vers le haut. L'anticorps anti-HA a reconnu l'Ub étiqueté HA incorporé dans la chaîne de poly-ubiquitination de différentes longueurs, créant ce frottis typique ubiquitine-associé à l'échelle-comme. Pour valider les résultats positifs, la figure 2A présente également tous les contrôles négatifs importants manquant des composants individuels (E1, E2, Ub ou MBP-RHA1B) ou utilisant MBP comme contrôle et manquant du signal d'ubiquitination barbouillé. En outre, la coloration bleue de Coomassie de la membrane PVDF a montré la charge égale de MBP-RHA1B ou De MBP dans tous les contrôles.

La figure 2B montre comment les résultats de l'ubiquitination in vitro variaient selon la combinaison E2/E3 spécifique. Dans cet exemple, 11 E2 différents représentant 10 familles E2 différentes ont été testés. L'activité d'ubiquitination détectée s'est étendue de l'absence de signal (pas de frottis) à un frottis multibande à partir de différents poids moléculaires, ce qui indique différents modèles d'ubiquitination.

La figure 3 montre les résultats de l'analyse de l'ubiquitination pour les versions RING et K-mutant de protéines testées. Le manque d'activité enzymatique pour RHA1BC135S est étayé par son incapacité soit à générer un frottis multibandein (Figure 3A) ou à promouvoir le signal de poly-ubiquitination dans planta (Figure 3B). Il est à noter que la surexpression de l'Ub en planta étiqueté ha sur son propre a donné l'ubiquitination de niveau basal dans tous les échantillons testés, y compris la commande vectorielle, contrairement au signal d'ubiquitination fort conféré par l'activité enzymatique de type sauvage RHA1B. En outre, l'analyse sur le mutant RHA1BK146R suggère que le résidu K146 est également essentiel pour l'activité E3 de RHA1B. Bien qu'un signal marginal d'auto-ubiquitination ait été détecté in vitro (figure 3A), l'analyse in planta a déterminé que le mutant est E3-déficient(figure 3B, seul signal d'ubiquitination de fond détecté).

Après avoir généré et validé biochimiquement le mutant Déficient E3, des études fonctionnelles peuvent être conçues pour déterminer le rôle biologique e3 associé à la ligase d'ubiquitine RING E3 testée. Dans le cas de RHA1B, cet effecteur de nématode supprime la signalisation immunitaire de plante, comme manifesté par la suppression de la mort de cellule DE RH Gpa2-déclenchée. Comme présenté dans la figure 4A, contrairement au type sauvage RHA1B, le mutant RHA1BC135S manquant d'activité de ligase E3 n'a pas interféré avec la mort des cellules RH. Étant donné que le résultat le plus commun de l'ubiquitination des protéines est sa dégradation protéasome-négociée, les mutations résidant dans le domaine RING peuvent également être utilisées pour vérifier une capacité E3-dépendante de déclencher la dégradation de leurs substrats directs et/ou indirects. Ainsi, de façon significative, les résultats de l'ouest de la figure 4B confirment que le Gpa2 ne s'est pas accumulé en présence de type sauvage RHA1B, mais le RHA1BC135S n'a eu aucun impact sur la stabilité des protéines Gpa2.

Figure 1 : Représentation schématique du principe et des étapes de la mutagénèse dirigée par le site. (A) Domaine RING-CH/H2 avec Cys conservés et ses acides aminés mis en évidence. (B) Un exemple de conception d'amorces mutagènes. (C) Étapes de la mutagénèse dirigée par le site. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Exemple d'ubiquitination in vitro représentatif. (A) Le gel supérieur montre l'exemple d'ubiquitination, y compris tous les contrôles négatifs, et le gel inférieur montre une charge égale. (B) La gamme des résultats attendus en fonction des enzymes E2. Ce chiffre a été modifié à partir de Kud et al8. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Résultats d'analyse d'ubiquitination pour les mutants RING et K (RHA1BC135S et RHA1BK146R). (A) Résultats d'ubiquitination in vitro pour RHA1BC135S et RHA1BK146R. (B) Dans les résultats d'analyse d'ubiquitination planta pour RHA1BC135S et RHA1BK146R. Ce chiffre a été modifié à partir de Kud et al8. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Étude fonctionnelle représentative pour les fonctions biologiques dépendantes de l'E3. Un exemple d'études fonctionnelles montrant la fonction biologique E3-dépendante. (A) E3-dépendant suppression de la mort cellulaire HR et (B) dégradation d'une plante immunorécepteur Gpa2. Ce chiffre a été modifié à partir de Kud et al8. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Tableau 1 : Mise en place de la réaction PCR

Tableau 2 : Programme de thermocycler PCR

Tableau 3 : Réaction de ligation mise en place pour l'exemple RHA1B.

Les auteurs n'ont rien à révéler.