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Article de méthode

Fusion cellulaire du génome Lignes cellulaires modifiées pour la perturbation de la structure et de la fonction cellulaires

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DOI :

10.3791/60550

⸱

7 décembre 2019

 , 
1Photonics Group, Department of Physics, Imperial College London, 2The Medical Research Council Cancer Unit, Hutchison/MRC Research Centre, Cambridge Biomedical Campus, University of Cambridge, 3Cambridge Institute for Medical Research, Cambridge Biomedical Campus, University of Cambridge

Dans cet article

Résumé

Le but de ce protocole est de fusionner deux types de cellules différents pour créer des cellules hybrides. L'analyse de microscopie de fluorescence des cellules fusionnées est employée pour suivre la cellule d'origine des organites cellulaires. Cet analyse peut être utilisé pour explorer comment la structure cellulaire et la fonction réagissent à la perturbation par fusion cellulaire.

Résumé

La vie est spatialement cloisonnée dans les membranes lipidiques pour permettre la formation isolée d'états moléculaires distincts à l'intérieur des cellules et des organites. La fusion cellulaire est la fusion de deux cellules ou plus pour former une seule cellule. Ici, nous fournissons un protocole pour la fusion cellulaire de deux types de cellules différentes. Les cellules hybrides futilisées sont enrichies par le tri à base de cytométrie de flux, suivi de la microscopie de fluorescence de la structure et de la fonction des cellules hybrides. Les protéines étiquetées fluorescentes générées par l'édition du génome sont représentées à l'intérieur de cellules fusionnées, ce qui permet d'identifier les structures cellulaires en fonction de l'émission de fluorescence et de les référencer au type d'origine cellulaire. Cette méthode robuste et générale peut être appliquée à différents types de cellules ou organites d'intérêt, pour comprendre la structure cellulaire et la fonction à travers une gamme de questions biologiques fondamentales.

Introduction

L'entretien homéostatique de la structure cellulaire est essentiel à la vie. Les cellules ont des morphologies caractéristiques, des nombres d'organites sous-cellulaires et une composition biochimique interne. Comprendre comment ces propriétés fondamentales sont générées et comment elles tournent mal pendant la maladie nécessite des outils de laboratoire pour les perturber.

La fusion cellulaire est la fusion de deux ou plusieurs cellules distinctes. La fusion cellulaire peut avoir été essentielle à l'émergence de la vie eucaryote1. Dans le corps humain, la fusion cellulaire est relativement rare, se produisant pendant les circonstances de développement restreintes et les types de tissu, tels que pendant la fécondation ou la formation du muscle, de l'os et du placenta2. Ce protocole décrit l'induction de la fusion cellule-cellule dans les lignées cellulaires de culture de tissu avec les organites fluorescents différentiellement, comme outil pour comprendre les mécanismes contrôlant la structure et la fonction de cellules.

La fusion cellulaire induite in vitro est au cœur de la production d'anticorps monoclonaux3, un outil important pour la recherche biologique et le traitement des maladies. La fusion cellulaire a également été utilisée pour poser de nombreuses questions biologiques fondamentales différentes sur la dominance du cycle cellulaire4, aneuploidy5,6, reprogrammation cellulaire7,8, la réparation des neurones endommagés9, prolifération virale10, apoptose11, tumorigenesis12, dynamique cytosquelettique13, et fusion membranaire14,15. Méthodes basées en laboratoire pour induire la fusion cellule-cellule16,17,18,19 induire la coalescence de membrane lipidique par la fusion physique de deux bicouches en un seul. La fusion cellulaire peut être induite par l'électricité18, les méthodes virales17, chauffage thermoplasmonique20, expression transgène19, et les produits chimiques, y compris le polyéthylène glycol (PEG)16,21,22.

Les centrosomes sont des centres d'organisation de microtubules contrôlant la forme cellulaire, la motilité, la polarisation, et la division23. Les racines centrosomal sont des structures fibreuses s'étendant des centrosomes contenant la racine de protéine24 (encodée par le gène CROCC). Nous avons récemment utilisé la fusion cellule-cellule pour comprendre comment la position centrosome et le nombre varie à l'intérieur des hétérodaryons par rapport aux cellules parentales24. La raison d'être de cette méthode est de suivre la cellule d'origine des racines dans un hétérookaryon après la fusion de cellules parentales étiquetées différemment fluorescentes, et donc d'imager la fusion et la fission organelle. Les protéines fluorescentes taguées rootletin-meGFP ou rootletin-mScarlet-I sont créées par l'édition du génome dans des lignées cellulaires séparées qui sont ensuite fusionnées par la fusion cellulaire médiée par PEG. Nous décrivons l'utilisation de colorants cellulaires (Tableau des matériaux) pour identifier les cellules fusionnées par cytométrie d'écoulement et identification subséquente de microscopie de fluorescence de la cellule centrosome d'origine et de la morphologie (figure 1). Cette approche est une méthode robuste et unique pour étudier comment les changements majeurs dans l'état cellulaire, y compris le nombre d'organelles empiéter sur l'homéostasie cellulaire.

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Protocole

1. Étiquetage différentiel des cellules fluorescentes

  1. Marquage génétique avec CRISPR Cas9
    1. Utilisez l'édition du génome CRISPR Cas9 pour étiqueter la racine (ou d'autres gènes d'intérêt) avec les protéines fluorescentes meGFP ou mScarlet-I dans les lignées cellulaires cancéreuses humaines.
      REMARQUE: Les protocoles détaillés pour l'édition du génome sont couverts ailleurs24,25,26.
  2. Étiquetage de teinture fluorescent
    1. Cultivez des cellules cancéreuses humaines Cal51 dans le milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), de L-glutamine et de 100 g/mL de pénicilline/streptomycine à 37 oC et 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié.
      REMARQUE: Il est important de s'assurer que les cellules sont régulièrement vérifiées pour l'absence de contamination par le mycoplasme et pour l'identité de la lignée cellulaire. N'utilisez pas de cellules qui ont été largement passages dans la culture (passages de 15). Les cellules doivent être en bonne santé et croître de façon exponentielle. Évitez la sous-confluence ou la sur-confluence.
    2. Seed chaque type de cellule (rootletin-meGFP, rootletin-mScarlet-I et les cellules Cal51 non étiquetées parentales) de sorte que 6 x 106 cellules sont présentes le lendemain pour chaque échantillon, à une confluence de 70 à 90%.
      REMARQUE: Il s'agit d'environ un flacon de culture tissulaire T75 ou un plat de 10 cm par type de cellule. Les cellules parentales non étiquetées sont nécessaires comme un contrôle négatif plus tard dans le protocole. Ce protocole permet la production de 20 000 cellules fusionnées, mais ce nombre pourrait être augmenté grâce à l'extension du protocole avec un nombre accru de lots.
    3. Le lendemain, prémoudre DMEM, trypsine et 1x saline tamponnée de phosphate (PBS) en les plaçant dans un bain d'eau à 37 oC.
    4. Laver les cellules rootletin-meGFP et rootletin-mScarlet-I 2x dans le PBS en versant ou en s'apitant sur le milieu et en remplaçant par 10 mL de PBS.
    5. Étiqueter les cellules Cal51 rootletin-meGFP en ajoutant 500 nM de colorant violet (Table of Materials) en PBS pendant 1 min à température ambiante (RT).
    6. Étiquette Cal51 rootletin-mScarlet-I cellules en ajoutant 200 nM de colorant à cellules rouges lointaines (Tableau des matériaux) en PBS pour 1 min à RT.
      REMARQUE: Gardez les échantillons à l'abri de la lumière dans la mesure du possible après la coloration fluorescente, afin d'éviter le blanchiment de la fluorescence.
    7. Arrêter les réactions d'étiquetage de teinture en ajoutant 10 ml de DMEM pendant 5 min.
    8. Retirez les cellules Cal51 parentales non étiquetées de l'incubateur (à partir de l'étape 1.2.2).
      REMARQUE: Ces cellules seront utilisées plus tard comme contrôles négatifs non étiquetés (étape 3.3.2).
    9. Laver toutes les cellules une fois en versant le milieu de croissance et en remplaçant par 10 ml de PBS.
    10. Verser le PBS et incuber pendant 5 min dans des conditions de culture avec 1 ml de 1x trypsine préréchauffée.
    11. Transférer les cellules dans un tube conique en plastique de 15 ml et une centrifugeuse à 1000 x g pendant 5 min.
    12. Retirez soigneusement et jetez la trypsine de la pastille cellulaire à l'utilisation d'une pipette.
    13. Resuspendre délicatement les granulés de cellules violets et rouges en 1 ml de PBS.
    14. Resuspendre délicatement le granule de cellule parental (non fluorescent) dans 1 ml de DMEM et retourner à l'incubateur.
      REMARQUE: Cet échantillon ne subira pas de fusion cellule-cellule, mais sera utilisé plus tard pendant la cytométrie du débit.

2. Fusion cellule-cellule

  1. Mélanger 3 x 106 cellules violettes étiquetées avec 3 x 106 cellules étiquetées rouges dans un tube de 15 ml en tapissant doucement 0,5 ml de chaque type de cellule à l'aide d'une pipette de 1 ml.
  2. Centrifuger les cellules non mélangées restantes de l'étape 2.1 à 1000 x g pendant 5 min, puis verser pbS, resuspendre le granule dans 1 ml de DMEM et revenir à l'incubateur.
    REMARQUE: Ces échantillons non mélangés non étiquetés restants seront utilisés plus tard comme contrôles négatifs et de compensation à la section 3 du protocole.
  3. Centrifuger les cellules mélangées à partir de l'étape 2.1 à 1000 x g pendant 5 min et aspirer soigneusement PBS à l'aide d'une pipette de 1 ml.
  4. Ajouter 0,7 ml de solution PEG de 50 % 1450 dans le sens déroulant de la pastille cellulaire (étape 2.3) à l'aide d'une pipette de 1 ml sur une période de 30 s.
  5. Laisser agir 3,5 min à RT.
    REMARQUE: Le temps d'incubation avec PEG peut être optimisé en fonction du type de cellule, bien que notez que le temps d'incubation plus long augmente la toxicité cellulaire.
  6. Ajouter 10 ml de DMEM sans sérum dans le sens de la baisse pendant 30 s et laisser dans l'incubateur pendant 10 min.
  7. Faites tourner à 1 000 x g pendant 5 min, jetez le supernatant et suspendez doucement dans 1 ml de milieu complet (DMEM contenant du FBS).
    REMARQUE: Passez directement à l'article 3. Il y a toxicité associée à l'exposition de PEG suivie de cytométrie de flux et d'imagerie, ainsi maintiennent des cellules dans des conditions de culture autant que possible en procédant rapidement entre les étapes.

3. Tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour enrichir les cellules fused

  1. Préparer toutes les cellules à la cytométrie du débit en tapant doucement chaque échantillon séparément à travers un filtre de 70 m dans un tube FACS.
    REMARQUE: Quatre échantillons sont nécessaires : cellules fusionnées, globules rouges étiquetés isolés, cellules violettes étiquetées simples, cellules parentales non étiquetées. Une fois retirées du capuchon stérile de culture des tissus, les cellules ont la capacité d'être infectées, afin de minimiser le temps d'exposition des échantillons à un environnement non stérile à partir d'ici. Les cellules sont triées dans un milieu DMEM complet.
  2. Utilisez un cytomètre capable de tri à cellule unique.
    1. Configurez le trieur cellulaire pour une sorte aseptique. Effectuer le contrôle de la qualité de l'instrument selon la recommandation du fabricant.
    2. Dessinez une parcelle de diffusion vers l'avant par rapport à la dispersion latérale et un complot de discrimination doublet.
  3. Créez des portes pour identifier les cellules fusionnées.
    1. Excitez les colorants fluorescents à des longueurs d'onde de 405 nm et 635 nm. Détecter à 450 nm et 660 nm (longueurs d'onde violettes et rouges, respectivement). Terrain loin rouge contre longueurs d'onde violettes.
    2. Exécutez des cellules parentales non étiquetées à travers le cytomètre et enregistrez l'intensité de fluorescence.
      REMARQUE: Les valeurs au-dessus de cette ligne de base définissent la positivité pour la coloration des colorants.
    3. Exécuter des cellules violettes étiquetées simples à travers le cytomètre. Confirmez qu'il n'y a pas de débordement de violette dans le canal rouge lointain.
    4. Exécutez des globules rouges étiquetés isolés à travers le cytomètre et confirmez qu'il n'y a pas de débordement de rouge lointain dans le canal violet.
      REMARQUE: Pour les données représentatives présentées, les cellules ont été triées à 20 psi sur un trieur équipé d'une buse de 100 m.
    5. Exécutez brièvement l'échantillon de fusion pour confirmer que les cellules fusionnées sont visibles avec les portes créées à l'étape 3.3.
  4. Aligner le flux de tri de façon centralisée dans un plat d'imagerie à 8 puits.
  5. Les cellules fusionnées de tri FACS, présentes sous forme de cellules violettes positives doubles et d'étiquettes rouges lointaines directement dans un plat d'imagerie de 8 puits contenant 100 l de milieu de croissance.
    REMARQUE: Le nombre maximum recommandé de cellules est de 50 000 euros par plat de 8 puits. Assurer la santé des cellules pendant le tri. La confluence cellulaire peut influencer la santé cellulaire, alors gardez les cellules entre 20 et 90 % de confluence après le tri en triant un nombre approprié de cellules pour le plat d'imagerie. Chaque gouttelette triée contient environ 3 nL de liquide de gaine. Assurez-vous que le liquide de gaine ne dilue pas de façon significative le milieu de croissance pendant le tri.
  6. Directement après le tri, ramener les cellules à l'incubateur et laisser pour la nuit.
    REMARQUE: Les cellules adhérentes réadhéreront progressivement à la couverture pendant cette période, à partir du tri, et donc leur morphologie changera au fil du temps si elle est prise directement au microscope.

4. Staining immunofluorescent et imagerie des fusions de cellules-cellules

REMARQUE: Les cellules futilisées peuvent être représentées en direct ou après fixation et d'autres taches fluorescentes (ou les deux), selon les expériences et les mesures requises.

  1. Imagerie cellulaire en direct
    1. Remplacer le milieu de croissance par un milieu d'imagerie sans phenol rouge(tableau des matériaux)et passer directement à l'imagerie.
  2. Fixation et coloration
    1. Préparer le paraformaldéhyde frais de 4 % (PFA) dans PBS.
    2. Fixez les cellules en les incuber dans 100 'L de 4% PFA pendant 15 min à RT. Enlevez PFA après 15 min.
      MISE EN GARDE: PFA est toxique lorsqu'il est inhalé de sorte que cette étape doit être effectuée dans un capot de fumée avec un équipement de protection individuelle approprié.
      REMARQUE: Après fixation, l'expérience peut être interrompue et redémarrée plus tard si nécessaire. Entreposer l'échantillon à 4 oC, à l'abri de la lumière, au besoin.
    3. Laver les cellules 3x dans 200 OL de PBS à RT.
    4. Les cellules de perméabilize pendant 10 min à RT dans 200 'L de 0.1% surfactant nonionic (tableau des matériaux) et 0.1% détergent nonionic (tableau des matériaux) dilué dans PBS.
    5. Bloquer en 200 l de 3% d'albumine de sérum bovin en PBS pendant 30 min à RT.
    6. Incuber avec des anticorps dans 150 OL de PBS contenant 3% d'albumine de sérum bovin et 0,1% de surfactant nonionique et 0,05% de détergent nonionique pendant 1 h à RT.
      REMARQUE: Les principaux anticorps utilisés pour générer les résultats représentatifs sont les nanobodys anti-GFP conjugués fluorescents (utilisés à 1:400 dilution), et fluorescents conjugués anti-mScarlet-I nanobody (utilisé à 1:500 dilution). Ceux-ci améliorent le signal des protéines déjà fluorescentes.
    7. Laver 2x pendant 5 min dans 300 OL de PBS, puis laisser dans 200 'L de PBS.
      REMARQUE: Les échantillons sont représentés dans PBS. Les échantillons peuvent être stockés à 4 oC, protégés de la lumière.
  3. Acquisition d'images
    1. Acquérir des images avec un microscope à fluorescence approprié capable d'imagerie quatre couleurs (p. ex., éclairage confocal, large champ, structuré).
    2. Excitez-moiGFP et mScarlet-I canaux avec 488 nm et 561 nm lasers longueur d'onde, respectivement. Définir les détecteurs pour détecter à 505 à 550 nm et à 590 à 650 nm. Excitez les canaux violets et les canaux de teinture rouge lointain avec 405 nm et 633 nm lasers, respectivement. Définir les détecteurs pour détecter à 430 à 500 nm et à 660 à 750 nm.
    3. Déterminez empiriquement l'intensité laser de telle sorte qu'il n'y ait pas de photoblanchiment significatif et que les cellules restent en bonne santé (si l'imagerie cellulaire vivante).
    4. Déterminez empiriquement le gain tel que le signal est obtenu sans saturer ou couper artificiellement les valeurs des pixels.
    5. Recueillir des données De pile Z, de sorte que les images sont tridimensionnelles, couvrant une gamme de 20 à 60 m avec une taille d'étape de 500 m.
      REMARQUE: Les images présentées dans les données représentatives ont été acquises soit par confocal (figure 2B), Airyscan (figure 2C) ou par microscopie d'éclairage structurée (figure 2D). Chaque cellule est un hétérookaryon de bonne foi si elle contient à la fois des colorants violets et rouges qui se chevauchent dans le cytoplasme.

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Résultats

Les cellules correctement étiquetées sont visibles pendant la cytométrie d'écoulement par signal de fluorescence plus élevé que les cellules témoins non étiquetées (figure 2A). Les portes sont fixées pour le tri des cellules double ment positives, enrichissant cette population directement dans des plats d'imagerie pour d'autres analyses microscopiques. Les cellules futilisées sont détectables en tant que cellules distinctes à double fluoresce...

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Discussion

Nous démontrons un protocole facile et rentable pour fusionner des cellules et visualiser l'architecture suivante des hybrides cellulaires avec la microscopie, prenant approximativement deux jours du début à la fin. Les parties critiques de ce protocole sont l'enrichissement des cellules fusionnées par tri cellulaire (section 3 du protocole) et la validation soigneuse des cellules fusionnées par microscopie (section 4 du protocole). Ces sections s'assurent que les cellules fusionnées sont facilement obtenues et sont des ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Ce travail a été financé par une bourse Wellcome Trust Henry Wellcome à R.M. (https://wellcome.ac.uk/grant numéro 100090/12/Z). Le bailleur de rôle n'a joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit. Nous remercions Ashok Venkitaraman et Paul Français pour les conseils et les conseils essentiels sur le projet. Nous remercions Chiara Cossetti et Gabriela Grondys-Kotarba du Cambridge Institute for Medical Research Flow Cytometry pour leur excellent soutien. Nous remercions Liam Cassiday, Thomas Miller et Gianmarco Contino d'avoir relu le manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube de 15 mLSarstedt62554502
solution de formaldéhyde à 37 %Sigma-AldrichF8875
880 Balayage laser Microscope confocal AiryscanCarl Zeiss
Boîtes d’imagerie à 8 puitsIbidi80826
Nanocorps de booster GFP d’alpaga anti-GFP Chromotekgba-488
BD Influx Trieur de cellulesBD Biosciences
Sérum bovin albumineSigma-AldrichA7906
Filtres cellulaires (70 &mu ; m)BiofilCSS010070
CellTrace Far RedThermoFisher ScientificC34572
CellTrace VioletThermoFisher ScientificC34571
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), glycémie élevée, GlutaMAX, pyruvateThermoFisher Scientific31966021
Sérum de veau fœtalSigma-Aldrich10270-106
FluoTag-X2 nanocorps d’alpaga anti-mScarlet-INanoTag BiotechnologiesN1302-At565
L15 CO2 support d’imagerie indépendantSigma-Aldrich21083027
Pénicilline/streptomycineSigma-Aldrich15140122
DMEM sans rouge de phénol, haute teneur en glucoseThermoFisher Scientific21063029
Solution saline tamponnée au phosphate (1x PBS)8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2HPO4, dH2O jusqu’à 1 L
de polyéthylène glycol Hybri-Max 1450Sigma-AldrichP7181
Tubes en polypropylèneBD Falcon352063
Triton X-100Fisher BioReagentsTensioactif non ioniqueBP151
TrypsinSigma-AldrichT4049
Tween 20Fisher BioReagentsBP337détergent non ionique

Références

  1. Lane, N. Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2006).
  2. Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. How cells fuse. The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).
  3. Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
  4. Rao, P. N., Johnson, R. T. Mammalian Cell Fusion: Studies on the Regulation of DNA Synthesis and Mitosis. Nature. 225 (5228), 159-164 (1970).
  5. Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Genetic instability in colorectal cancers. Nature. 386 (6625), 623-627 (1997).
  6. Fournier, R. E., Ruddle, F. H. Microcell-mediated transfer of murine chromosomes into mouse, Chinese hamster, and human somatic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (1), 319-323 (1977).
  7. Tada, M., Tada, T., Lefebvre, L., Barton, S. C., Surani, M. A. Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells. The EMBO Journal. 16 (21), 6510-6520 (1997).
  8. Skelley, A. M., Kirak, O., Suh, H., Jaenisch, R., Voldman, J. Microfluidic control of cell pairing and fusion. Nature Methods. 6 (2), 147-152 (2009).
  9. Donaldson, J., Shi, R., Borgens, R. Polyethylene glycol rapidly restores physiological functions in damaged sciatic nerves of guinea pigs. Neurosurgery. 50 (1), 147-157 (2002).
  10. Duelli, D. M., Hearn, S., Myers, M. P., Lazebnik, Y. A primate virus generates transformed human cells by fusion. The Journal of Cell Biology. 171 (3), 493-503 (2005).
  11. Duelli, D. M., Lazebnik, Y. A. Primary cells suppress oncogene-dependent apoptosis. Nature Cell Biology. 2 (11), 859-862 (2000).
  12. Duelli, D. M., et al. A virus causes cancer by inducing massive chromosomal instability through cell fusion. Current Biology. 17 (5), 431-437 (2007).
  13. Paramio, J. M., Casanova, M. L., Alonso, A., Jorcano, J. L. Keratin intermediate filament dynamics in cell heterokaryons reveals diverse behaviour of different keratins. Journal of Cell Science. 110, 1099-1111 (1997).
  14. Lentz, B. R. PEG as a tool to gain insight into membrane fusion. European Biophysics Journal. 36 (4-5), 315-326 (2007).
  15. Lentz, B. R., Lee, J. K. Poly(ethylene glycol) (PEG)-mediated fusion between pure lipid bilayers: a mechanism in common with viral fusion and secretory vesicle release? Molecular Membrane Biology. 16 (4), 279-296 (1999).
  16. Pontecorvo, G. Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment. Somatic Cell Genetics. 1 (4), 397-400 (1975).
  17. Okada, Y. Analysis of giant polynuclear cell formation caused by HVJ virus from Ehrlich's ascites tumor cells. I. Microscopic observation of giant polynuclear cell formation. Experimental Cell Research. 26, 98-107 (1962).
  18. Zimmermann, U. Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena. Biochimica et Biophysica Acta. 694 (3), 227-277 (1982).
  19. Hu, C., et al. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science. 300 (5626), 1745-1749 (2003).
  20. Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters. Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 9922, 992211(2016).
  21. Kao, K. N., Michayluk, M. R. A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts. Planta. 115 (4), 355-367 (1974).
  22. Ahkong, Q. F., Fisher, D., Tampion, W., Lucy, J. A. Mechanisms of cell fusion. Nature. 253 (5488), 194-195 (1975).
  23. Mahen, R., Venkitaraman, A. R. Pattern formation in centrosome assembly. Current Opinion in Cell Biology. 24 (1), 14-23 (2012).
  24. Mahen, R. Stable centrosomal roots disentangle to allow interphase centriole independence. PLoS Biology. 16 (4), e2003998(2018).
  25. Mahen, R., et al. Comparative assessment of fluorescent transgene methods for quantitative imaging in human cells. Molecular Biology of the Cell. 25 (22), 3610-3618 (2014).
  26. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  27. Yang, J., Shen, M. H. Polyethylene glycol-mediated cell fusion. Methods in Molecular Biology. 325, 59-66 (2006).
  28. Huang, L., Chen, Y., Huang, W., Wu, H. Cell pairing and polyethylene glycol (PEG)-mediated cell fusion using two-step centrifugation-assisted single-cell trapping (CAScT). Lab on a Chip. 18 (7), 1113-1120 (2018).
  29. Feliciano, D., Nixon-Abell, J., Lippincott-Schwartz, J. Triggered Cell-Cell Fusion Assay for Cytoplasmic and Organelle Intermixing Studies. Current Protocols in Cell Biology. 81 (1), e61(2018).
  30. Vaughan, V. L., Hansen, D., Stadler, J. Parameters of polyethylene glycol-induced cell fusion and hybridization in lymphoid cell lines. Somatic Cell Genetics. 2 (6), 537-544 (1976).
  31. Frye, L. D., Edidin, M. The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons. Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).
  32. Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin. FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).
  33. Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor. Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Cytom trie en fluxMicroscopie fluorescencedition du g nomeHom ostasie des organitesFormation d h t rokaryonsFusion m di e par le PEGMarquage par prot ines fluorescentesTri cellulaireDuplication des centrosomes
Fusion cellulaire du génome Lignes cellulaires modifiées pour la perturbation de la structure et de la fonction cellulaires
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