Fusion cellulaire du génome Lignes cellulaires modifiées pour la perturbation de la structure et de la fonction cellulaires

Résumé

Le but de ce protocole est de fusionner deux types de cellules différents pour créer des cellules hybrides. L'analyse de microscopie de fluorescence des cellules fusionnées est employée pour suivre la cellule d'origine des organites cellulaires. Cet analyse peut être utilisé pour explorer comment la structure cellulaire et la fonction réagissent à la perturbation par fusion cellulaire.

Résumé

La vie est spatialement cloisonnée dans les membranes lipidiques pour permettre la formation isolée d'états moléculaires distincts à l'intérieur des cellules et des organites. La fusion cellulaire est la fusion de deux cellules ou plus pour former une seule cellule. Ici, nous fournissons un protocole pour la fusion cellulaire de deux types de cellules différentes. Les cellules hybrides futilisées sont enrichies par le tri à base de cytométrie de flux, suivi de la microscopie de fluorescence de la structure et de la fonction des cellules hybrides. Les protéines étiquetées fluorescentes générées par l'édition du génome sont représentées à l'intérieur de cellules fusionnées, ce qui permet d'identifier les structures cellulaires en fonction de l'émission de fluorescence et de les référencer au type d'origine cellulaire. Cette méthode robuste et générale peut être appliquée à différents types de cellules ou organites d'intérêt, pour comprendre la structure cellulaire et la fonction à travers une gamme de questions biologiques fondamentales.

Introduction

L'entretien homéostatique de la structure cellulaire est essentiel à la vie. Les cellules ont des morphologies caractéristiques, des nombres d'organites sous-cellulaires et une composition biochimique interne. Comprendre comment ces propriétés fondamentales sont générées et comment elles tournent mal pendant la maladie nécessite des outils de laboratoire pour les perturber.

La fusion cellulaire est la fusion de deux ou plusieurs cellules distinctes. La fusion cellulaire peut avoir été essentielle à l'émergence de la vie eucaryote¹. Dans le corps humain, la fusion cellulaire est relativement rare, se produisant pendan....

Protocole

1. Étiquetage différentiel des cellules fluorescentes

1. Marquage génétique avec CRISPR Cas9
   1. Utilisez l'édition du génome CRISPR Cas9 pour étiqueter la racine (ou d'autres gènes d'intérêt) avec les protéines fluorescentes meGFP ou mScarlet-I dans les lignées cellulaires cancéreuses humaines.
      REMARQUE: Les protocoles détaillés pour l'édition du génome sont couverts ailleurs^24,25,26.
2. Étiquetage de teinture fluorescent
   1. Cultivez des cellules cancéreuses humaines Cal51 dans le milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DME....

Résultats

Les cellules correctement étiquetées sont visibles pendant la cytométrie d'écoulement par signal de fluorescence plus élevé que les cellules témoins non étiquetées (figure 2A). Les portes sont fixées pour le tri des cellules double ment positives, enrichissant cette population directement dans des plats d'imagerie pour d'autres analyses microscopiques. Les cellules futilisées sont détectables en tant que cellules distinctes à double fluoresce.......

Discussion

Nous démontrons un protocole facile et rentable pour fusionner des cellules et visualiser l'architecture suivante des hybrides cellulaires avec la microscopie, prenant approximativement deux jours du début à la fin. Les parties critiques de ce protocole sont l'enrichissement des cellules fusionnées par tri cellulaire (section 3 du protocole) et la validation soigneuse des cellules fusionnées par microscopie (section 4 du protocole). Ces sections s'assurent que les cellules fusionnées sont facilement obtenues et sont des .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube de 15 mL	Sarstedt	62554502
solution de formaldéhyde à 37 %	Sigma-Aldrich	F8875
880 Balayage laser Microscope confocal Airyscan	Carl Zeiss
Boîtes d’imagerie à 8 puits	Ibidi	80826
Nanocorps de booster GFP d’alpaga anti-GFP Chromotek		gba-488
BD Influx Trieur de cellules	BD Biosciences
Sérum bovin albumine	Sigma-Aldrich	A7906
Filtres cellulaires (70 &mu ; m)	Biofil	CSS010070
CellTrace Far Red	ThermoFisher Scientific	C34572
CellTrace Violet	ThermoFisher Scientific	C34571
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), glycémie élevée, GlutaMAX, pyruvate	ThermoFisher Scientific	31966021
Sérum de veau fœtal	Sigma-Aldrich	10270-106
FluoTag-X2 nanocorps d’alpaga anti-mScarlet-I	NanoTag Biotechnologies	N1302-At565
L15 CO2 support d’imagerie indépendant	Sigma-Aldrich	21083027
Pénicilline/streptomycine	Sigma-Aldrich	15140122
DMEM sans rouge de phénol, haute teneur en glucose	ThermoFisher Scientific	21063029
Solution saline tamponnée au phosphate (1x PBS)			8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2HPO4, dH2O jusqu’à 1 L
de polyéthylène glycol Hybri-Max 1450	Sigma-Aldrich	P7181
Tubes en polypropylène	BD Falcon	352063
Triton X-100	Fisher BioReagents	Tensioactif non ionique	BP151
Trypsin	Sigma-Aldrich	T4049
Tween 20	Fisher BioReagents	BP337	détergent non ionique