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Article de méthode

Modèle in Vitro de l’angiogenèse coronaire

8K vues

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DOI :

10.3791/60558

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10 mars 2020

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1Department of Biology, Ball State University, 2Department of Biology, Stanford University

Dans cet article

Résumé

Des modèles in vitro d’angiogenèse coronaire peuvent être utilisés pour la découverte des mécanismes cellulaires et moléculaires de l’angiogenèse coronaire. Les cultures d’explantation in vitro des tissus sinus venosus et endocardium montrent une croissance robuste en réponse au VEGF-A et affichent un modèle similaire d’expression DEMENT-TFII comme in vivo.

Résumé

Ici, nous décrivons un essai in vitro de culture pour étudier l’angiogenèse coronaire. Les vaisseaux coronaires nourrissent le muscle cardiaque et sont d’importance clinique. Les défauts dans ces vaisseaux représentent des risques graves pour la santé tels que dans l’athérosclérose, qui peut mener aux infarctus du myocarde et aux insuffisances cardiaques chez les patients. Par conséquent, la maladie coronarienne est l’une des principales causes de décès dans le monde. En dépit de son importance clinique, relativement peu de progrès ont été réalisés sur la façon de régénérer les artères coronaires endommagées. Néanmoins, des progrès récents ont été réalisés dans la compréhension de l’origine cellulaire et des voies de différenciation du développement des vaisseaux coronaires. L’avènement d’outils et de technologies qui permettent aux chercheurs d’étiqueter fluorescentement les cellules progénitrices, de suivre leur destin et de visualiser les descendants in vivo ont joué un rôle déterminant dans la compréhension du développement des vaisseaux coronaires. Les études in vivo sont précieuses, mais ont des limites en termes de vitesse, d’accessibilité et de flexibilité dans la conception expérimentale. Alternativement, des modèles in vitro précis de l’angiogenèse coronaire peuvent contourner ces limitations et permettre aux chercheurs d’interroger d’importantes questions biologiques avec rapidité et flexibilité. L’absence de systèmes modèles in vitro appropriés peut avoir entravé les progrès dans la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires de la croissance des vaisseaux coronaires. Ici, nous décrivons un système de culture in vitro pour cultiver des vaisseaux coronaires du sinus venosus (SV) et de l’endocardium (Endo), les deux tissus progéniteurs à partir desquels de nombreux vaisseaux coronaires surgissent. Nous avons également confirmé que les cultures récapitulent avec précision certains des mécanismes in vivo connus. Par exemple, nous montrons que les germes angiogéniques dans la culture de SV déréglementent l’expression COUP-TFII semblable à ce qui est observé in vivo. En outre, nous montrons que VEGF-A, un facteur angiogénique bien connu in vivo, stimule vigoureusement l’angiogenèse des cultures SV et Endo. Collectivement, nous avons conçu un modèle précis de culture in vitro pour étudier l’angiogenèse coronaire.

Introduction

Les vaisseaux sanguins du cœur sont communément appelés vaisseaux coronaires. Ces vaisseaux sont composés d’artères, de veines et de capillaires. Pendant le développement, des capillaires fortement ramifiés sont établis d’abord, qui se transforment ensuite en artères coronaires et veines1,2,3,4,5. Ces capillaires initiaux sont construits à partir de cellules progénitrices endothéliales trouvées dans le proépicardium, sinus venosus (SV), et endocardium (Endo) tissus1,6,7,8. SV est l’organe d’afflux de cœur embryonnaire et Endo est la doublure intérieure du lumen de coeur. Les cellules progénitrices endothéliales trouvées dans le SV et l’Endo construisent la majorité de la vascularisation coronaire, tandis que le proépicardium contribue à une partie relativement faible decelui-ci 2. Le processus par lequel le réseau capillaire des vaisseaux coronaires se développe dans le cœur à partir de ses cellules précurseurs préexistantes est appelé angiogenèse coronaire. La maladie coronarienne est l’une des principales causes de décès dans le monde et pourtant un traitement efficace pour cette maladie fait défaut. Comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires détaillés de l’angiogenèse coronaire peut être utile dans la conception de thérapies nouvelles et efficaces pour réparer et régénérer les artères coronaires endommagées.

Récemment, une augmentation de notre compréhension de la façon dont les vaisseaux coronariens se développent a été en partie réalisée grâce au développement de nouveaux outils et technologies. En particulier, l’étiquetage in vivo de lignée et les technologies d’imagerie de pointe ont été très utiles pour découvrir l’origine cellulaire et les voies de différenciation des vaisseaux coronaires9,10,11,12. Malgré les avantages de ces outils in vivo, il y a des limites en termes de rapidité, de flexibilité et d’accessibilité. Par conséquent, des systèmes modèles in vitro robustes peuvent compléter les systèmes in vivo pour élucider les mécanismes cellulaires et moléculaires de l’angiogenèse coronaire d’une manière à haut débit.

Ici, nous décrivons un modèle in vitro de l’angiogenèse coronaire. Nous avons développé un système de culture d’explation in vitro pour cultiver des vaisseaux coronaires à partir de deux tissus progéniteurs, SV et Endo. Avec ce modèle, nous montrons que les cultures d’explants de tissu in vitro cultivent des germes de vaisseau coronaires lorsqu’elles sont stimulées par le milieu de croissance. En outre, les cultures explantées se développent rapidement par rapport au contrôle lorsqu’elles sont stimulées par le facteur de croissance endothélial vasculaire A (VEGF-A), une protéine angiogénique très puissante. En outre, nous avons constaté que les germes angiogéniques de la culture SV subissent la dénodéliation veineuse (perte de l’expression COUP-TFII), un mécanisme similaire à l’angiogenèse SV in vivo1. Ces données suggèrent que le système de culture explantée in vitro rétablisse fidèlement les événements angiogéniques qui se produisent in vivo. Collectivement, les modèles in vitro de l’angiogenèse qui sont décrits ici sont idéaux pour sonder les mécanismes cellulaires et moléculaires de l’angiogenèse coronaire d’une manière élevée et accessible.

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Protocole

L’utilisation de tous les animaux dans ce protocole a suivi les lignes directrices du Comité de soins et d’utilisation des animaux institutionnels de l’Université d’État de Ball State (IACUC).

1. Établir des éleveurs de souris et détecter les prises vaginales pour les grossesses chronométrées

  1. Installez une cage de reproduction de souris avec des souris mâles et femelles de type sauvage. Assurez-vous que l’âge des souris reproductrices est compris entre 6 et 8 semaines. Installez une paire (1 mâle et 1 femelle) soit en trio (1 mâle et 2 femelles) pour l’élevage.
  2. Vérifiez s’il y a un bouchon vaginal le lendemain matin. Utilisez une sonde métallique inclinée pour détecter une prise en profondeur en l’insérant dans l’ouverture vaginale. Désignez le matin d’un bouchon vaginal positif pour être le jour embryonnaire 0,5 (e0,5).
    REMARQUE : Une prise vaginale peut être superficielle (qui est facilement visible, voir la figure 1) ou profonde (ce qui n’est pas facilement visible). La présence d’une prise en profondeur bloquera l’insertion complète de la sonde tandis que l’absence d’un bouchon permettra une insertion complète sans résistance.
  3. Maintenir la grossesse chronométrée jusqu’à ce que les embryons atteignent e11.5 au cours de laquelle ils seront récoltés. Pour confirmer la grossesse avant la récolte des embryons, enregistrez le poids des souris femelles entre e7,5 et e11.5.
    REMARQUE : L’augmentation quotidienne du poids de la mère indiquera une grossesse réussie, alors qu’aucun changement de poids n’indiquera une grossesse ratée.

2. Récolte d’embryons de souris enceintes

REMARQUE : Avant de commencer, assurez-vous d’avoir l’équipement et les réactifs suivants : une chambre d’euthanasie CO2, 70 % d’éthanol, des serviettes en papier, des forceps réguliers, des forceps fins, des ciseaux, un salin stérile de phosphate (PBS), des plats De Petri stériles de 10 cm, un contenant avec de la glace, une cuillère perforée, un stéréomicroscope de dissection.

  1. Placez une souris enceinte e11.5 dans une chambre d’euthanasie propre DE CO2 pour la sacrifier. Fermez le couvercle de la chambre pour empêcher la souris de s’échapper.
  2. Une fois que la souris est fixée dans la chambre d’euthanasie, allumez le CO2. Assurez-vous de réguler le débit de CO2 par recommandations de l’IACUC (c.-à-d. 10-30% de déplacement par minute). Une fois que la souris est complètement euthanasié, effectuez une dislocation cervicale pour assurer la mort.
  3. Vaporiser la souris avec 70% d’éthanol. Soulevez la peau sur le ventre à l’aide de forceps, faites une petite incision à l’aide d’une paire de ciseaux et prolongez l’incision latéralement. Agrandir l’incision antérieurement jusqu’au diaphragme et exposer la corne utérine contenant les embryons(figure 2).
  4. Retirez la chaîne d’embryons (corne utérine et embryons) en saisissant l’utérus et en le coupant librement. Placer la chaîne d’embryons dans le 1x PBS stérile glacé.
  5. Disséquer les embryons individuels de la corne de l’utérus en épluchant le muscle utérin, le sac jaune et l’amnion un par un(figure 3A-F) sous un stéréomicroscope. Transférer les embryons nettoyés à l’aide d’une cuillère perforée dans un plat Petri contenant stérile 1x PBS sur la glace. Assurez-vous de garder les embryons froids.

3. Isoler les cœurs des embryons e11.5

REMARQUE : Avant de commencer, assurez-vous d’avoir l’équipement et les réactifs suivants : forceps réguliers, forceps fins, PBS stérile de 1x, plat de Petri stérile de 10 cm, plat de Petri stérile de 6 cm, récipient avec glace, cuillère perforée, stéréomicroscope de dissection.

  1. Installez un nouveau plat Petri avec 1x PBS stérile glacé sous un stéréomicroscope. Transférer un embryon de l’étape 2.5 dans le plat Petri pour disséquer le cœur.
  2. Retirez la tête de l’embryon à l’aide de forceps. Tout d’abord, presser la tête entre les forceps d’une main, puis retirer la tête en la grattant avec l’autre main à l’aide de forceps fermés(figure 4A-C).
  3. Après avoir enlevé la tête, orientez l’embryon avec son côté ventral vers le haut en tenant l’embryon avec des forceps à son ventre d’une main (figure 4D).
  4. D’autre part, ouvrez la paroi thoracique de l’embryon en faisant d’abord une petite incision dans la poitrine légèrement au-dessus du diaphragme à l’aide de forceps fins. Ensuite, agrandir l’incision très soigneusement en insérant des forceps fermés et en déchirant la paroi thoracique en ouvrant les forceps. Assurez-vous de ne pas pousser trop profondément, ce qui peut endommager le cœur. Avec l’aide des forceps, gardez la paroi thoracique grande ouverte pour exposer le cœur et les poumons dans la cavité thoracique(figure 4E).
  5. À l’aide de forceps fins, déplacez doucement le cœur antérieurement (90 degrés) et exposez l’aorte/veine dorsale. Sortez le cœur/poumons antérieurement en capturant l’aorte/veine dorsale à la base du cœur(figure 4F-H).
    REMARQUE : Soyez doux tout en tirant le cœur/poumons pour éviter de déchirer le SV, qui est situé sur le côté dorsal du cœur.
  6. Rincer le cœur/poumons avec le PBS 1x froid pour enlever les cellules sanguines.
  7. Répétez les étapes 3.1-3.6 pour enlever le cœur/poumons des embryons restants. Assurez-vous de garder le cœur/poumons isolés sur la glace.

4. Isoler les SVs et les Ventricules de e11.5 Embryonic Mouse Hearts

  1. Placer le plat Petri avec le cœur/poumons de l’étape 3.7 sous un stéréomicroscope pour isoler les SVs et les ventricules entiers. Épluchez les lobes attachés des poumons un par un de leur racine à l’aide de forceps fins.
  2. Orientez le cœur sur son côté dorsal et retirez l’oreilleria et le tissu adjacent qui entoure le SV antérieurement sans déchirer le SV. Retirez l’oreillerie gauche et droite du cœur en tenant à sa base et en le grattant à l’aide de forceps fins(figure 5B). Enlever le tissu adjacent entourant le SV à l’aide d’une technique similaire(figure 5C).
    REMARQUE : Gardez à l’esprit que l’oreillette droite est attachée au SV, alors veillez à ne retirer que l’atrium.
  3. Pour isoler le SV, d’abord orienter le cœur avec son côté dorsal face vers le haut (parce que le SV est sur le côté dorsal) et garder le cœur encore dans cette position en tenant doucement le cœur à ses ventricules avec des forceps.
    REMARQUE : Le SV est un organe d’afflux d’un cœur embryonnaire qui se trouve entre les oreillettes du côté dorsal du cœur.
  4. Retirez le SV en l’épluchant soigneusement du cœur où il est attaché ou en tenant le SV à la base de son attachement avec de fines forceps et en le grattant avec des forceps fermés(figure 5D,E).
  5. Transférer le SV isolé dans un nouveau plat Petri de 6 cm avec un 1x PBS stérile glacé sur la glace à l’aide d’une pipette de transfert stérile et étiqueter le plat Petri comme SV.
  6. Pour isoler les ventricules entiers, retirer le tractus sortant (aorte et tronc pulmonaire) du cœur après l’enlèvement du SV(figure 5F,G).
  7. Transférer les ventricules entiers dans un nouveau plat Petri de 6 cm contenant stérile 1x PBS sur la glace à l’aide d’une pipette de transfert stérile et étiqueter le plat Petri comme ventricules. Gardez le SV et les ventricules isolés sur la glace.
  8. Répétez les étapes 4.1-4.7 pour isoler les SVs et les ventricules des cœurs restants.

5. Mise en place de plaques de culture tissulaire avec inserts et revêtement de matrice extracellulaire

REMARQUE : Avant de commencer, assurez-vous d’avoir l’équipement et les réactifs suivants : solution commerciale de matrice extracellulaire (ECM ; par exemple, Matrigel), 8,0 M de polyéthylène teréphtalate (PET) inserts de culture, 24 plaques de puits, 37 oC, 5% de CO2 incubateur.

  1. Laissez la solution ECM décongeler sur la glace. Maintenez la solution ECM sur la glace pour éviter la solidification.
  2. Placez les inserts de culture de membrane PET (taille de pore ' 8.0 'm, zone de filtration '0.3 cm2, diamètre de filtre '6.5 mm) dans les puits de la culture non tissulaire traitée 24 plaques de puits. Étiquetez les plaques sous forme de SV ou de ventricules pour le SV ou les essais d’angiogenèse endocardiale, respectivement.
    REMARQUE : Configurez les inserts dans des plaques séparées pour le SV et les ventricules lors de l’exécution simultanée des deux cultures. Assurez-vous de mettre en place suffisamment de puits pour tous les échantillons expérimentaux et les contrôles.
  3. Une fois que la solution ECM est décongelée, diluer immédiatement ECM 1:2 dans le milieu basal précolé (c.-à-d., milieu basal EBM-2, voir Tableau des matériaux) à un volume suffisant (100 l/insert x nombre d’inserts).
    REMARQUE : Par exemple, s’il y a six inserts, le volume total sera de 100 l x 6 x 6 x 600 lL. Ajouter 200 l d’ECM en 400 ll de milieu basal.
  4. Enrober les inserts de 100 l d’ECM fraîchement dilué en l’ajoutant directement sur la membrane. Incuber la plaque à 37 oC pendant au moins 30 minutes pour permettre à l’ECM de se solidifier.
    REMARQUE : Ceci doit être effectué sous un capot de culture de tissu de flux laminaire pour éviter la contamination.

6. Les SVs et les cultures de ventricules entiers

REMARQUE : Avant de commencer, assurez-vous d’avoir l’équipement et les réactifs suivants : 70% d’éthanol, pipette de transfert, stéréomicroscope, forceps, capuchon de culture tissulaire à débit laminaire, kit microvasculaire de supplément de cellules endothéliales(tableau des matériaux), milieu basal, PBS stérile 1x). La figure 6 montre le flux de travail de la culture SV et ventricule.

  1. Décongeler le contenu de la trousse de supplément sur la glace. Préparer le milieu complet en ajoutant tout le contenu du kit de supplément en 500 ml de milieu basal sous une hotte certifiée de culture de tissu à débit laminaire. Mélanger le milieu bien et distribuer dans 50 mL aliquots.
  2. Stériliser la base du stéréomicroscope et la zone de travail environnante avec 70% d’éthanol.
  3. Obtenir les plaques de culture tissulaire de l’étape 5.4. À l’aide d’une pipette de transfert, transférer soigneusement les explants de l’étape 4.7 sur la membrane d’insertion. Sous un stéréomicroscope et à l’aide de forceps propres, placez les explants au centre des inserts pour s’assurer qu’ils ne sont pas coincés dans le coin des inserts ou attachés aux parois latérales.
  4. Une fois que les explants sont placés et centrés sur les inserts, retirez soigneusement tout PBS supplémentaire des inserts et fermez les couvercles des plaques.
  5. Sous un capot de culture tissulaire à débit laminaire, ajouter 100 l du milieu complet préenchaillé sur le dessus des inserts et 200 l dans les puits pour la culture les explants à l’interface air-liquide de telle sorte que la surface basale de l’insert est en contact avec le milieu , mais la surface supérieure est exposée à l’air.
    REMARQUE : Assurez-vous d’ajuster le volume pour obtenir une interface air-liquide si vous utilisez des inserts/plaques de puits de taille différente.
  6. Ajouter 300 L de PBS dans les puits inutilisés des 24 plaques de puits et couvrir avec le couvercle. Incuber la plaque dans un incubateur de 37 oC, 5% de CO2, et développer les cultures pendant 5 jours.
  7. Dans les jours suivants, observez régulièrement les cultures sous un microscope léger inversé pour évaluer l’état des cultures explantées. Assurez-vous que les explants présentent des battements contractuels et que toutes les explantations sont fixées au fond de la membrane intégrée à l’ECM. Prenez note de toutes les explants flottants.
    REMARQUE : La contraction périodique des explants indique qu’ils sont vivants. Les explants flottants doivent être omis de l’analyse.
  8. Après avoir évalué le statut de la culture, remettre l’assiette de culture dans l’incubateur et continuer à développer la culture jusqu’à 5 jours.

7. Traitement des cultures avec VEGF-A (contrôle positif)

REMARQUE : Avant de commencer, assurez-vous d’avoir l’équipement et les réactifs suivants : capuchon de culture de tissu à débit laminaire, 1x PBS, milieu basal - 1% sérum bovin fœtal (FBS), milieu basal - VEGF-A, pipettes, et pipette pointes.

  1. Préparer le milieu basal de 1% FBS et le milieu basal ' VEGF-A.
    1. Pour préparer le milieu basal de 1 % de FBS, déterminez d’abord le nombre de puits de commande nécessaires. Par exemple, s’il y a trois puits de commande, alors 300 L/puits x 3 à 900 l’un est le volume total nécessaire. Ajoutez 9 L de FBS en 891 L de milieu basal pour faire le milieu basal de 1% FBS.
    2. Pour préparer le milieu basal et le VEGF-A, déterminez d’abord le nombre total de puits nécessitant un milieu VEGF-A. S’il y a trois puits, alors 300 L/puits x 3 x 900 l est le volume total et 50 ng/puits x 3 ' 150 ng VEGF-A. Ajoutez 150 ng de VEGF-A dans 900 L de milieu basal pour faire le milieu basal - VEGF-A.
      REMARQUE : Assemblez cette solution à un volume plus important que prévu pour assurer un nombre suffisant d’aliquots plus petits pour chaque expérience.
  2. Le jour 2, retirez les médias des deux chambres (les inserts et les puits). Laver les cultures avec 300 L de 1x PBS en ajoutant 100 l aux inserts et 200 l dans les puits. Remuez fermement les plaques à quelques reprises et retirez le PBS.
  3. Ajouter 300 L de milieu basal à 1 % de FBS (100 ll dans l’insert et 200 l dans les puits) pour affamer les cultures pendant 24 h.
  4. Le jour 3, après la famine, ajouter 300 L de milieu basal - 1% FBS (100 'L dans l’insert et 200 'L dans les puits) dans les puits de contrôle et le milieu basal - VEGF-A (50 ng/puits) dans les puits de traitement, respectivement.
  5. Après le traitement, continuer à cultiver les cultures dans l’incubateur.

8. Fixation et immunostachation

REMARQUE : Avant de commencer, assurez-vous d’avoir l’équipement et les réactifs suivants : 4 % de paraformaldéhyde (PFA), 1x PBS, anticorps primaires et secondaires, shaker, 0,5 % de surfactant non ionique dans PBS (PBT).

  1. Le sixième jour de la culture, enlever le milieu et laver les cultures avec 1x PBS à température ambiante (RT).
    1. Réparez les cultures en ajoutant 200 L de la solution PFA de 4 % dans les puits et de 100 l dans les inserts. Fixez les cultures en 4 oC pendant 20 minutes pendant le basculement.
    2. Après fixation de 20 min, retirez PFA des cultures dans un capot de fumée et lavez les cultures avec 1x PBS en ajoutant 200 L dans les puits et 100 l dans les inserts.
    3. Répéter les lavages 3x, 10 min chacun, tout en bascule. Ensuite, procéder à l’immunostaining.
      REMARQUE : Toutes les étapes de lavage sont effectuées sur un banc à RT.
  2. Diluer les anticorps primaires (anti-VE-Cadherin, anti-ERG 1/2/3) dans la solution de blocage (sérum d’âne de 5%, 0,5% PBT). Ajouter 300 L de solution d’anticorps primaires (200 l dans les puits inférieurs et 100 l dans les inserts). Incuber les cultures dans les anticorps primaires pendant la nuit à 4 oC tout en bascule.
    REMARQUE : L’anti-VE-Cadherin est utilisé pour étiqueter la membrane de cellules endothéliales et anti-ERG 1/2/3 est utilisé pour étiqueter le noyau de cellules endothéliales afin de visualiser les germes angiogéniques des cellules endotéliales.
  3. Le lendemain, laver et bercer les plaques de culture 10x en 0,5% PBT, en changeant PBT toutes les 10 minutes.
  4. Diluer les anticorps secondaires (âne anti-rat Alexa Fluor 488 et âne anti-lapin Alexa Fluor 555) en bloquant la solution. Ajoutez 300 l d’anticorps secondaires comme à l’étape 8.2 et incuber les cultures pendant la nuit à 4 oC tout en se balançant. Le lendemain, laver les anticorps secondaires 10x en PBT, en changeant PBT toutes les 10 minutes.
    REMARQUE : Laver un minimum de 10x, mais plus de lavages sont meilleurs. Une fois les lavages terminés, les cultures peuvent être stockées avec 1x PBS jusqu’à ce qu’elles soient montées sur des toboggans.

9. Montage des cultures sur les diapositives, l’imagerie et l’analyse

REMARQUE : Avant de commencer, assurez-vous d’avoir l’équipement et les réactifs suivants : forceps fins, diapositives, milieu de montage avec 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), coverlips, et microscope confocal. Après la coloration secondaire des anticorps, monter les cultures sur des diapositives pour l’imagerie en utilisant les étapes suivantes.

  1. Décollez soigneusement la membrane de l’insert à l’aide de forceps fins et transférez-le sur les diapositives en posant le côté de la membrane vers le bas et en plaçant les cultures explantées vers le haut. Placez les échantillons de réplique dans les mêmes diapositives et étiquetez les diapositives comme commandeur ou VEGF-A. Ajouter quelques gouttes de support de montage avec DAPI directement sur la membrane et couvrir les diapositives avec des feuillets de couverture.
    REMARQUE : Assurez-vous d’éviter les bulles d’air tout en plaçant les coverlips.
  2. Sceller les bords des toboggans avec du vernis à ongles clair et laisser sécher.
    REMARQUE : Les diapositives peuvent être stockées dans -20 oC pour le stockage à long terme.
  3. Diapositives d’image utilisant un microscope confocal.
  4. Effectuez l’analyse pour mesurer la longueur de la excroissance angiogénique. Quantifier la longueur de la excroissance angiogénique en mesurant la distance des cellules endothéliales (Ve-CadherinMD/ERG 1/2/3) étendues à partir de la limite intérieure des cellules ERG 1/2/3 dans les cultures ventricules et à partir du centre des explantations SV dans les cultures SV.
    1. Pour effectuer la quantification à l’aide de FIJI/ImageJ, téléchargez d’abord le logiciel FIJI.
    2. Fichiers d’images ouvertes dans FIJI: aller au fichier (fr) Ouvert Dossier Nom de fichier (fr) Ouvrez.
    3. Aller à l’analyse (fr) Mesures d’ensemble Sélectionnez Perimeter.
    4. Sélectionnez l’outil Straight Line à partir de la fenêtre principale.
    5. Tracez une ligne sur toute la longueur d’un germe tel que suggéré dans l’étape 9.4.
    6. Aller à l’analyse (fr) Mesure.
      REMARQUE : Des mesures de longueur sont affichées dans la nouvelle fenêtre.
    7. Effectuez la quantification dans des images qui représentent au moins trois champs de vision choisis au hasard. Moyenne des mesures de longueur des germes et les signaler comme moyen d’écart standard.

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Résultats

Une des caractéristiques les plus frappantes de l’angiogenèse SV in vivo est qu’il suit une voie spécifique et implique la dénduisation cellulaire et les événements de redifferentiation qui se produisent à des moments stéréotypés et les positions1. Au fur et à mesure que les cellules SV initiales se développent sur le ventricule cardiaque, elles cessent de produire des marqueurs veineux tels que LE COUP-TFII(figure 7). Par la suite, le...

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Discussion

Quelques-unes des étapes les plus critiques pour la croissance réussie des vaisseaux coronaires des tissus progéniteurs SV et Endo sont : 1) Identifier correctement et isoler le tissu SV pour la culture SV ; 2) en utilisant des ventricules d’embryons âgés de 11 à 11,5 ans pour une culture précise d’Endo; 3) maintenir des conditions stériles tout au long de la période de dissection et garder les tissus froids en tout temps; et 4) garder les explants attachés à la membrane enduite ECM pour éviter que les tissus flottent da...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Les auteurs remercient les membres du laboratoire Sharma d’avoir fourni un environnement de recherche favorable. Nous tenons à remercier tout particulièrement Diane (Dee) R. Hoffman qui entretient et prend soin de notre colonie de souris. Nous tenons également à remercier les Drs Philip J. Smaldino et Carolyn Vann d’avoir soigneusement relu le manuscrit et d’avoir fourni des commentaires utiles. Ce travail a été soutenu par des fonds du Ball State University Provost Office et du Department of Biology à B.S, des fonds de la subvention de recherche senior de l’Académie des sciences de l’Indiana à B.S. et des NIH (RO1-HL128503) et des fonds de la New York Stem Cell Foundation à K.R.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Boîte de culture tissulaire 100 x 20 MMFisher Scientific877222Désignée dans le protocole sous le nom de boîte de Pétri
Plaques à 24 puitsFisher Scientific08-772-51
8.0 uM Inserts de culture membranaire PETMillipore SigmaMCEP24H48
Alexa Fluor Donkey anti-lapin 555Fisher ScientificA31572Anticorps secondaire
Alexa Fluor Donkey anti-rat 488Fisher ScientificA21206Anticorps secondaire
Sonde métallique inclinéeOutils scientifiques fins10088-15Coudé 45 degrés, utilisé pour détecter les bouchons profonds
Anticorps anti-ERG 1/2/3AbcamAb92513Anticorps primaire
Anticorps anti-VE-CadhérineFisher ScientificBDB550548Anticorps primaire, fabricant BD BioSciences
Réservoir de gaz CO2Divers fournisseursN/A
CO2 IncubateurFisher Scientific13998223For 37 ° ; C, 5 % CO2 Incubation
Dissection stéréomicrosopeLeicaS9iLeica S9i
Stéréomicroscope EBM-2 milieu basalLonzaCC-3156Croissance des cellules endothéliales milieu basal
Solution ECMCorning354230Connu commercialement sous le nom de Matrigel
EGM-2 MV Singlequots KitLonzaCC-4147Kit de supplément de cellules endothéliales microvasculaires ; Ceci est mélangé dans l’EBM-2 pour faire le milieu complet EGM-2
Sérum de veau fœtal (FBS)Fisher ScientificSH3007003IR
FiJiNIHNALogiciel de traitement d’images (https://imagej.net/Fiji/Downloads)
Fine ForcepsOutils de science fine11412-11Utilisé pour l’embryon dissection
Fisherbrand Ciseaux opératoires à lame droiteFisher Scientific13-808-4
Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X)Fisher ScientificSH-302-5601LR
Capot de culture tissulaire à flux laminaireFisher Scientificdifférents modèles disponibles
Montage MediumVector LaboratoriesH-1200Vectashield avec DAPI
Paraformaldéhyde (PFA)Microscopie électronique/Fisher50-980-494Ceci est disponible à 32 %; doit être dilué à 4
Cuillère perforéeOutils de sciences fines10370-18Utile pour retirer des embryons/tissus d’une solution
Murin recombinant VEGF-A 165PeproTech450-32
Pince standard, Dumont #5Outils de sciences fines11251-30
Sure-Seal Chambre pour souris/ratsEasysystemincEZ-1785Chambre d’euthanasie
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Références

  1. Red-Horse, K., et al. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
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