Fourni ici est un protocole qui détaille les étapes pour établir un modèle animal de la douleur chronique post-ischémie (CPIP). C'est un modèle bien-reconnu imitant le type régional humain de syndrome de douleur-I. Les hypersensibilités mécaniques et thermiques sont davantage évaluées, ainsi que les comportements nocifensives induits par la capsaïcine observés dans le modèle de rat CPIP.
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Article de méthode
Modèle chronique de douleur de poteau-ischémie pour le syndrome régional complexe de douleur type-I chez les rats
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Le type régional complexe de syndrome de douleur-I (CRPS-I) est une maladie neurologique qui cause la douleur grave parmi des patients et demeure une condition médicale non résolue. Cependant, les mécanismes sous-jacents de CRPS-I n'ont pas encore été révélés. On sait que l'ischémie/réperfusion est l'un des principaux facteurs qui causent LE CRPS-I. Au moyen d'une ischémie prolongée et d'une réperfusion du membre postérieur, le modèle de douleur chronique de rat post-ischémie (CPIP) a été établi pour imiter CRPS-I. Le modèle CPIP est devenu un modèle animal bien connu pour l'étude des mécanismes du CRPS-I. Ce protocole décrit les procédures détaillées impliquées dans l'établissement du modèle de rat du CPIP, y compris l'anesthésie, suivie de l'ischémie/reperfusion du membre postérieur. Les caractéristiques du modèle CPIP rat sont encore évaluées en mesurant les hypersensibilités mécaniques et thermiques du membre postérieur ainsi que les réponses à l'injection de capsaïcine aigu. Le modèle de CPIP de rat montre plusieurs manifestations CRPS-I-like, y compris l'oedème et l'hyperémie de membre postérieur dans le stade tôt après établissement, les hypersensibilités thermiques et mécaniques persistantes, et les réponses accrues à l'injection aigue de noréenicie. Ces caractéristiques en font un modèle animal approprié pour une étude plus approfondie des mécanismes impliqués dans le SCRS-I.
Introduction
Le syndrome de douleur régional complexe (SCR) rétorque des symptômes complexes et chroniques de douleur résultant de fractures, de traumatismes, de chirurgie, d'ischémie ou de lésions nerveuses1,2,3. Le SCREst est classé en 2 sous-catégories : CRPS type I et type II (CRPS-I et CRPS-II)4. Les études épidémiologiques ont révélé que la prévalence du SCrS était d'environ 1:20005. LE CRPS-I, qui ne présente aucun dommage nerveux évident, peut entraîner une douleur chronique et affecter considérablement la qualité de vie des patients. Les traitements actuellement disponibles montrent des effets thérapeutiques inadéquats. Par conséquent, le SCRS-I demeure un problème clinique important et difficile qui doit être réglé.
L'établissement d'un modèle animal préclinique imitant le CRPS-I est crucial pour explorer les mécanismes sous-jacents crPS-I. Afin de régler ce problème, Coderre et coll. ont conçu un modèle de rat en appliquant une ischémie prolongée et une réperfusion au membre postérieur pour récapituler le CRPS-I6. On sait que les lésions ischémiques/réperfusion sont l'une des principales causes de CRPS-I7. Le modèle de CPIP de rat présente beaucoup de CRPS-I-comme des symptômes, qui incluent l'oedème de membre arrière et l'hyperémie dans le stade tôt après établissement de modèle, suiviavec les hypersensibilités thermiques et mécaniques persistantes6. Avec l'aide de ce modèle, il est proposé que la sensibilisation centrale de douleur, l'activation périphérique de canal TRPA1 et la génération réactive d'espèces d'oxygène, etc. contribuent à CRPS-I8,9,10. Nous avons récemment établi avec succès le modèle de rat de CPIP et avons exécuté le séquençage d'ARN des ganglions de racine dorsal (DRGs) qui innervate la patte postérieure affectée11. Nous avons découvert quelques mécanismes potentiels qui sont probablement impliqués dans la médiation des hypersensibilités de douleur de CRPS-I11. Nous avons également identifié le canal vanilloid 1 (TRPV1) potentiel de récepteur transitoire dans les neurones DRG comme un contributeur important aux hypersensibilités mécaniques et thermiques de CRPS-I12.
Dans cette étude, nous avons décrit les procédures détaillées impliquées dans l'établissement du modèle de rat de CPIP. Nous avons en outre évalué le modèle cPIP de rat en mesurant les hypersensibilités mécaniques et thermiques aussi bien que sa réactivité au défi aigu de capsaïcine. Nous proposons que le modèle de Rat CPIP puisse être un modèle animal fiable pour une étude plus approfondie des mécanismes impliqués dans CRPS-I.
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Protocole
Les protocoles animaux ont été approuvés par le Zhejiang Chinese Medical University Animal Ethics Committee.
1. Animaux
- Obtenir des rats mâles Sprague-Dawley (SD) (280-320 g, 8-10 semaines d'âge) de Shanghai Laboratory Animal Center. Abritez les animaux dans le Zhejiang Chinese Medical University Laboratory Animal Center. Notez que les conditions de reproduction doivent inclure des cycles de lumière/obscurité de 12 h/2 h et maintenir la température constante à 24 oC. Fournir de l'eau et de la nourriture ad libitum. Notez qu'un total de 48 rats sont utilisés dans cette étude. Une note, dans ce modèle, nous avons besoin d'observer la réponse de douleur pendant tout le processus. Si des analgésiques sont appliqués, nous ne pouvons pas établir avec succès le modèle de la douleur. Après les expériences, les rats sont sacrifiés.
2. Établissement modèle CPIP
- Anesthésiez tous les rats (y compris les groupes modèles fictifs et CPIP) avec du phénobarbital de sodium (50 mg/kg, injection intrapéritone [i.p.]). Maintenir l'anesthésie avec jusqu'à 20 mg/kg/h phénobarbital [i.p.], si nécessaire. Vérifiez les réflexes de chaque animal en pinçant sa patte postérieure ou l'extrémité de la queue à l'aide de forceps. Assurez-vous que les rats ne sont pas réactifs avant l'établissement du modèle. Placez la pommade vétérinaire sur les yeux pour éviter la sécheresse pendant la procédure. Placer les rats anesthésiés sur un coussinet chauffé maintenu à 37 oC pour la procédure suivante.
-
Ischémie et réperfusion de la patte postérieure
- Lubrifier la patte arrière droite et la cheville avec du glycérol une fois que le rat est anesthésié.
- Faites glisser un anneau Intérieur Nitrile 70 Durometer d'un diamètre interne de 7/32 po (5,5 mm) sur le côté plus grand d'un tube Eppendorf de 1,5 ml (avec le bouchon de rupture coupé avant utilisation). Insérez soigneusement la patte postérieure dans le tube creux d'Eppendorf jusqu'à ce qu'elle atteigne le fond.
- Faites glisser graduellement l'anneau O du tube au membre arrière droit près de l'articulation de la cheville et placez-le pendant 3 h. Appliquez le même traitement à un groupe fictif de rats, sauf qu'un anneau O cassé, qui est coupé et ne devrait pas induire une ischémie, doit être placé autour de la cheville.
- Couper l'anneau O 3 h après l'étape d'ischémie. Surveillez attentivement le rat jusqu'à ce qu'il retrouve suffisamment de conscience pour maintenir la charge sternale. Notez que le rat qui a reçu une anesthésie ne doit pas être remis en compagnie d'autres rats jusqu'à ce qu'il soit complètement récupéré.
3. Tests comportementaux nocifs
- Placez le rat dans une chambre en plexiglas transparente qui est assis sur un plancher en maille. Habituez le rat pendant 0,5 h avant tout test comportemental.
-
Allodynie mécanique
- Utilisez les filaments von Frey (0,4, 0,6, 1,0, 2,0, 4,0, 6,0, 8,0, 15,0 et 26,0 g de filaments) pour le test. Commencez le test à partir du filament moyen (4,0 g). Appliquer verticalement les filaments sur la surface plantaire du milieu de la patte postérieure. Appliquer légèrement la force appropriée pour plier le filament jusqu'à 5 s. Une rétraction soudaine de la patte postérieure en réponse aux stimuli est considérée comme un comportement nocifensive. Effectuer le test d'allodynie mécanique les jours -3, -2, -1, et tous les deux jours jusqu'au jour 13.
- Appliquer la méthode de test vers le haut pour tester le seuil. Appliquer la méthode Dixon pour calculer le seuil de retrait des pattes de 50 % (PWT)13,14,15.
-
Hyperalgésie thermique
- Utilisez la méthode Hargreaves pour examiner l'hyperalgésie thermique. Visez directement le faisceau lumineux émis par une ampoule (50 W) sur la patte postérieure pour mesurer la latence de retrait de la patte (PWL). Définir 20 s comme seuil de coupure pour éviter les blessures excessives causées par le chauffage.
- Répétez chaque test 3x en 5 min d'intervalles pour chaque patte postérieure. Prenez la moyenne de ces trois tests comme le PWL de chaque rat16. Effectuez le test d'hyperalgésie thermique les jours -3, -2, -1, et tous les deux jours jusqu'au jour 13.
-
Comportement nocifensive aigu induit par la capsaïcine
- Préparer la solution de stock de capsaïcine (200 mM) à l'aide de sulfoxide de diméthyle (DMSO) et diluer davantage à 1:1000 dans la saline stérile tamponnée par phosphate (PBS) pour l'injection de patte arrière. La concentration finale de DMSO dans PBS est de 0,1% (le véhicule contient 0,1% de DMSO dans PBS seulement). Injecter de la capsaïcine ou du véhicule dans la patte postérieure (injection intraplantaire) à un volume de 50 L à l'aide d'une aiguille de 30 G fixée à une seringue de 1 ml.
- Enregistrez le comportement nocifensive (c.-à-d., lécher, mordre, ou broncher de la patte injectée) à l'aide d'une caméra vidéo pendant 10 min juste après l'injection et quantifié e par la suite comme précédemment décrit17,18,19.
- Évaluation de l'œdème de patte postérieure : Évaluer l'oeème postérieur de patte en mesurant l'augmentation du diamètre de patte. Mesurez avec un étrier numérique et calculez la différence entre la valeur basale et la valeur d'essai observée à différents moments. Évaluer les changements dans l'épaisseur des pattes à 15 min, 24 h, 48 h et 72 h après l'établissement du modèle.
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Résultats
Après avoir placé l'anneau O sur la cheville, la peau ipsilatérale de la patte postérieure a montré une cyanose, une indication de l'hypoxie tissulaire (Figure 1A). Après avoir coupé l'anneau O, la patte postérieure ipsilatérale a commencé à se remplir de sang et a montré un gonflement robuste, qui a démontré un signe intense d'hyperémie (Figure 1A). L'enflure de patte a graduellement diminué et est revenue à la normale 48 h apr...
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Discussion
Ce protocole décrit les méthodes détaillées pour établir un modèle de CPIP de rat en appliquant l'ischémie/reperfusion aux membres postérieurs des rats. Il s'agit de l'évaluation de l'apparence des membres postérieurs, de l'œdème, des hypersensibilités mécaniques/thermiques et des comportements aigus nocifensives en réponse à l'injection de capsaïcine.
L'ischémie/réperfusion des membres est un facteur commun contribuant au CRPS-I chez les patients humains12. Ce protocol...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts dans ce travail.
Remerciements
Ce projet a été parrainé par la National Natural Science Foundation of China (81873365 et 81603676), les Fonds provinciaux de sciences naturelles du Zhejiang pour les jeunes chercheurs distingués (LR17H270001) et les fonds de recherche de l'Université médicale chinoise du Zhejiang ( T2019J01, 2018ZY37, 2018ZY19).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tube Eppendorf de 1,5 ml | Eppendorf | 22431021 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D1435 | |
| Capsaïcine | APEXBIO | A3278 | |
| Pied à coulisse numérique | Meinaite | NA | |
| Joint | torique Joints toriques | Nitrile Ouest 70 Duromètre | 7/32 po diamètre intérieur |
| Appareil d’essai plantaire | UGO Basile, Italie | 37370 | |
| von Frey filaments | UGO Basile, Italie | NC12775 |
Références
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