Article de méthode

Une méthode de sortie élevée pour isoler les péricartétes cérébraux de la souris

DOI :

10.3791/60588

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14 janvier 2020

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1Laboratory of the Blood Brain Barrier, University of Artois, 2Department of Neurology, Universitätsmedizin Mannheim, Heidelberg University

Dans cet article

Résumé

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Nous présentons un protocole pour l'extraction des péritéytes cérébraux murines. Basé sur une extraction de périyte orientée vers l'enrichissement sans antibiotiques, ce protocole est un outil précieux pour les études in vitro offrant une pureté élevée et un rendement élevé, diminuant ainsi le nombre d'animaux expérimentaux utilisés.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ces dernières années, les péritéytes cérébraux sont devenus le centre de recherches approfondies en biologie vasculaire et en pathologie. L'importance des péritéytes dans la formation et la physiologie de barrière de cerveau-encéphalique est maintenant démontrée mais sa base moléculaire demeure largement inconnue. Comme le rôle pathophysiologique des péritéytes cérébraux dans les troubles neurologiques est intrigant et d'une grande importance, les modèles in vitro sont non seulement suffisamment appropriés, mais aussi en mesure d'intégrer différentes techniques pour ces études. Plusieurs méthodes ont été proposées comme modèles in vitro pour l'extraction des péricartes cérébraux, bien qu'un protocole sans antibiotiques avec un rendement élevé soit souhaitable. Plus important encore, une méthode qui a augmenté la production par extraction réduit l'utilisation de plus d'animaux.

Ici, nous proposons une méthode simple et efficace pour extraire les péricytes cérébraux avec une production suffisamment élevée. L'homogénéité du tissu cérébral de la souris est mélangée à une solution BSA-dextran pour la séparation des débris tissulaires et des granulés microvasculaires. Nous proposons une séparation en trois étapes suivie d'une filtration pour obtenir un filtrate riche en micronavires. Avec cette méthode, la quantité de fragments microvasculaires obtenus à partir de 10 souris est suffisante pour ensemencer 9 puits (9,6 cm2 chacun) d'une plaque de 6 puits. Plus intéressant avec ce protocole, l'utilisateur peut obtenir 27 puits riches en périytes (9,6 cm2 chacun) dans le passage 2. La pureté des cultures péririytes est confirmée par l'expression de marqueurs péritéytes classiques : NG2, PDGFR-et CD146. Cette méthode démontre un outil in vitro efficace et faisable pour les études physiologiques et pathophysiologiques sur les péritéytes.

Introduction

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Les péritéytes cérébraux sont un composant essentiel de l'unité neurovasculaire (NVU), qui comprend une unité fonctionnelle avec les cellules endothéliales cérébrales de la barrière hémato-encéphalique (BBB), des cellules gliales, de la matrice extracellulaire et des neurones. Les péricartétes sont une partie essentielle du fonctionnement réglementé du système nerveux central (SNC) car ils servent d'interfaces pour l'échange d'informations moléculaires et cellulaires.

Les péritéytes cérébraux sont incorporés dans le côté abluminal des microvaisseaux cérébraux, et sont essentiels pour établir1 et maintenir2 la physiologie de BBB. Plusieurs travaux récents ont également mis en évidence le rôle des péritéytes cérébraux dans l'angiogenèse3 et la maturation des vaisseaux4, morphogénèse endothéliale5 et la survie6, et dans le contrôle du métabolisme du cholestérol du cerveau7. Fait important, la dysrégulation dans l'un de ces processus sont des caractéristiques étiologiques des maladies neurodégénératives.

En effet, les périytes sont une nécessité fonctionnelle pour le fonctionnement normal de BBB et sa protection contre la progression de plusieurs maladies neurologiques. La physiologie dégénérative et la perte des péritéytes sont des dénominateurs communs dans la progression de la maladie d'Alzheimer8, perte neuronale pendant le dysfonctionnement de la matière blanche9, sclérose en plaques10, encéphalopathie septique11, phase aigue accident vasculaire cérébral ischémique12 et dans d'autres troubles neurologiques. Les péricartes sont également instrumentés dans la métaste tumorale13. Intéressant, les péritéytes ont également été montrés pour montrer un rôle de sauvetage après trauma et désordres neurologiques : dans la remyelination dans le cerveau1,course ischémique, dommages de moelle épinière14 et favorisant l'angiogenèse15. La susceptibilité des péricartes pour renforcer la manifestation pathophysiologique des traumatismes et des désordres neurologiques en fait une cible thérapeutique potentielle16.

Les modèles de recherche in vitro des périytes dans le BBB sont des outils importants pour mener des études approfondies. Ces modèles fournissent une plate-forme pour des études plus élaborées en représentant des modèles de travail de la BBB et plus encore. Par exemple, ces modèles peuvent être utilisés pour comprendre la physiologie cellulaire chez les péricytes et parmi d'autres types de cellules de la NVU. En outre, les modèles in vitro sont des outils d'investigation de première main pour tester l'influence pharmacologique de nouveaux médicaments et molécules sur les péritéytes. Ces modèles peuvent également être utilisés pour comprendre le rôle pathophysiologique des périticytes par rapport aux troubles neurologiques. Néanmoins, le développement de modèles in vitro nécessite une production accrue pour permettre la liberté expérimentale. Ces modèles doivent être faciles et rapides, et réduire le nombre d'animaux expérimentaux utilisés. En outre, la capacité de développer de tels modèles dans un modèle de culture à deux et triple cellules est souhaitable.

Il y a beaucoup de protocoles qui ont été développés. Les protocoles proposés par Tigges et coll.17, Chen et coll.18, Thomsen etal. 19, Yamazaki et coll.20, et Crouch et Doetsch21 sont des approches louables qui satisfont la plupart des nécessités. Toutes ces méthodes donnent des résultats efficaces, mais la dépendance à un grand nombre d'animaux expérimentaux reste un dénominateur commun pour ces protocoles. Par conséquent, il devient obligatoire de développer une méthode de sortie élevée qui peut isoler et purifier les périrites avec un maximum d'efficacité possible. Dans ce protocole, la pureté des cellules obtenues après un deuxième passage est vérifiée avec plusieurs marqueurs de péritéytes. Nous avons vérifié pour le récepteur de facteur de croissance dérivé de plaquettes (PDGFR- - ' ), qui est employé comme marqueur classique des péritéytes17,et pour NG2 (antigène neuron-glial 2), qui est un marqueur de la morphogenèse vasculaire médiée de périyte22 et de la vascularisation23. Nous avons également vérifié le cluster de différenciation 146 (CD 146), qui a été rapporté comme l'une des molécules exprimées dans les péritéytes17,18.

Ici, nous présentons un protocole pour l'extraction des péritytes primaires à partir de souris (type sauvage ou transgénique) qui satisfera toutes les exigences susmentionnées avec une production élevée. Nous employons une méthode de sélection libre d'antibiotiques et d'immunopanning pour les périytes cérébraux primaires, qui se révélera un modèle efficace pour mener des études in vitro.

Protocole

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Toutes les expériences ont été réalisées selon les directives de l'Institut sur l'utilisation et la manipulation des animaux. Conformément à la législation Français, l'établissement animalier de l'Université d'Artois a été approuvé par les autorités locales (référence: B62-498-5). Conformément à la législation de l'Union européenne (directive 2010/63/UE), toutes les procédures ont été approuvées par le comité local de soins et d'utilisation des animaux (Comité d'Ethique en Expérimentation Animale du Nord-Pas-de-Calais, référence: C2EA 75) et le ministère Français de la Recherche (référence: 2015090115412152).

1. Préparation des solutions

  1. Préparer 500 ml de tampon de lavage A (WBA) : 10 mM de solution HEPES dans la solution de sel équilibré de Hank (HBSS). Conserver à 4 oC.
  2. Préparer 500 ml de tampon de lavage B (WBB) : 0,1 % d'albumine bovine (BSA) avec une solution HEPES de 10 mM en HBSS. Conserver à 4 oC.
  3. Préparer 300 ml de solution de dextran à 30 % en WBA en mélangeant la solution pendant la nuit à température ambiante. Autoclave la solution à 110 oC pendant 30 min avant utilisation. Après l'autoclage, laisser reposer la solution à température ambiante pendant 2-3 h. Conserver la solution à 4 oC.
  4. Préparer 100 mL de solution BSA de 0,1 % dans une solution dextran froide. Agiter vigoureusement pendant 3-4 min et conserver à 4 oC.
  5. Préparer le média culturel complet du Moyen Aigle Modifié (DMEM) de Dulbecco en dissolvant 20 % de sérum de veau, 2 mM de glutamine, 50 g/mL de gentamycine, 1 % de vitamines, 2 % d'acides aminés Basal Medium Eagle (BME) dans les médias Et store basal DMEM à 4 oC. Ajouter 1 ng/mL Facteur de croissance de base du fibroblaste (bFGF) avant d'être utilisé.
  6. Préparer les médias péritéytes complets en ajoutant des suppléments de croissance périyte (fourni avec le média péritéyte) et 20% de sérum de veau fœtal (FCS) dans les médias basiques de culture péritéyte et stocker à 4 oC.

2. Récupération et ablation des tissus cérébraux

  1. Pour la cohérence, utilisez des souris d'âge et de même sexe dans chaque lot d'extraction. Utilisez un refuge pour animaux exempt d'agents pathogènes et offrez un accès ad libitum à l'eau. Pour assurer l'efficacité et l'utilisation minimale des animaux, évitez la perte de tissu.
  2. Euthanasieciser C57BL/6J, 4-6 semaines, souris mâles (laboratoires Janvier, Le Genest-Saint-Isle, France).
  3. Excisez rapidement le tissu cérébral dans des conditions stériles, éviter tout dommage au tissu. Placez soigneusement le tissu dans 40 ml de phosphate froid tamponné salin (PBS).
  4. Transférer le tissu cérébral dans le PBS froid dans un plat Petri (100 mm x 15 mm).
  5. Placez le tissu cérébral sur une lingette stérile sans matière sèche et avec des forceps incurvés, retirez le cervelet, le striatum et les nerfs occipitaux.
    1. Retirer tous les méninges visibles à l'eau de coton. Placez le tissu cérébral à l'envers et ouvrez les lobes à l'aide d'un coton-tige à l'aide de traits de lumière vers l'extérieur. Enlever tous les vaisseaux sanguins visibles.
    2. Placer les méninges tissu cérébral libre dans un plat Petri (100 mm x 15 mm) avec 15 ml de WBB froid.

3. Homogénéisation

  1. Transférer le tissu dans un tube de mortier de broyeur de tissu Dounce et ajouter 3-4 ml de WBB avec des forceps.
  2. Émincer le tissu avec un pilon «lâche» 55 fois. Rincer le pilon 'lâche' avec WBB. Maintenant, hacher la boue avec un pilon "serré" 25 fois.
  3. Diviser la boue également en deux tubes de 50 ml et ajouter 1,5 x volume de BSA-dextran froid de 30 %, en secouant vigoureusement les tubes pour mélanger la boue.

4. Isolement de la fraction vasculaire

  1. Après avoir vigoureusement secoué les tubes, centrifuger les tubes pendant 25 min à 3 000 x g et 4 oC.
  2. Transférer le supernatant (avec la couche supérieure de myéline) dans 2 nouveaux tubes, et centrifuger les tubes pendant 25 min à 3 000 x g et 4 oC. Préserver les granulés de la première centrifugation en ajoutant 3 ml de WBB froid (garder la pastille à 4 oC).
  3. Répétez l'étape 4.2 et conservez soigneusement les granulés à partir de 2nd centrifugation.
  4. Jeter le dextran et la myéline avec des débris de tissu des tubes de l'étape 4.3. Préserver les granulés dans le WBB froid.
  5. Mettre en commun le contenu du tube 1 et du tube 2 à partir de l'étape 4.1 et faire jusqu'au volume final de 10 ml avec wBB froid.
  6. Répétez cette étape pour les tubes de l'étape 4.2 et l'étape 4.3.
    REMARQUE: Enfin, il ya 3 tubes de 3 centrifugations.
  7. Dissocier la pastille avec 6 coups de haut en bas à l'aide d'une pipette de 10 ml, jusqu'à ce qu'il ne reste plus d'amas visibles des granulés.
  8. À l'aide d'un ensemble de filtre à vide et du filtre à mailles en nylon, filtrez les suspensions cellulaires de chaque tube.
    REMARQUE : Cette étape de filtration est importante afin d'enlever les récipients plus longs/plus grands par l'intermédiaire du filtre de maille.
  9. Récupérer et resuspendre les capillaires en grattant le filtre à l'aide d'un forceps à pointe plate ou d'un grattoir en WBB à température ambiante. Filtrer la suspension avec un filtre frais pour récupérer plus de capillaires
  10. Diviser le filtrate également en deux tubes et centrifugeuse pendant 7 min à 1 000 x g et RT.
    REMARQUE : Au cours de cette étape de centrifugation, préparez la solution enzymatique. Déterminer le volume de WBB requis en fonction du nombre d'animaux utilisés (voir Tableau des matériaux). Ajouter 1x de DNase 1 et 1x de Tosyl-L-lysyl-chloromethane hydrochlorure (TLCK) (voir Tableau des matériaux) en WBB et pré-chaud à 37 oC.
  11. Recueillir les granulés de l'étape 4.10 dans un tube avec WBB pré-chauffé avec des enzymes. Ajouter la collagène/dispase 1x préréchauffée. Placez le tube dans le bain d'eau de la table tremblante à 37 oC pour exactement 33 min.
  12. Arrêter la réaction enzymatique en ajoutant 30 ml de WBB froid. Centrifugelas la suspension pendant 7 min à 1 000 x g et RT.
  13. Jeter le supernatant soigneusement et dissocier la pastille dans WBB avec 6 coups de haut en bas à l'aide d'une pipette de 10 ml. Cette étape devrait être moins rigoureuse et relativement plus rapide.
  14. Centrifugelas la suspension pendant 7 min à 1 000 x g et RT.
    REMARQUE : Au cours de cette étape, jetez le revêtement des plats de culture et rincez-les une fois avec DMEM à température ambiante. Coat cell culture plats pour au moins 1 h à RT.
  15. Jeter le supernatant du tube obtenu à l'étape 4.14, et dissocier la pastille dans un nouveau support Complet DMEM, plaquer les cellules (Jour 0, P0) dans 9 puits de plaques de 6 puits (1 puits de 9,6 cm2 chacun).

5. Prolifération des péritéytes cérébraux

  1. Maintenir les cultures cellulaires à 37 oC et 5 % de CO2 dans un incubateur stérile. Remplacer le support culturel après 24 h (jour 1) de placage des cellules en enlevant soigneusement les débris. Après le premier jour, changez les médias culturels à chaque 48 h.
  2. Observez la culture cellulaire pendant au moins 7-8 jours. D'ici là, les excroissances cellulaires sur le dessus de l'unicouche endothéliale devraient être observables.
  3. Passer les cellules le jour 8-10 (selon la confluence) dans le milieu de culture de périyte au passage 1 (P1) sur des plaques de culture enduites de gélatine. Changer les médias culturels tous les 2 jours. Observez les cellules pendant 6-7 jours. Les cellules sont divisées consécutivement à nouveau au passage 2 (P2) le jour 17 [et passage 3 (P3) le jour 24 seulement si nécessaire], cultivées dans le milieu de périyte dans des plaques enduites de gélatine.
    REMARQUE : Les cellules doivent être prêtes pour des expériences/observation à une durée de confluence de près de 80 à 90 %.

Résultats

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Ce protocole (figure 1) donne efficacement 9 puits (sur 6 plaques de puits) au moment de l'ensemencement à P0(figure 2A (P0 : Jour 1)).

De P0 à P2, il existe des caractéristiques morphologiques spécifiques par lesquelles les cellules endothéliales (indiquées par des flèches blanches) et l'augmentation progressive des péririytes (indiquées par des flèches noires) peuvent être observées. En P0, les cellules endothéliales allongées qui se développent à partir de micronavires sont en abondance (Figure 2A, P0: Jour 3), tandis que l'abondance de ces cellules allongées est réduite en P1 et absente en P2. Au contraire, les péritéytes apparaissent comme des cellules quadrilatérales qui sont abondantes en P2 (Figure 2A, P2: Jour 18).

Pour confirmer la pureté de la culture péritéyte en P2, nous avons vérifié l'expression de NG2, CD146 et PDGFR-bêta comme marqueurs périytes à l'aide de PCR quantitatif (Figure 2B), immunocytochemistry (Figure 2C), et western blot ( Figure3). Les péricytes en P2 expriment des niveaux plus élevés de CD146, NG2 et PDGFR-MD par rapport à l'expression dans le cerveau total de souris (Mme Br) extrait. Comme contrôle, l'expression des marqueurs endothéliaux Occludin et CD31, le marqueur d'astrocytes Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) et le marqueur de microglies CD11b ont également été observés absents dans P2.

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Figure 1 : Résumé du protocole. Ce contour représente des étapes critiques pour l'extraction de péricartéquis qui commence par la désintégration des tissus avec le broyeur de pilon en verre suivi d'une séparation en 3 étapes dans le dextran et la filtration. Ce protocole utilise une étape de digestion enzymatique de 33 min. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 2 : Morphologie des cellules et expression des marqueurs. (A) Images de contraste de phase des péricartes dans les étapes P0, P1 et P2 de la prolifération. Les cellules endothéliales abondantes dans P0 sont indiquées par des flèches blanches. Leur nombre a diminué en P1 et ils ont disparu en P2. Les péricartes sont indiqués par des flèches noires. (B) Analyse de l'expression CD146, NG2 et PDGFR-MD par PCR en périytes en P2 avec des péritéytes dans des échantillons de p1 et de cerveau de souris (Mme Br). (C) Images représentatives de péritéytes en P2 présentant une immunostaining positive de CD146, PDGFR-et, NG2. Barre d'échelle : 50 m (grossissement 20x) et 20 m (grossissement de 40x). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 3 : Pureté représentative des cultures cellulaires. Analyse de l'expression CD146, PDGFR-MD, NG2, Occludin, GFAP, CD31, CD11b et Tubulin par des ballonnements occidentaux dans des péritéytes dans des échantillons de P2 et de cerveau de souris (Mme Br). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 4 : Comparaison représentative des différentes méthodes de désintégration des tissus, de purification, d'enrichissement et de digestion enzymatique. Chaque protocole publié est résumé avec des indications sur le nombre d'animaux utilisés pour chaque protocole. Les résultats sont également indiqués en ce qui concerne le nombre de puits obtenus lors de l'ensemencement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

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Les péricartes cérébraux font partie intégrante de la NVU et jouent un rôle actif dans l'induction et l'entretien du BBB24. De même, le rôle de ces cellules dans les différents troubles neurodégénératifs et pathologies vasculaires est intrigant. Par conséquent, un modèle efficace de cellules péricytes primaires à haut rendement fournira une plate-forme efficace pour les études in vitro.

Divers protocoles ont été proposés pour l'isolement des péricarytes primaires (figure 4). Tigges et coll.17 ont suggéré une méthode comprenant le tissu cortical avec des méninges. Cette approche est la tendreisation des tissus de 6 souris (une digestion de 37 oC, 70 min avec des enzymes papaïnes/DNase) suivie d'une étape de désintégration via 21 G et 18 G aiguilles. Ce protocole suggère une séparation en une étape (centrifugation dans 22% BSA/PBS solution) qui donne au moins 2 collagène i enduit puits d'une plaque de 6 puits. Les cellules sont maintenues dans le milieu de croissance de cellules endothéliales (ECGM) jusqu'au passage 3 et plus tard dans le milieu de croissance de périyte (PGM) pour des cellules de passage pour favoriser la prolifération de périyte. Dans une autre approche similaire, Chen et coll.18 ont proposé la dissociation des tissus en coupant le tissu en dés avec une lame de rasoir stérilisée et une digestion des tissus avec de la collagène/DNase pendant 90 min à 37 oC. Après une séparation en une seule étape (centrifugation dans 22% BSA) des cellules, la couche de myéline est enlevée et la pastille est lavée deux fois dans ECGM. Les micronavires sont plaqués dans 3 puits d'un collagène que j'ai enduit 6 plaques de puits. Après avoir atteint la confluence, les cellules sont passages deux fois et plus tard maintenus dans PGM. En fin de compte, si les cellules sont passées en rapport de 3, nous pouvons obtenir 27 puits de plaques de 6 puits seulement à l'utilisation de 10 souris au début du protocole.

Dans Thomsen et autres, les auteurs suggèrent l'isolement des péricartétes cérébraux par l'intermédiaire d'une digestion en deux étapes d'enzyme19. Les méninges et la matière blanche sont enlevés, et les échantillons de cerveau sont coupés en petits morceaux. Les morceaux de tissu subissent la première réaction enzymatique dans la collagène/DNase I pendant 75 min à 37 oC, après une étape de séparation dans 20% BSA. La pastille est recueillie et digérée en collagène/dispase/DNase I pendant 50 min à 37 oC. Cette étape est suivie d'une séparation micronavire dans un gradient Percoll de 33 % et lavée une fois de plus. Les micronavires sont ensebiens sur du collagène IV/fibronectin enduit de vaisselle de 35 mm. La prolifération des péritéytes est favorisée par 10% FCS et sulfate de gentamicine dans DMEM pendant 10 jours. Dans une autre approche de digestion en deux étapes d'enzyme, Yamazaki et autres suggèrent de mincing du tissu excisé dans le DMEM froid20. Dans la première réaction enzymatique, les échantillons sont traités avec de la collagène/DNase I pendant 75 min à 37 oC. Après une centrifugation d'étape, le granule est à nouveau lavé une fois et une deuxième réaction enzymatique est lancée dans la collagène/dispase pendant 60 min à 37 oC. Après une séparation en une seule étape, le granule est suspendu et centrifugé dans une solution BSA de 22 %. Enfin, le granule microvasculaire est resuspendu et plaqué dans une plaque de 6 puits. Pour 5 cerveaux de souris, 1 puits d'une plaque de 6 puits peut être plaqué. Pour obtenir les péricytes, les cultures endothéliales sont passages trois fois tandis que maintenus dans la cellule endothéliale de cerveau de souris (mBEC) moyen II. Crouch et Doetsch20 suggèrent la méthode de purification de périyte par FACS. Les échantillons de tissus du cortex et de la zone ventriculaire-sous-ventriculaire du cerveau de souris sont micro-disséqués et hachés à fond avec un scalpel. Après l'incubation de l'enzyme collagène/dispase pendant 30 min à 37 oC, le tissu digéré est séparé de la myéline et des débris centrifuges dans une solution Percoll de 22 % v/v. La suspension cellulaire est ensuite incubée dans des anticorps conjugués fluorescents pour l'analyse et le tri FACS. Les cellules triées sont plaquées dans des puits enduits de collagène de 24 plaques de puits. Il est suggéré qu'un cortex donne assez de cellules pour un placage dans 1 puits de la plaque de 24 puits.

Même si elles sont productives, ces méthodes sont assorties de plusieurs limitations, allant de l'utilisation d'un nombre élevé d'animaux pour l'isolement par lots unique à une quantité très limitée de production.

Au cours de l'élaboration de ce protocole proposé, nous avons réussi à obtenir un rendement élevé : 9 puits d'une plaque de 6 puits d'aussi peu que 10 souris. À cette fin, l'enlèvement des méninges assure l'enlèvement d'une étape des grands vaisseaux du tissu. Le broyeur de tissu Dounce est plus approprié pour les tissus mous tels que le cerveau. Il assure également la réduction de l'échantillon avec le pilon lâche, l'homogénéisation avec le pilon serré, et empêche les dommages cellulaires inutiles. L'un des principaux objectifs dans les protocoles de culture cellulaire primaire est le gaspillage minimal de tissu et la récupération prolongée de la vascularisation cérébrale. Dans le protocole présenté, ceci est réalisé par la centrifugation répétitive de l'homogénéisé infusé de tissu dextran-BSA. Une approche de centrifugation en trois étapes aide à récupérer de grandes quantités de vascularisation du tissu homogénéisé. Cela fournit une récupération 3x améliorée des micronavires. Après la séparation, la filtration est la prochaine étape essentielle, qui favorise l'exclusion des grands vaisseaux associés aux cellules musculaires lisses. Comme mentionné précédemment une combinaison de différentes enzymes a été proposée pour la digestion enzymatique. Tandis que le DNase et le collagène/dispase sont employés pour réduire des amas de cellules et isoler des cellules simples respectivement, il est très important de prévenir la mort cellulaire dans un tel environnement invasif et ceci est empêché par TLCK, qui augmente de ce fait le rendement final. Initialement, le premier passage est autorisé à cultiver une monocouche endothéliale, qui soutient plus tard la croissance des péritéytes attachés sur l'unicouche. Puisque la survie des cellules endothéliales primaires est réduite au passage, elle augmente la probabilité pour la récupération de péritéyte. En outre, ce protocole utilise un autre passaging qui assure l'évitement de la contamination des cellules endothéliales. Il convient de noter qu'avec un plus grand nombre de cellules de P2, la dépendance à la poursuite de la passaging des cellules est réduite. En outre, il réduit la possibilité de croissance du périyte étant dépassé par les cellules musculaires lisses, qui prolifèrent sur un taux beaucoup plus élevé.

Afin d'obtenir une production plus élevée, il y a plusieurs étapes qui sont critiques et doivent être exécutées avec précision en ce qui concerne la température et le temps. Le mélange des tissus homogénéisés en BSA-dextran devrait être rapide. La dissociation des granulés après les étapes de centrifugation doit être rapide pour prévenir la mort cellulaire. En outre, 33 min de digestion enzymatique doit être fait avec précision et soin. Une des limitations de ce protocole est la durée de 7-8 jours que l'unicouche endothéliale est autorisé à se développer et à faciliter davantage la croissance des périrites. De toute évidence, l'isolement des micronavires est btter, la croissance de l'unicouche est plus rapide, et donc il ya un nombre accru de périticytes. Il est recommandé de ne pas utiliser moins de 10 souris dans chaque extraction pour assurer un nombre suffisant de fractions microvasculaires pour soutenir la croissance du périyte. Si les points mentionnés ci-dessus sont suivis avec soin, la densité cellulaire désirée pour la culture cérébrale de périyte peut être facilement réalisée.

Les modèles in vitro fournissent une plate-forme réalisable pour le développement de modèles dérivés pour obtenir plus d'informations sur la pertinence pathophysiologique et la communication entre les autres cellules de la NVU pendant les troubles neurologiques. Les péritéytes isolés peuvent être incorporés dans une culture bicellulaire (avec des cellules endothéliales ou gliales) et tricellulaires (cellules endothéliales et gliales). L'élaboration de ces modèles n'a pas été discutée ici. Pour conclure, ce protocole fournit une approche pour l'isolement des cellules primaires avec un rendement plus élevé et une meilleure plate-forme pour la recherche in vitro liée à la biologie du périyte cérébral.

Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

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LT et FG ont été accordés par l'Agence Nationale de la Recherche (ANR, ANR-15-JPWG-0010) dans le cadre du programme conjoint de l'UE - Neurodegenerative Disease Research (JPND) pour le projet SNOWBALL.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Acides aminés BMESigmaB-6766Conserver à 4 ° ;C.
Média DMEM basalInvitrogen316000083Stocker à 4 ° ;C.
Facteur de croissance des fibroblastes de baseSigmaF-0291Se conserve à -20 ° ;C.
BSASigmaA-8412Magasin à 4 ° ;C.
Collagénase dispaseSigma10269638001Préparez une solution mère 10x dans du PBS-CMF stérile. Filtrez la solution avec un 0,22 &mu ; m seringue filtrer et stocker à -20 ° ;C. Remarque : Pour l’étape de digestion enzymatique du protocole, pour chaque ensemble de 10 souris pour l’extraction, 300 µ ; L de 10x dispase de collagénase est nécessaire.
DextranSigma31398
DNase ISigma11284932001Préparez une solution mère 1000X en dissolvant 100 mg dans 10 ml d’eau stérile et conservez-la à -20° ;C.
GélatineSigmaG-2500Préparez l’enrobage de travail en préparant une solution de gélatine à 0,2 % dans du PBS-CMF stérile (8 g/L de NaCl, 0,2 g/L de KCl, 0,2 g/L de KH2PO4, 2,86 g/L de NaHPO4 (12 H2O), pH 7,4). Autoclave la solution pendant au moins 20 minutes à 120 ° ; C et conserver à température ambiante. Boîtes de culture à enrober pendant au moins 4 heures à 4 °C.
GentamycinBiochrom AGA-2712Magasin à 4 ° ;C.
GlutamineMerckI.00289Se conserve à -20 ° ;C.
HBSSSigmaH-8264Magasin au 4 ° ;C.
HEPESSigmaH-0887Magasin au 4 ° ;C.
MatrigelBD Biocoat354230Préparer une solution d’enrobage fonctionnelle de Matrigel en diluant la matière première dans du DMEM froid dans un rapport de 1:48 avec sa concentration finale de 85 & micro ; g/cm2. Les boîtes de culture cellulaire doivent être enrobées au moins 1 heure à température ambiante.
Péricyte Souris moyenneLaboratoires de recherche Sciencell1231Stocker à 4 ° ;C.
Tosyl Lysin Chloromethyl KetoneSigmaT-7254Préparez une solution mère 1000X dans du WBA en dissolvant 16 mg dans 10,88 mL de WBA pour faire une solution de 4 mM et conservez-la à 4 ° ;C.
VitaminesSigmaB-6891Se conservent à -20 ° ;C.
Equipment Requirements
Outils de filtrationSefar, maille de nylon, porosité de 60 microns
Équipement de laboratoirerotor à godets oscillants
Bain-marie avec agitateur
Hotte à flux laminaire : BSL2
Verrerie (tous les composants doivent être chauffés Pilon
I : 0,0035 - 0,0065 pouces
Pilon II : 0,0010 - 0,0030 pouces
filtre à vide avec base
Outils de dissection chirurgicale (tous les composants doivent être stérilisés à la chaleur)Pinces, ciseaux, bec Bunsen, coton écouvillons, jauge
Centrifugeuse à Ensemble de de support de filtre en verre fritté à porosité grossière

Références

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  1. Azevedo, P. O., et al. Pericytes modulate myelination in the central nervous system. Journal of Cellular Physiology. 233 (8), 5523-5529 (2018).
  2. Hall, C. N., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
  3. Gianni-Barrera, R., et al. PDGF-BB regulates splitting angiogenesis in skeletal muscle by limiting VEGF-induced endothelial proliferation. Angiogenesis. 21 (4), 883-900 (2018).
  4. Teichert, M., et al. Pericyte-expressed Tie2 controls angiogenesis and vessel maturation. Nature Communications. 8, 16106(2017).
  5. Dave, J. M., Mirabella, T., Weatherbee, S. D., Greif, D. M. Pericyte ALK5/TIMP3 Axis Contributes to Endothelial Morphogenesis in the Developing Brain. Developmental Cell. 44 (6), 665-678 (2018).
  6. Franco, M., Roswall, P., Cortez, E., Hanahan, D., Pietras, K. Pericytes promote endothelial cell survival through induction of autocrine VEGF-A signaling and Bcl-w expression. Blood. 118 (10), 2906-2917 (2011).
  7. Saint-Pol, J., et al. Brain Pericytes ABCA1 Expression Mediates Cholesterol Efflux but not Cellular Amyloid-beta Peptide Accumulation. Journal of Alzheimer's Disease. 30 (3), 489-503 (2012).
  8. Sagare, A. P., et al. Pericyte loss influences Alzheimer-like neurodegeneration in mice. Nature Communications. 4, 2932(2013).
  9. Montagne, A., et al. Pericyte degeneration causes white matter dysfunction in the mouse central nervous system. Nature Medicine. 24 (3), 326-337 (2018).
  10. Claudio, L., Raine, C. S., Brosnan, C. F. Evidence of persistent blood-brain barrier abnormalities in chronic-progressive multiple sclerosis. Acta Neuropathologica. 90 (3), 228-238 (1995).
  11. Nishioku, T., et al. Detachment of brain pericytes from the basal lamina is involved in disruption of the blood-brain barrier caused by lipopolysaccharide-induced sepsis in mice. Cellular and Molecular Neurobiology. 29 (3), 309-316 (2009).
  12. Yang, S., et al. Diverse Functions and Mechanisms of Pericytes in Ischemic Stroke. Current Neuropharmacology. 15 (6), 892-905 (2017).
  13. Yang, Y., et al. The PDGF-BB-SOX7 axis-modulated IL-33 in pericytes and stromal cells promotes metastasis through tumour-associated macrophages. Nature Communications. 7, 11385(2016).
  14. Hesp, Z. C., et al. Proliferating NG2-Cell-Dependent Angiogenesis and Scar Formation Alter Axon Growth and Functional Recovery After Spinal Cord Injury in Mice. Journal of Neuroscience. 38 (6), 1366-1382 (2018).
  15. Guo, P., et al. Platelet-derived growth factor-B enhances glioma angiogenesis by stimulating vascular endothelial growth factor expression in tumor endothelia and by promoting pericyte recruitment. American Journal of Pathology. 162 (4), 1083-1093 (2003).
  16. Cheng, J., et al. Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders. Acta Neuropathologica. 136 (4), 507-523 (2018).
  17. Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain. Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).
  18. Chen, J., et al. CD146 coordinates brain endothelial cell-pericyte communication for blood-brain barrier development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (36), 7622-7631 (2017).
  19. Thomsen, M. S., Birkelund, S., Burkhart, A., Stensballe, A., Moos, T. Synthesis and deposition of basement membrane proteins by primary brain capillary endothelial cells in a murine model of the blood-brain barrier. Journal of Neurochemistry. 140 (5), 741-754 (2017).
  20. Yamazaki, Y., et al. Vascular Cell Senescence Contributes to Blood-Brain Barrier Breakdown. Stroke. 47 (4), 1068-1077 (2016).
  21. Crouch, E. E., Doetsch, F. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions. Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).
  22. Ozerdem, U., Grako, K. A., Dahlin-Huppe, K., Monosov, E., Stallcup, W. B. NG2 proteoglycan is expressed exclusively by mural cells during vascular morphogenesis. Developmental Dynamics. 222 (2), 218-227 (2001).
  23. Stallcup, W. B., You, W. K., Kucharova, K., Cejudo-Martin, P., Yotsumoto, F. NG2 Proteoglycan-Dependent Contributions of Pericytes and Macrophages to Brain Tumor Vascularization and Progression. Microcirculation. 23 (2), 122-133 (2016).
  24. Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).

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Mots-clés

Cerveau de sourishomog n isation tissulairesolution de BSA dextranfraction microvasculairedigestion enzymatiquemarqueurs des p ricytesNG2 PDGFR Betaexpression de CD146repiquage de cultures cellulaires

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