Article de méthode

Générer des paysages chimiques contrôlés et dynamiques pour étudier le comportement microbien

DOI :

10.3791/60589

⸱

31 janvier 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Environmental Engineering, Department of Civil, Environmental and Geomatic Engineering, 2School of Mathematics and Statistics, University of Melbourne, 3Institute of Marine Sciences, University of California, Santa Cruz, 4Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 5Microbiology Research Center for Sustainability, University of Tsukuba, 6Department of Ecology and Evolutionary Biology, Princeton University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un protocole pour la génération de paysages chimiques dynamiques par photolyse dans des configurations microfluidiques et millifluidiques est présenté. Cette méthodologie est appropriée pour étudier divers processus biologiques, y compris le comportement motile, l'absorption des nutriments, ou l'adaptation aux produits chimiques des micro-organismes, à la fois au niveau de la cellule unique et au niveau de la population.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous démontrons une méthode pour la génération des impulsions chimiques contrôlées et dynamiques, où le chimioattractant localisé devient soudainement disponible à l'échelle micro-pour créer des micro-environnements pour des expériences microbiennes de chimiotaxis. Pour créer des impulsions chimiques, nous avons développé un système pour introduire des sources d'acides aminés quasi-instantanément par photolyse d'acides aminés en cage dans une chambre microfluidique de polydiméthylsiloxane (PDMS) contenant une suspension bactérienne. Nous avons appliqué cette méthode à la bactérie chimiotaxique, Vibrio ordalii, qui peut gravir activement ces gradients chimiques dynamiques tout en étant suivi par microscopie vidéo. Les acides aminés, rendus biologiquement inertes («caged») par modification chimique avec un groupe de protection photomovible, sont uniformément présents dans la suspension, mais pas disponibles pour la consommation jusqu'à leur libération soudaine, qui se produit à des points définis par l'utilisateur dans le temps et l'espace au moyen d'un faisceau LED axé sur les UV-A. Le nombre de molécules libérées dans l'impulsion peut être déterminé par une relation d'étalonnage entre le temps d'exposition et la fraction non-curation, où le spectre d'absorption après la photolyse est caractérisé par l'utilisation de la spectroscopie UV-Vis. Une membrane de polycarbonate nanoporeux (PCTE) peut être intégrée dans le dispositif microfluidique pour permettre l'élimination continue par l'écoulement des composés non encages et du support usé. Un lien fort et irréversible entre la membrane PCTE et la structure microfluidique PDMS est atteint en enrobant la membrane d'une solution de 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) suivie d'une activation plasmatique des surfaces à cautionr. Un système contrôlé par ordinateur peut générer des séquences d'impulsions définies par l'utilisateur à différents endroits et avec des intensités différentes, de manière à créer des paysages de ressources avec la variabilité spatiale et temporelle prescrite. Dans chaque paysage chimique, la dynamique du mouvement bactérien à l'échelle individuelle et leur accumulation au niveau de la population peuvent être obtenues, permettant ainsi la quantification de la performance chimiothérapeutique et ses effets sur les agrégations bactériennes dans des environnements écologiquement pertinents.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les microbes s'appuient sur la chimiotaxie, le processus de détection des gradients chimiques et la modification de la motilité en réponse1, pour naviguer dans les paysages chimiques, approcher les sources nutritives et les hôtes, et échapper aux substances nocives. Ces processus à l'échelle micrométrique déterminent la cinétique macro-échelle des interactions entre les microbes et leur environnement2,3. Les progrès récents dans les technologies de microfluidique et de microfabrication, y compris la lithographie douce4, ont révolutionné notre capacité à créer des microenvironnements contrôlés dans lesquels étudier les interactions des microbes. Par exemple, des expériences antérieures ont étudié la chimiotaxie bactérienne en générant des gradients stables et hautement contrôlés de concentrations de nutriments intermédiaires à élevés5,6. Cependant, dans les environnements naturels, les gradients chimiques à l'échelle micrométrique peuvent être de courte durée, dissipées par la diffusion moléculaire, et les conditions de fond sont souvent très diluées7. Pour mesurer directement la réponse chimiothérapeutique des populations microbiennes d'abord exposées à des environnements chimiques instables, nous avons conçu et décrit ici des méthodes pour combiner la technologie microfluidique avec la photolyse, imitant ainsi les gradients que les bactéries sauvages rencontrent dans la nature.

La technologie de déballage utilise des sondes sensibles à la lumière qui encapsulent fonctionnellement des biomolécules sous une forme inactive. L'irradiation libère la molécule en cage, permettant la perturbation ciblée d'un processus biologique8. En raison du contrôle rapide et précis de la chimie cellulaire que le démantèle permet9, la photolyse des composés en cage a traditionnellement été utilisé par les biologistes, les physiologistes et les neuroscientifiques pour étudier l'activation des gènes10, canaux ioniques11, et les neurones12. Plus récemment, les scientifiques ont mis à profit les avantages significatifs de la photolyse pour étudier la chimiotaxie13, pour déterminer la dynamique de commutation de flagelle des cellules bactériennes individuelles exposées à un stimulus chimioattractant étape14,15, et d'étudier les modèles de motilité des spermatozoïdes simples dans les gradients tridimensionnels (3D)16.

Dans notre approche, nous mettons en œuvre la photolyse des acides aminés en cage dans les dispositifs microfluidiques pour étudier la réponse comportementale d'une population bactérienne aux impulsions chimiques commandées, qui deviennent presque instantanément disponibles par photorelease. L'utilisation d'un objectif de faible grossissement (4x) (NA - 0,13, profondeur de mise au point d'environ 40 m) permet à la fois l'observation de la réponse agrégative au niveau de la population de milliers de bactéries sur un grand champ de vision (3,2 mm x 3,2 mm), et la mesure du mouvement au niveau d'une seule cellule. Nous présentons deux applications de cette méthode : 1) la libération d'une impulsion chimique unique pour étudier la dynamique bactérienne d'accumulation-dissipation à partir de conditions uniformes, et 2i) la libération des impulsions multiples pour caractériser la dynamique d'accumulation bactérienne dans des conditions de chimioattractant séquentitentes et spatialement variables et spatialement. Cette méthode a été testée sur la bactérie marine Vibrio ordalii effectuant des chimiotaxis vers le glutamate d'acide aminé17, mais la méthode est largement applicable à différentes combinaisons d'espèces et de chimioattractants, ainsi qu'à des processus biologiques au-delà de la chimiotaxie (p. ex., absorption des nutriments, exposition aux antibiotiques, détection du quorum). Cette approche promet d'aider à élucider l'écologie et le comportement des micro-organismes dans des environnements réalistes et de découvrir les compromis cachés auxquels les bactéries individuelles sont confrontées lorsqu'elles naviguent dans des gradients dynamiques éphémères.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Fabrication du dispositif microfluidique pour l'expérience à impulsion chimique unique

  1. Concevez le canal à l'aide d'un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAD) et imprimez-le sur un film de transparence pour créer le masque photo (Figure 1A).
  2. Fabriquer le maître par lithographie douce (dans des conditions de chambre propre).
    1. Nettoyer une plaquette de silicium (4 pouces) en succession rapide avec de l'acétone, du méthanol et de l'isopropanol, puis sécher à l'azote. Cuire la gaufrette au four à 130 oC pendant 5 min.
    2. Placez la plaquette au centre d'un spin-coater et versez le photoresist SU-8 sur la plaquette. Rampez la vitesse du spin-coater jusqu'à 500 tr/min sur 5 s, et maintenez à 500 tr/min pendant 10 s. Rampez jusqu'à la vitesse finale de plus de 10 s et maintenez à cette vitesse pendant 30 s.
      REMARQUE : La valeur exacte de la vitesse finale dépend de l'épaisseur du revêtement ciblé et du SU-8 utilisé.
    3. Après le processus de spin-enrobage, cuire la plaquette à 65 oC, puis à 95 oC. Laisser refroidir la plaquette à température ambiante (RT) pendant au moins 5 min.
      REMARQUE : Le temps de cuisson dépend de l'épaisseur ciblée et du type de photorésistance utilisé. En règle générale, pour chaque couche de 100 m, la plaquette doit être cuite au four pendant 5 min à 65 oC et 45 min à 95 oC.
    4. Placez le masque photo sur la plaquette pour vous assurer que seule la région d'intérêt est exposée et polymérisée. Exposer à la lumière UV pour le temps recommandé dans le manuel SU-8.
      REMARQUE : Ici, avec une énergie d'exposition de 200 mJ cm-2 à une longueur d'onde de 350 nm, la plaquette a été exposée pendant 150 s.
    5. Cuire la plaquette à 65 oC et 95 oC pour le temps recommandé dans le manuel SU-8.
      REMARQUE : En règle générale, pour chaque couche de 100 m, la plaquette doit être cuite au four pendant 5 min à 65 oC et 45 min à 95 oC.
    6. Immerger la plaquette dans un bécher rempli de méthacrylate polyméthyle (PMMA) développeur afin d'obtenir le maître. Secouez doucement le bécher pour s'assurer que le photoresist non polymérisé est lavé. Cuire le maître à 200 oC pour recouper la couche SU-8.
  3. Préparer un mélange de polydiméthylsiloxane (PDMS) en combinant l'élastomère avec son agent de séchage (Table of Materials) à un rapport de 10:1 dans un bécher (ici, 40 ml). Mélanger vigoureusement jusqu'à ce que le liquide soit homogène.
    REMARQUE : Le mélange PDMS semblera opaque parce que des bulles sont générées pendant le processus de mélange.
    CAUTION: Afin d'empêcher la peau d'entrer en contact avec des produits chimiques potentiellement dangereux ou des matières biologiques, toujours porter une blouse de laboratoire et des gants en plastique jetables tout au long du protocole et de suivre tous les protocoles de sécurité spécifiques selon le matériel Fiche de données sur la sécurité (MSDS).
  4. Décorer le mélange PDMS dans une chambre à vide pendant 45 min à RT. Pour accélérer le processus, relâchez périodiquement le vide afin d'éclater les bulles qui se forment à l'interface.
    REMARQUE : Le processus de dégazage doit être effectué dans un délai de 1 h pour empêcher le mélange de PDMS de commencer à guérir.
  5. Retirer la poussière de la surface du maître à l'effet d'un nettoyant pressurisé, puis verser le mélange de PDMS dégazé sur le maître et cuire au four à 80 oC pendant 2 h.
    REMARQUE : Alternativement, cuire la nuit (ou pendant au moins 12 h) à 60 oC permettrait d'obtenir le même PDMS durci.
  6. Couper le PDMS avec une lame autour des microstructures (à une distance d'environ 5 mm) puis éplucher soigneusement le PDMS du maître.
  7. Percer des trous pour servir d'inlet et de sortie du microcanal (ici, une danse et une prise, voir Figure 1A). Assurez-vous que rien ne touche la face inférieure du PDMS où les caractéristiques sont situées.
    REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Le microcanal doit être scellé avec du ruban adhésif pour empêcher l'accumulation de poussière et d'autres particules pendant le stockage.
  8. Attachez le microcanal PDMS à une lame de verre.
    1. Nettoyez soigneusement une lameenneenne en verre avec du savon, de l'isopropanol et de l'eau déionisée. Laissez sécher le verre ou utilisez de l'air comprimé pour accélérer le processus.
    2. Enlever les particules de poussière en tamponnant avec du ruban adhésif. Attachez le microcanal PDMS sur la glissière de verre propre, immédiatement après le traitement des deux surfaces avec du plasma (en utilisant soit un système de couronne ou une chambre d'oxygène plasma) pendant 2 min.
    3. Placer l'appareil microfluidique pour chauffer sur une plaque chaude à 80 oC pendant au moins 1 h pour renforcer le lien chimique avec le verre.

2. Fabrication de l'appareil Millifluidic imprimé en 3D pour l'expérience avec des impulsions multiples

  1. Concevez la forme 3D à l'aide d'un logiciel de conception 3D et imprimez le maître pour le moule PDMS avec une imprimante 3D haute résolution (Figure 1B).
    REMARQUE : Voir tableau des matériaux pour l'imprimante 3D et le matériau de moule utilisé pour créer le maître.
  2. Répétez les étapes 1.3-1.4, puis nettoyez la surface du maître en tamponnant avec du ruban adhésif. Mettre le maître sur une échelle, puis, tout en évitant la région centrale du maître qui sera occupé par la membrane, verser sur la quantité exacte de mélange PDMS non durci (ici, 23,4 g) afin d'obtenir la hauteur désirée de PDMS en correspondant à la hauteur du maître (ici, 0,5 mm). Retirez les bulles restantes à l'aide d'air comprimé.
  3. Placer le plâtre PDMS sur le maître dans un four à 45 oC pour cuire au moins 12 h.
  4. Attachez le moule 3D PDMS à un plat Petri.
    1. Épluchez délicatement la couche durcie de PDMS et perforez les trous d'inlet et de sortie pour l'injection de la suspension bactérienne (Figure 1C).
    2. Activez à la fois la surface d'un plat Petri (90 mm x 15 mm) et le moule PDMS avec plasma d'oxygène pendant 2 min. Attachez le moule PDMS sur le plat Petri. Appuyez doucement sur le moule sur le plat Petri, mais n'appuyez pas là où les caractéristiques sont situées car cela peut effondrer la chambre d'interrogatoire.
    3. Placer le plat Petri collé au moule PDMS 3D dans un four à 45 oC pendant au moins 12 h pour renforcer le lien chimique.
      REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.
  5. Fonctionnalisation de surface de membrane18
    1. Activer la membrane de polycarbonate nanoporeux (PCTE) dans une chambre de plasma d'oxygène pendant 1 min à RT.
      CAUTION: Évitez d'utiliser un système de couronne pour l'activation du plasma, car il endommagera la membrane.
    2. Sous une hotte chimique, diluer une solution commerciale de 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) dans de l'eau déionisée à 1% en volume (ici, 40 ml), à l'aide d'un tube de polypropylène.
      CAUTION : La solution APTES est extrêmement toxique (score de danger pour la santé des SMD3) et doit être manipulée avec un soin extrême exclusivement sous une hotte chimique avec des gants. Changer de gants immédiatement après avoir manipulé la solution APTES. Les fumées APTES sont destructrices pour les muqueuses et les voies respiratoires supérieures. Les organes cibles d'APTES sont les nerfs, le foie et les reins. Si un capot de fumée n'est pas disponible, un écran facial et un respirateur intégral doivent être mis en œuvre.
    3. Transférer la solution APTES diluée dans un plat Petri et immerger la membrane activée dans la solution APTES pendant 20 min.
    4. Retirez la membrane de la solution APTES à l'égard d'une pince à épiler et placez-la sur une lingette de chambre blanche pour sécher.
  6. Pour la fabrication des canaux microfluidiques PDMS qui se trouveront sur la membrane et permettront le lavage de l'arène bactérienne, répétez les étapes 1.1-1.7.
  7. Attachez les canaux de lavage PDMS à la membrane fonctionfonctionnelle.
    1. Activez à la fois le canal de lavage PDMS et la membrane PCTE avec une chambre plasmadique à l'oxygène pendant 2 min.
      REMARQUE : La membrane, qui sera prise en sandwich entre deux couches de PDMS, devrait être plus petite que le canal de lavage de PDMS.
    2. Immédiatement après le traitement plasmatique, mettre en contact la membrane fonctionfonctionnelle et le canal de lavage PDMS en appuyant doucement sur le canal de lavage PDMS sur la membrane.
      REMARQUE : N'exercez pas de pression excessive à ce stade, car elle pourrait causer l'attachement (irréversible) de la membrane au toit du canal, bloquant le canal.
  8. Sandwich de la membrane entre deux couches PDMS (Figure 1E).
    1. Activer à la fois le canal de lavage stratifié collé PDMS-membrane PCTE et le moule 3D PDMS précédemment collé au plat Petri avec une chambre de plasma d'oxygène pendant 2 min. Mettez-les en contact et appuyez ensemble.
    2. Placer le plat Petri collé à la structure du sandwich dans un four à 45 oC pendant au moins 12 h pour renforcer le lien chimique.
      REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.

3. Culture cellulaire

  1. Croissance d'une population de V. ordalii (souche 12B09 ou 12B09pGFP) pendant la nuit pendant 20 h en 2216 moyen19 sur un shaker orbital (600 tr/min) à 30 oC et les cellules de récolte en phase exponentielle tardive. Pour les isolats hébergeant le pGFP, ajouter la spectinomycine (50 g mL-1) pour maintenir le plasmide.
  2. Centrifuger un aliquot de 1 ml de cellules à 2500 x g pendant 3 min, retirer le supernatant et re-suspendre les cellules dans 1 ml d'eau de mer artificielle filtrée. Répétez cette étape.
  3. Affamer la population de V. ordalii sur un shaker orbital (600 tr/min) à 30 oC pendant 3 h.
  4. Préparer une solution d'eau de mer artificielle de 10 mM (ici, 1 ml) de 4-methoxy-7-nitroindolinyl-caged-L-glutamate (MNI-caged-L-glutamate) et stocker à -20 oC.
    REMARQUE : Protégez la solution MNI-Caged- L-glutamate de la lumière ambiante pour empêcher la photolyse.
  5. Diluer les cellules 50x en re-suspendant les cellules affamées dans une solution artificielled'eau de mer de 1 mM MM MNI-caged- L-glutamate.
    REMARQUE: Cela assurera une concentration bactérienne finale inférieure à 5 x 107 mL-1 (la valeur exacte dépend de la concentration initiale des cellules en fin de exponentielle, qui est généralement de 109 ml-1). La concentration bactérienne a été estimée à l'aide d'un spectrophotomètre à densité optique (OD) de 600 nm.

4. Calibration du Protocole de déminage

  1. Placer une gouttelette (20 l) d'une solution artificielle d'eau de mer de L-glutamate20 à une concentration C0 à 10 mm sur une lame de verre. Encapsulez la gouttelette en la recouvrant d'une chambre circulaire PDMS (diamètre d '5 mm, hauteur h '250 'm).
  2. Placez la glissière de verre sur une scène de microscope et exposez la chambre entière pendant 20 ms à un faisceau LED à une longueur d'onde de 395 nm (puissance 295 mW) en utilisant un objectif 4x (ouverture numérique [NA] - 0,13).
  3. Ouvrez la chambre PDMS et extrayez une gouttelette (1 l) pour analyse à l'arme UV-Vis.
  4. Répéter les étapes 4.1-4.3 pour différentes durées de l'éclairage LED de 0.1 s, 0.5 s, 2.5 s, 25 s, 250 s (ou jusqu'à saturation de la réaction chimique) et 0 s (pour obtenir le fond). Reproduisez les étapes de la procédure 4.1-4.4 au moins 3x (ici, 4x).
  5. Du spectre d'absorption, extraire la valeur à 405 nm, qui représentent le pic dans le spectre d'absorption de la molécule de cage21. Pour déterminer le taux k de la réaction de déminage chimique par l'exposition LED14, utilisez l'équation cinétique de premier ordre suivante pour l'ajustement numérique des données expérimentales17
    figure-protocol-1
    où C(t) est la valeur du spectre d'absorption de la solution à 405 nm (après suppression de fond) avec un temps de décamance de t secondes. Pour le petit temps de déminage t tel que kt 1, Eq. 1 peut être simplifié à la formulation linéaire
    figure-protocol-2

5. Expérience à impulsion chimique unique

  1. Maintenir le canal microfluidique sous vide pendant 20 minutes pour réduire la concentration de gaz dans le PDMS de sorte que les bulles sont moins susceptibles de se former pendant le processus de remplissage.
  2. Extraire le canal de la pompe à vide et immédiatement introduire la suspensionbactérienne diluée en 1 mM MNI-caged- L-glutamate dans l'eau de mer artificielle dans le microcanal doucement en utilisant une micropipette pour éviter les dommages flageller par les forces de cisaillement mécanique (ici, l'ensemble du processus de remplissage a pris 5-10 s). Après avoir rempli le canal avec la suspension bactérienne, sucer la solution en excès avec du papier essuie-tout, et sceller l'entrée et la sortie avec des bouchons PDMS en les pressant doucement dans les trous.
    REMARQUE : De cette façon, l'écoulement de fluide dans la chambre est empêché.
  3. Placez le microcanal sur une scène de microscope et déplacez la scène pour placer le champ de vision en milieu de canal. Configurer le microscope pour effectuer l'imagerie en contraste de phase (objectif 4x) à un taux d'image de 12 fps.
    REMARQUE : Cette valeur peut être variée, mais ne doit pas être inférieure à 10 fps pour permettre la reconstruction des trajectoires bactériennes par l'analyse d'image (voir la section 7 du protocole).
  4. Définir le trou d'épingle du faisceau LED à l'ouverture minimale. En réglant le temps d'exposition de la caméra à 5 s, enregistrez quelques images pour obtenir des mesures précises de l'emplacement spatial et de la taille du faisceau LED.
    REMARQUE : La source lumineuse LED se connecte à l'illuminateur d'épifluorescence du microscope par l'intermédiaire de la connexion liquide de guide de lumière. Le faisceau LED n'affecte pas la capture vidéo, parce que l'acquisition de vidéos et la stimulation LED sont commandées indépendamment via un logiciel.
  5. Effectuez l'imagerie continue pendant une durée totale de 10 min (20 min pour la plus grande impulsion chimique), et activez simultanément le faisceau LED focalisé à 395 nm pour la durée désirée (dans cette expérience, t -20 ms, 100 ms, 500 ms) à un point de temps défini par l'utilisateur (ici, 10 s après le début de l'acquisition vidéo) via un logiciel de microscope. Pour obtenir plusieurs répliques d'un même processus, déplacez l'étape pour enregistrer la réponse bactérienne sur différentes positions du canal microfluidique. Reproduisez cette procédure pour chaque taille d'impulsion, à l'aide d'un nouveau microcanal.
    REMARQUE : Le processus de déminage génère une impulsion cylindrique axisymmétrique qui se diffuse radialement vers l'extérieur dans le plan d'imagerie.
  6. Mener des expériences distinctes sans décamance chimique à un grossissement plus élevé (objectif 20x, NA 0,45) à un taux de trame plus élevé (50 fps) pour enregistrer le mouvement de nage impartial de la bactérie.

6. Expérience de l'impulsion chimique multiple

  1. Maintenir la chambre millifluidique sous vide pendant 20 min.
  2. Placez le plat Petri contenant la chambre millifluidique sur un stade de microscope. Remplissez la chambre sous la membrane avec la suspension bactérienne diluée (ici, l'ensemble du processus de remplissage a pris 10-15 s) de GFP-fluorescent V. ordalii dans 1 mM MNI-caged- L-glutamate solution dans l'eau de mer artificielle. Après avoir rempli le canal avec la suspension bactérienne, sucer la solution en excès avec du papier essuie-tout, et sceller l'entrée et la sortie avec des bouchons PDMS en les pressant doucement dans les trous.
    REMARQUE : De cette façon, l'écoulement de fluide dans la chambre est empêché. Pour permettre une meilleure visualisation des bactéries dans cette configuration où l'imagerie se produit à travers la membrane nanopouse, il est fortement recommandé d'utiliser des souches fluorescentes au lieu du type sauvage (comme utilisé dans l'expérience à impulsion chimique unique).
  3. Remplissez une seringue d'une solution artificielle d'eaude mer de 1 mM m MM m MM MM-L-glutamate et attachez le tube à l'inlet et à la sortie du canal de lavage au-dessus de la membrane.
  4. Connectez le tube à un réservoir de déchets et assurez-vous que le tuyau est entièrement immergé dans le réservoir de déchets liquides pour éviter les oscillations de pression.
  5. Définir le débit approprié sur la pompe à seringues (ici, 50 min-1l ) pour obtenir le débit moyen souhaité dans le canal de lavage, qui dépend de la géométrie du canal.
  6. Démarrer la pompe à seringues pour établir le flux dans le canal de lavage au-dessus de la membrane.
  7. Exécutez le logiciel contrôlant le faisceau LED et l'étape de microscope pour générer des séquences définies par l'utilisateur des impulsions à différents endroits et avec différentes intensités.
    REMARQUE : Le flux continu de la solution artificielle d'eaude mer de 1 mM MM MM MNI-Encage- L-glutamate dans le canal de lavage au-dessus de la membrane réapprovisionne la solution composée en cage et lave le milieu usé de l'arène bactérienne.
  8. Enregistrez la vidéo à l'aide d'un objectif 4x à intervalles réguliers sur une période de plusieurs heures et sur plusieurs endroits contigus pour couvrir une grande surface (ici, 1 cm x 1 cm, Figure 1F).

7. Analyse d'image et analyse de données

  1. Reconstruction des trajectoires bactériennes
    1. À partir des films enregistrés avec l'objectif 4x, reconstruire les trajectoires bactériennes à l'aide d'un logiciel de suivi17.
      REMARQUE : Ces trajectoires représentent les projections 2D du mouvement bactérien 3D dans le microcanal.
    2. À partir des trajectoires bactériennes reconstruites, déterminez la vitesse de dérive radiale de chaque individu nageant en projetant sa vitesse de nage sur la direction vers le centre de l'impulsion chimique (Figure 2D). Pour la visualisation de la dynamique spatio-temporelle de la vitesse de dérive radiale, utilisez une grille de binning de taille spatiale de 75 m x 75 m et fenêtre temporelle d'intervalle de 5 à 10 s (Figure 2D,E).
      REMARQUE : En raison de la symétrie cylindrique du processus, les données peuvent être analysées en coordonnées polaires et moyennes sur la dimension angulaire (figure 3).
    3. À partir des trajectoires bactériennes reconstruites, déterminez la dynamique spatio-temporelle de la distribution des bactéries lorsqu'elles réagissent aux impulsions chimiques (Figure 2E).
    4. À partir des films à haute résolution enregistrés avec l'objectif 20x au cours des expériences à impulsion unique, extraire la distribution de la vitesse de nage et le temps de course pour la population bactérienne comme ils répondent à l'impulsion chimique (Figure 4).
  2. Estimer le coefficient de diffusion des bactéries en tenant compte de la dynamique de dissipation de la population bactérienne après la chimiotaxie est terminée17 (ici, pour t 'gt; 300 s; Figure 3).
  3. Estimer le coefficient de diffusion du glutamate en appliquant l'équation Stokes-Einstein
    figure-protocol-3
    où les molécules d'acides aminés sont supposées être des particules sphériques avec un rayon hydrodynamique22rG, kB est la constante De Boltzmann (1,38 x 10-23 m2 kg s-2 K-1), T est la température (296 K), et est la viscosité dynamique de l'eau de mer artificielle (salinité 36 g kg-1) à 23 c C (10-3 Pa)

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous avons utilisé les dispositifs microfluidiques et millifluidiques (Figure 1) pour étudier les profils d'accumulation bactérienne dans des conditions nutritives dynamiques. Les trajectoires bactériennes ont été extraites de vidéos enregistrées acquises par microscopie de contraste de phase de la dynamique accumulation-dissipation d'une population bactérienne à la suite d'une impulsion chimique libérée par photolyse(figure 2 et figure 3

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette méthode permet aux chercheurs d'étudier les chimiotaxis bactériens sous des gradients dynamiques contrôlés dans des dispositifs micro et millifluidiques, permettant l'acquisition de données reproductibles. La création quasi instantanée d'impulsions chimiques à l'échelle micrométrique par photolyse vise à reproduire les types d'impulsions nutritives que les bactéries rencontrent à l'état sauvage à partir d'une gamme de sources, par exemple, la diffusion diffuse des panaches derrière les particules marines en s'enfon...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs remercient l'installation de microfabrication FIRST de l'ETH Zurich. Ce travail a été soutenu par un Australian Research Council Discovery Early Career Researcher Award DE180100911 (à D.R.B.), un Gordon and Betty Moore Marine Microbial Initiative Investigator Award GBMF3783 (à R.S.), et une subvention de la Swiss National Science Foundation 1-002745-000 (à R.S.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
(3-Aminopropyl)triéthoxysilane (APTES)Sigma-AldrichA3648>98 % de pureté, hautement toxique
Tube CELLSTARGreiner Bio-One21026150 ml
CentrifugeuseEppendorf5424Rpour éliminer les milieux usagés de la culture bactérienne
Incubateurs numériques Incu-LineVWR-CH390-0384pour la cuisson 3D master
DusterVWR-CH16650-22pour le nettoyage de la plaquette et des microcanaux
Plaque chauffanteVWR-CH444-0601pour le collage des microcanaux
IsopropanolSigma-AldrichW292907
Tubes à centrifuger LightSafeSigma-AldrichZ6883121,5 ml
MATLABMathworkspour l’analyse d’images et le suivi bactérien
Tube de microcentrifugationEppendorf301200861,5 ml
Lame de microscope en verreVWR-CH631-1552
Microscope Nikon Eclipse TiENikon InstrumentsMEA53100avec platine motorisée
MNI-GlutamateTocris Bioscience1490>98 % de pureté, photosensible
Équipement d’impression de moulesStratasysObjet30 3D imprimante
Service d’impression de moulesStudios d’impression 3DCustomhttps://www.3dprintingstudios.com/
Nanodrop One Spectrophotomètre UV-VisThermo Fisher ScientificND-ONE-Wpour calibrer le décageage
des éléments NIS NikonInstrumentsImagerie microscope Logiciel
Four Venti-LineVWR-CH466-3516pour la cuisson PDMS (avec convection forcée)
Photoresist SU-8-3050MicroChem Corp.SU8-3050
Chambre à plasma ZeptoDiener ElectroniqueZEPTO-1pour fonctionnaliser les surfaces avant collage
Membrane polycarbonateSterlitechPCT04471000.4 µ ; taille des pores M, 19 % de surface ouverte, 24 & micro ; m d’épaisseur
Microtube en polyéthylèneScientific CommoditiesBB31695-PE/2I.D. x O.D. : 0,015 » x 0,043 » / 0,38 mm x 1,09 mm Boîte
Pétri en polystyrèneVWR-CH25373-100surface inférieure (90 mm x 15 mm) pour coller le dispositif millifluidique
BalanceVWR-CH611-2605pour peser le mélange PDMS
caméra sCMOS Andor ZylaOxford Instrumentspour la microscopie à contraste de phase et à fluorescence (max 100 fps)
Sel de merInstant OceanN° de produit SS1-160p
SolidWorks 2015Dassault Systèmes SolidWorksUtilisé pour concevoir le moule
Spectra X light engineLumencolorpour LED 395 nm
Sylgard 184Dow Corning110-41-155PDMS Si Elastomer Kit ; agent de durcissement
Seringue (Luer-Lok)B Braun Omnifix4616308F
SeringueAiguille AganiA228de 10 à 30 ml
Pousse-seringue 11 Pico Plus EliteHarvard Apparatus70-4506Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm)
VeroGreyStratasysDual Seringue Pump
Vortex-GenieScientific IndustriesSI-0236Matériau du moule
de

Références

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