Article de méthode

Un modèle d’inoculation retardée de pseudomonas chronique infection de blessure d’aeruginosa

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DOI :

10.3791/60599

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20 février 2020

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1Division of Infectious Diseases, School of Medicine, Stanford University, 2Stanford Immunology, Stanford University, 3Palo Alto Veterans Institute of Research

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons un protocole retardé d’inoculation pour produire des infections chroniques de blessure dans les souris immunocompétentes.

Résumé

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) est un agent pathogène nosocomial majeur de plus en plus pertinent pour la santé humaine et la maladie, en particulier dans le cadre d’infections chroniques des plaies chez les patients diabétiques et hospitalisés. Il est urgent de mettre au point des modèles d’infection chronique pour aider à l’étude de la pathogénie des plaies et au développement de nouvelles thérapies contre cet agent pathogène. Ici, nous décrivons un protocole qui emploie l’inoculation retardée 24 heures après la blessure excisional pleine épaisseur. L’infection de la matrice provisoire de blessure présente à ce moment-là prédise le dégagement ou la diffusion rapide de l’infection et établit plutôt l’infection chronique durant 7-10 jours sans avoir besoin d’implantation de matériaux étrangers ou de suppression immunitaire. Ce protocole imite un cours temporel typique de l’infection postopératoire chez l’homme. L’utilisation d’une souche luminescente de P. aeruginosa (PAO1:lux) permet l’évaluation quotidienne quantitative de la charge bactérienne pour des infections de blessure de P. aeruginosa. Ce nouveau modèle peut être un outil utile dans l’étude de la pathogénie bactérienne et le développement de nouvelles thérapies pour les infections chroniques de plaie de P. aeruginosa.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) est une bactérie en forme de tige Gram-négative avec une pertinence croissante pour la santé humaine et la maladie. Il est responsable de la morbidité et de la mortalité étendues dans les arrangements nosocomiaux, particulièrement impliquant des infections de blessure dans les patients immunocompromis1,2. L’émergence de souches multirésistantes de cet agent pathogène a donné une impulsion supplémentaire pour l’investigation sur les facteurs contribuant à la virulence de P. aeruginosa, les mécanismes de la résistance aux antibiotiques De P. aeruginosa, et de nouvelles méthodes pour la prévention et le traitement de cette infection mortelle3. En tant que tel, le besoin de modèles animaux de l’infection chronique des plaies comme outils pour étudier ces questions de recherche n’a jamais été aussi grand.

Malheureusement, de nombreux modèles animaux de l’infection à P. aeruginosa ont tendance à simuler une infection aigue avec une résolution rapide de l’infection ou un déclin rapide dû à la septicémie4,5, qui ne simule pas adéquatement la nature souvent chronique de ces infections. Pour remédier à cet inconvénient, certains modèles utilisent l’implantation de corps étrangers tels que les perles d’agar, les implants en silicone, ou les gels d’alginate6,7,8. D’autres modèles utilisent des souris qui sont immunocompromised en raison de l’âge avancé, l’obésité, ou le diabète, ou par des moyens pharmacologiques tels que la neutropénie induite par cyclophophosphamide9,10,11,12. Cependant, l’utilisation de matériaux étrangers ou d’hôtes immunodéprimés modifie probablement le processus inflammatoire local, ce qui rend difficile d’acquérir une compréhension de la physiopathologie impliquée dans les infections chroniques des plaies chez les hôtes avec un système immunitaire autrement normal.

Nous avons développé un modèle chronique de P. aeruginosa infection de blessure chez les souris qui implique l’inoculation retardée avec des bactéries après blessure excisional. L’inoculation retardée permet des expériences évaluant la charge bactérienne s’étendant jusqu’à au moins 7 jours. Ce modèle ouvre de nouvelles possibilités d’étudier à la fois la pathogénie et les nouveaux traitements des infections chroniques de P. aeruginosa.

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Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université Stanford.

1. Préparation et croissance des bactéries

  1. Effectuer tous les travaux avec P. aeruginosa et les animaux avec des précautions BSL-2 selon le comité institutionnel de biosécurité du chercheur et les lignes directrices du comité d’utilisation des animaux. Faites toutes les étapes décrites ici impliquant P. aeruginosa, y compris l’inoculation de souris, dans un coffret de biosécurité.
  2. La souche luminescente PAO1:lux de P. aeruginosa est disponible dans notre laboratoire sur demande. Streak PAO1, stocké sous forme de stock de glycérol congelé, sur l’agar Lysogeny Broth (LB). Pour la souche luminescente PAO1:lux, l’agar LB doit contenir des antibiotiques sélectifs (100 'g/mL carbenicilline et 12,5 'g/mL kanamycin). Cultivez à 37 oC pendant la nuit dans un incubateur bactérien.
  3. Choisissez une colonie isolée et poussez pendant la nuit à 37 oC dans un milieu lb de 3 ml, pH 7,4. Pour les souches luminescentes, le bouillon doit contenir 100 og/mL de carbenicilline. Cultivez dans des conditions aérobies tremblantes.

2. Préparation de la procédure

  1. Demandez à tout le personnel effectuant la chirurgie de porter une robe propre/manteau de laboratoire, un masque de visage, un filet de cheveux, et des gants.
  2. Autoclave tous les outils chirurgicaux, y compris les ciseaux et les forceps. Utilisez une technique aseptique pour stériliser les outils entre les animaux.
  3. Nettoyez la table chirurgicale avec de l’éthanol et préparez un champ chirurgical propre.

3. Enlèvement de cheveux

  1. Anesthésiez les souris C57BL/6J de 8 à 12 semaines à l’aide d’isoflurane de 1 % à 3 %. Les enquêteurs devraient suivre les directives du personnel vétérinaire de leur établissement pour l’anesthésie lors de l’utilisation de l’isoflurane.
    1. Commencez l’anesthésie en livrant 1% - 3% isoflurane et ajuster le débit d’oxygène à 1,5 L/min. Placez la souris dans la chambre d’induction.
    2. Pincez l’orteil de la souris pour évaluer la profondeur de l’anesthésie. Lorsque la souris ne réagit plus à la stimulation, retirez-la de la chambre d’induction et placez-la sur le banc chirurgical avec son nez dans le cône de nez isoflurane.
    3. Appliquer un lubrifiant oculaire sur les deux yeux.
  2. Peser la souris pour obtenir un poids de base avant la procédure.
  3. Placez la souris en position couchée. Injecter la souris sous-cutanée avec du chlorure de sodium stérile préréchauffé de 0,9 %, 250 l à chaque flanc pour un total de 500 l.
  4. Raser la zone dorsale de la souris à l’aide d’un rasage électrique. Le rasage devrait se produire à un endroit différent de celui de la station chirurgicale pour prévenir la contamination des cheveux de la plaie.
  5. Appliquer une fine couche de lotion d’épilation. Laisser la lotion s’asseoir pendant 20 à 60 s. Enlever les cheveux et l’excès de lotion avec de la gaze humidifiée dans de l’eau chaude. Après l’épilation, procéder à la procédure de blessure excisional.

4. Chirurgie excisional de blessure d’épaisseur complète

  1. Injecter de la buprénorphine à libération soutenue 0,6 à 1 mg/kg sous-cutanée à l’aide d’une aiguille de 25 G à la mi-dorsale de la souris. La buprénorphine à libération lente soulage la douleur sur 48 à 72 h.
  2. Désinfecter le site chirurgical. Essuyez la surface dorsale à l’œil d’un tampon stérile de bêtadine. Essuyez l’excès de bêtadine à l’œil d’un tampon d’alcool stérile. Ceci doit être exécuté 3 fois (en alternance entre la bêtadine et l’alcool), écouvillonnant en se déplaçant du centre d’une manière circulaire au bord. Laisser sécher la zone.
  3. Créez un drapé entourant le site chirurgical à l’aide de gaze stérile ou d’une pellicule d’accrochage en plastique.
  4. Étirer la peau tendue caudally. Utilisez un poinçon stérile de biopsie de la peau de 6 mm de diamètre pour faire une incision initiale à travers l’épiderme dorsal gauche. Répéter sur l’épiderme dorsal droit.
  5. Utilisez des forceps pour tenter la peau du centre de la zone de la plaie décrite à gauche. Excisez les couches épidermiques et cutanées à l’aide de ciseaux. Répétez sur la zone de la plaie décrite à droite pour créer des blessures excisionales symétriques.
  6. Laver les plaies avec 50 l de salin stérile. Laissez sécher le site chirurgical et la peau environnante. Ensuite, couvrez les plaies et dorsum avec un pansement de film transparent.
  7. Placez la souris dans une cage propre. Maison 1 animal par cage.
  8. Placez la cage sur un coussin chauffant et surveillez jusqu’à ce que la souris se réveille.
  9. Lors de l’exécution de la chirurgie ci-dessus sur plusieurs animaux, utilisez un stérilisateur de perles chaudes pour nettoyer tous les instruments chirurgicaux entre les animaux.
  10. Laisser 24 h pour les souris de récupérer de la procédure chirurgicale et pour la formation d’une matrice de plaie provisoire sur les plaies avant de procéder à l’inoculation avec des bactéries.

5. Inoculation avec P. aeruginosa

  1. Diluer la culture PAO1:lux de nuit à OD600 - 0,05 dans 75 mL de support LB contenant 100 'g/mL de carbenicilline et de développer les bactéries jusqu’à ce que la culture est en phase exponentielle précoce (OD600 - 0,3). Cela devrait prendre environ 2 à 3 h.
  2. Diluer PAO1:lux dans PBS à une concentration de (7,5 à 2,5) x 102 CFU/mL. Assurez-vous de préparer l’inoculum excédentaire pour assurer un volume suffisant et pour permettre le placage après l’expérience. Si vous transportez entre les installations (c.-à-d. du laboratoire au vivarium), utilisez un double confinement dans une boîte à contre-preuves de fuites clairement marquée Biohazard.
  3. Effectuer tous les travaux avec P. aeruginosa et les souris à l’aide d’équipement de protection individuelle approuvé dans un coffret de sécurité biologique approuvé par le niveau de biosécurité animale 2 (ABSL-2). L’équipement réutilisable tel que la balance de pesage doit être recouvert d’un soudure pour éviter la contamination.
  4. Anesthésier à l’aide de 3% isoflurane comme décrit ci-dessus. Pesez la souris et enregistrez le poids. Injecter la souris sous-cutanée avec du chlorure de sodium stérile préréchauffé de 0,9 %, 250 l à chaque flanc pour un total de 500 l.
  5. Si le pansement transparent de la souris s’est éteint pendant la nuit, retirez soigneusement toute croûte résultante et mettez sur un nouveau pansement.
  6. Utilisez une seringue de bouchon de sécurité de 500 l à tubercule 27 G pour injecter 40 l de la suspension PAO1:lux à travers le pansement transparent dans chaque plaie. Différentes souris devraient être utilisées pour les contrôles des plaies non inoculés/PBS afin d’éviter la contamination croisée du côté contralatéral.
  7. Placez la souris dans sa cage sur un coussin chauffant et surveillez jusqu’à ce qu’elle se réveille. Toutes les souris doivent être logées individuellement dans des cages séparées afin d’éviter la contamination croisée.
  8. Fournir une pâte de supplément nutritionnel riche en calories pris en sandwich entre les granulés de nourriture sur le plancher de la cage.
  9. Utilisez l’inoculum restant pour strier une plaque d’agar LB. Compter les colonies pour confirmer le nombre de bactéries administrées.

6. Imagerie in vivo des plaies infectées

  1. Suivez les protocoles de confinement BSL-2 pour le transport des souris à et depuis l’instrument d’imagerie, y compris l’utilisation d’un conteneur secondaire. Veillez à ne pas transférer ou laisser tomber une litière animale pendant le transfert de la souris à la chambre d’induction ou à l’instrument d’imagerie.
  2. Induire l’anesthésie de la souris avec l’isoflurane inhalé de 1% à 3% dans une chambre d’induction comme décrit à l’étape 3.1.
  3. Une fois que la souris est anesthésié, placez-la en position couchée dans la chambre d’imagerie d’un système d’imagerie optique avec le nez dans le cône nasal isoflurane.
  4. Ouvrez le logiciel.
  5. Les paramètres d’acquisition varient en fonction du nombre d’animaux photographiés simultanément et de l’intensité de la bioluminescence. Les paramètres de base à définir comprennent le temps d’exposition, le binning, f/stop et le champ de vision (FOV). Nos paramètres de démarrage par défaut sont le temps d’exposition 30 secondes, binning faible (2), f/ arrêt 1.2, et FOV 25. Ajustez ces paramètres au besoin en fonction des besoins du chercheur.
  6. Analyser les données de luminescence à l’aide d’un programme d’imagerie (voir Tableau des matériaux). Luminescence sera représenté comme une image pseudo-couleur superposée sur une photographie couleur des souris.
    1. Créer une région d’intérêt (ROI) sur le site de la plaie et mesurer le flux moyen (photons/seconde) détecté. Notez que les données peuvent également être signalées comme rayonnement (photons/seconde/cm2/steradian), mais tant que la distance de la plate-forme d’imagerie de la caméra reste constante entre l’imagerie, le flux est suffisant.
    2. Mesurer l’arrière-plan en créant un retour sur investissement à une zone aléatoire sur la plate-forme d’imagerie. Soustrayez le nombre d’arrière-plan des photons/seconde.
    3. Exporter les données vers une feuille de calcul pour une analyse plus approfondie.
  7. Effectuer l’imagerie comme décrit ci-dessus aussi souvent que tous les jours pour suivre la progression de l’infection.

7. Gestion postopératoire

  1. Surveillez les souris selon les lignes directrices fixées par le protocole IACUC du chercheur. Nous surveillons toutes les souris tous les jours pendant les 4 premiers jours, puis tous les deux jours jusqu’à la fin de l’expérience. Peser les souris une fois par jour pendant les 4 premiers jours après la chirurgie dans un BSC. Injecter 250 l de chlorure de sodium de 0,9 % sous-cutané les jours 1 et 2 après l’infection.
  2. Vérifiez les signes de douleur/détresse chez les souris, y compris la posture voûtée, le pelage débraillé, la léthargie, la difficulté à respirer, la grimace faciale et la perte de poids.
  3. Si les animaux présentent des signes de détérioration de leur santé, consultez un vétérinaire. Toute souris qui semble montrer des signes d’aggravation de la douleur / détresse et une perte de poids de 20% ou plus devrait être euthanasié.

8. Excision de blessure

  1. À la fin de l’expérience, sacrifiez les souris en utilisant l’inhalation de CO2, suivie d’une luxation cervicale. Disposer de la carcasse de l’animal selon les protocoles ABSL-2 de l’institution.
  2. Lits de plaie d’accise utilisant des ciseaux stériles et des forceps dans un BSC. Placez chaque lit de blessure dans 1 ml de PBS stérile dans un tube de polypropylène de 1,5 ml. Émincer le tissu de la plaie avec des ciseaux. Toutes les plaies doivent être traitées comme ASBL-2, même si elles ne sont pas considérées comme infectées.
  3. Incuber sur un shaker à 300 tr/min pendant 2 h à 4 oC. Vortex chaque tube pour 10 s et diluer en série les effluents bactériens dans PBS. Plaquer les effluents bactériens dilués sur l’agar LB pour énumérer la charge bactérienne.
  4. Considérez les plaies infectées si le signal luminescent dans la plaie est au-dessus de la luminescence de fond et plus de bactéries sont détectées dans l’effluent de blessure que dans les blessures inoculées avec PBS comme contrôle.

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Résultats

À l’aide d’une souche luminescente de PAO1 avec un plasmide codant le système de journaliste luxABCDE (PAO1:lux), nous avons effectué des blessures excisionales sur des souris, inoculé ces blessures avec p. aeruginosa planctonique 24 h plus tard, et mesuré la charge bactérienne au fil du temps(Figure 1 et Figure 2). Une image représentative obtenue à l’aide d’un système optique d’imagerie démontre que ce modèle entraîne ...

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Discussion

Nous avons développé un nouveau modèle retardé d’infection de blessure de P. aeruginosa d’inoculation. La stratégie de retarder l’inoculation avec des bactéries jusqu’à 24 h après la blessure excisional permet l’évaluation des infections de blessure sur une période d’une semaine. En utilisant une souche luminescente de P. aeruginosa, il est possible de suivre la progression de l’infection tout au long du cours de l’infection. Le cours plus long de l’infection par rapport à d’autres modèles d’infection <...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents à divulguer.

Remerciements

Le vecteur de construction luminescente pUT-Tn5-EM7-lux-Km1 était un cadeau gracieux de J. Hardy. Des schémas ont été créés avec BioRender.com. Nous remercions le laboratoire de G. Gurtner pour leurs conseils sur le modèle d’infection des plaies. Nous remercions également T. Doyle du Stanford Center for Innovation in In Vivo Imaging pour son expertise technique. Ce travail a été soutenu par des subventions R21AI133370, R21AI133240, R01AI12492093, et des subventions de Stanford SPARK, le Falk Medical Research Trust et la Cystic Fibrosis Foundation (CFF) à P.L.B. C.R.D a été soutenu par T32AI007502. Une bourse d’études supérieures Gabilan Stanford pour les sciences et l’ingénierie et une bourse d’études supérieures interdisciplinaires Lubert Stryer Bio-X Stanford ont soutenu J.M.S.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Chlorure de sodium injectable à 0,9 %Hospira2484457
18 G x 1 aiguille stérileBD305195
25 G x 1 1/5 aiguille stérileBD305127
Tampon imbibé d’alcoolBD326895
Aura Imaging SoftwareSpectral Instruments Imagingn/a
BetadinePurdue Frederick Company19-065534
Buprénorphine SR LABZoopharmn/a
mâlesThe Jackson Laboratory000664
Poinçon de biopsie jetable, 6mmIntegra33-36
Ciseaux fins - Carbure de tungstèneOutils scientifiques fins14568-09
Stérilisateur à sec de billes de verreAppareil Harvard61-0183
Gélose granuléeFisher BioReagentsBP9744
Coussin chauffantMilliard804879481218
Seringue à insuline avec aiguille 28 GBD329461
Lago X Imaging SystemSpectral Instruments Imagerien/a
LB bouillonFisher BioReagentsBP1426
Seringue Leur-Lok 1 mLBD309628
Mini Arco Animal TrimmerWahl Professional919152
Nair Lotion dépilatoire à l’huile pour bébéChurch et Dwightn/aDisponible dans n’importe quelle pharmacie
Octagon ForcepsFine Science Tools11041-08
Boîte de PétriFalcon351029
Saline tamponnée au phosphate (PBS) 1xCorning21-040-CV
Press and Seal Cling WrapGladn/a
Seringue à insuline SafetyGlide avec aiguille de 30 gBD305934
Seringue à insuline Safetyglide, 1/2 mL, 30 g x 5/16 TWBD305934
ScaleOhaus Scout ProSP202
Supplément nutritionnel suppliqueHenry Schein Santé animale29908
Tegaderm, 6 cm x 7 cm3M1624W
C57BL/6J souris

Références

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Réimpressions et autorisations

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Mots-clés

Imagerie par bioluminescenceComptage de coloniesMise en plaie pleine paisseurCharge bact rienneMod le d infection chroniqueInteractions h te pathog neS curit BSL 2

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