Dissection et coloration des gouttelettes lipidiques des oenocytes dans les larves de Drosophila

Résumé

Présentés ici sont des méthodes détaillées pour la dissection et la coloration gouttelette de lipide des ovocytes dans les larves de Drosophila à l'aide de BODIPY 493/503, un colorant fluorescent spécifique aux gouttelettes lipidiques.

Résumé

Les lipides sont essentiels au développement des animaux et à l'homéostasie physiologique. La dysrégulation du métabolisme lipidique entraîne divers défauts et maladies du développement, tels que l'obésité et le foie gras. Habituellement, les lipides sont stockés dans des gouttelettes lipidiques, qui sont les organites multifonctionnels de stockage de lipides dans les cellules. Les gouttelettes lipidiques varient en taille et en nombre dans différents tissus et dans des conditions différentes. Il a été rapporté que les gouttelettes lipidiques sont étroitement contrôlées par la régulation de sa biogenèse et de la dégradation. Dans Drosophila melanogaster, l'oenocyte est un tissu important pour le métabolisme des lipides et a été récemment identifié comme un analogue du foie humain en ce qui concerne la mobilisation des lipides en réponse au stress. Cependant, les mécanismes sous-jacents à la régulation du métabolisme des gouttelettes lipidiques dans les ovocytes restent insaisissables. Pour résoudre ce problème, il est de la plus haute importance de développer une méthode fiable et sensible pour visualiser directement les changements dynamiques des gouttelettes lipidiques dans les ovocytes pendant le développement et dans des conditions stressantes. Profitant du BODIPY 493/503 lipophile, un colorant fluorescent spécifique aux gouttelettes lipidiques, décrit ici, est un protocole détaillé pour la dissection et la coloration subséquente des gouttelettes lipidiques dans les oenocytes des larves de Drosophila en réponse à la famine. Cela permet une analyse qualitative de la dynamique des gouttelettes lipidiques dans diverses conditions par microscopie confocale. En outre, cette méthode rapide et hautement reproductible peut également être utilisée dans les écrans génétiques pour l'indentification de nouveaux facteurs génétiques impliquant le métabolisme des gouttelettes lipidiques dans les ovocytes et autres tissus.

Introduction

Les lipides sont essentiels à la survie cellulaire. En plus de leur rôle traditionnel en tant que composants intégrals des systèmes de membrane cellulaire, les lipides jouent également des fonctions cruciales dans l'approvisionnement en énergie et la transmission de signalisation tout au long des cycles de vie des animaux individuels¹. Ainsi, le métabolisme des lipides doit se conformer à des règlements stricts pour maintenir l'hémostasie physiologique dans les cellules. On sait que la dysrégulation du métabolisme des lipides entraîne diverses maladies, comme le diabète et le foie gras. En dépit de la grande importance du métabolisme de lipide ....

Protocole

1. Pontde d'oeufs

1. Préparer les aliments de semoule de maïs standard pour la ponte.
   REMARQUE: Pour la recette et la procédure de cuisson pour les aliments de semoule de maïs standard utilisés ici, voir les détails précédemment^{publiés 15}.
2. Préparer la pâte de levure fraîche en ajoutant 6 ml d'eau distillée à 4 g de levure séchée active dans un tube centrifuge de 50 ml. À l'emploi d'une spatule, mélanger et faire une pâte.
3. Faire des bouteilles de ponte en remplissant les aliments de semoule de maïs dans les bouteilles et étaler environ 1 g de pâte de levure sur la surface de la nourriture de semoule....

Résultats

L'exécution réussie de cette procédure devrait avoir comme conséquence la coloration claire de gouttelettes de lipide qui indique le nombre et la taille des gouttelettes de lipide dans les oenocytes. Figure 1A,A',A', A'' montre qu'il y a peu de gouttelettes lipidiques détectables (points verts) dans les oenocytes des larves d'alimentation normales à différents stades de développement. Figure 1B,B',B''

Discussion

Parmi ceux décrits ci-dessus, il y a plusieurs étapes critiques dans ce protocole, avec la période de ponte d'oeufs étant l'un de ces. En tant que tissu mobilisateur de lipides, l'oenocyte est très sensible au statut nutritionnel^6,8. Des périodes prolongées de ponte peuvent entraîner une augmentation de la concurrence alimentaire avec les larves et les aliments, ce qui entraîne des résultats inexacts. La période de 1 h de pont utilisée dans ce protocole permet au.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube à centrifuger de 50 mL	Corning	430829	50 mL
Boîte de Pétri de 6 cm Thermo	Fisher	150326	6 cm
Gélose			Pour nourriture contre les mouches
Feuille d’aluminium	N/A	N/A	Protéger l’érable de la lumière
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922	Colorant de coloration des gouttelettes de lipides
Microscope	confocalLeica	Leica Leica TSC SP5	Imagerie confocale Sirop
		maïs	Pour l’alimentation des mouches
Semoule			Pour l’alimentation des mouches
Lamelle	Citoglas	10212424C	20 × ; 20 mm, 0,13-0,17 d’épaisseur
Goupille de dissection	N/A	N/A
Plaque de dissection	N/A	N/A
Papier filtre	N/A	N/A	Diamètre : 11 cm
Tampon de fixation	N/A	N/A	4 % Paraformaldéhyde (PFA) dans 1x Pince PBS
	Dumont	11252-30	#5
Incubateur	Jiangnan	SPX-380	Pour la culture de mouches
Tube de microcentrifugation	Axygen	MCT-150-C	1,5 mL
Lame de microscopie	Citoglas	10127105P-G
Support de montage	VECTASHIELDAntifade Support de montage	H-1000	Support de montage anti-décoloration
Vernis à ongles	PanEra	AAPR419	Sceller la lamelle
Pinceau	N/A	N/A
PBS	N/A	N/A	1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7,4)
Rotateur	Kylin-Bell Lab Instruments	WH-986
Ciseaux	Smartdata Medical	SR81	Ciseaux à ressort Vannas
Farine			Pour nourriture pour mouches
Spatule	N/A	N/A
Aliment standard à la semoule de maïs	N/A	N/A	Codage selon la recette standard de semoule de maïs
Bloomington Stéréo microscope	Leica	Leica S6E	Pour la dissection tissulaire
Papier essuyé	N/A	N/A
Levure			Pour l’alimentation des mouches
yw	Conservé comme stock de laboratoire	N/A	Drosophile

de de maïs de soja