Infection in vivo avec l’amazonense de Leishmania pour évaluer la virulence parasite chez les souris

Résumé

Ici, nous présentons un protocole compilé pour évaluer l’infection cutanée des souris avec l’amazonensis de Leishmania. Il s’agit d’une méthode fiable pour étudier la virulence parasite, permettant une vue systémique de la réponse de l’hôte vertébré à l’infection.

Résumé

Leishmania spp. sont des parasites protozoaires qui causent des leishmaniose, maladies qui présentent un large éventail de manifestations cliniques des lésions cutanées aux lésions viscérales. Actuellement, on estime que 12 millions de personnes sont infectées par le Leishmania dans le monde et plus d’un milliard de personnes vivent à risque d’infection. L’amazonense de Leishmania est endémique en Amérique centrale et du Sud et mène habituellement à la forme cutanée de la maladie, qui peut être visualisée directement dans un modèle animal. Par conséquent, les souches de L. amazonensis sont de bons modèles pour les études de leishmaniose cutanée parce qu’elles sont également facilement cultivées in vitro. Les souris C57BL/6 imitent la progression de la maladie entraînée par L. amazonensisobservée chez l’homme et sont considérées comme l’un des meilleurs modèles de souches de souris pour la leishmaniose cutanée. Chez l’hôte vertébré, ces parasites habitent les macrophages malgré les mécanismes de défense de ces cellules. Plusieurs études utilisent des tests d’infection à macrophage in vitro pour évaluer l’infectiosité du parasite dans différentes conditions. Cependant, l’approche in vitro se limite à un système cellulaire isolé qui ne tient pas compte de la réponse de l’organisme. Ici, nous compilons une méthode in vivo d’infection de murine qui fournit un aperçu physiologique systémique de l’interaction hôte-parasite. Le protocole détaillé pour l’infection in vivo des souris de C57BL/6 avec L. amazonensis comprend la différenciation de parasite en amastigotes infectieux, l’inoculation cutanée de pied de souris, le développement de lésion, et la détermination de charge de parasite. Nous proposons cette méthode bien établie comme méthode la plus adéquate pour des études physiologiques des réponses immunitaires et métaboliques d’hôte à la leishmaniose cutanée.

Introduction

Les leishmanimes sont des maladies infectieuses parasitaires répandues dans le monde entier représentant des défis importants dans les pays en développement et sont reconnues comme l’une des maladies tropicales négligées les plus importantes par l’Organisation mondiale de la Santé^1,2. Les leishmaniose sont caractérisées par des manifestations cutanées, muqueuses et/ou viscérales. La leishmaniose cutanée est habituellement causée par L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica et L. aethiopica^3....

Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité des soins et de l’utilisation des animaux de l’Institut de bioscience de l’Université de Sao Paulo (CEUA 342/2019), et ont été menées conformément aux recommandations et aux politiques relatives à l’entretien et à l’utilisation des animaux de laboratoire de l’État de Sao Paulo (Lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) et le gouvernement brésilien (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Toutes les étapes décrites dans les sections 1-5 doivent être effectuées aseptiquement à l’intérieur des armoires à débit laminaire. L’équipement de protection individuelle doit être utilisé tout en manipulant les parasites v....

Résultats

Les parasites protozoaires de leishmaniose existent sous deux formes développementales au cours de leur cycle de vie chez les hôtes invertébrés et vertébrés : les promastigotes, les formes proliérantes trouvées dans le lumen de la mouche de sable femelle ; et amastigotes, les formes proliérantes trouvées dans les vacuoles parasitophores des cellules hôtes mammifères. Les promastigotes ont un corps allongé d’environ 1,5 m de large et 20 m de long, avec un dalle émergeant généralem.......

Discussion

L’analyse in vivo de l’infection décrite dans ce protocole permet à n’importe quel chercheur d’évaluer la leishmaniose cutanée in vivo compte tenu de l’interaction hôte-parasite dans un scénario systémique. Ces essais ont été utilisés par de nombreux groupes^{22,24,27,29,31,32,34,}

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaque à 96 puits	Greiner bio-ne	655180	Une plaque à fond plat pour le dosage de la dilution limite
adénine	Sigma	A8626	Complément ajouté à l’étrier de milieu de culture cellulaire M199
	Mitutoyo	700-118-20	Un pied à coulisse pour mesurer l’épaisseur du
ballon de culture cellulaire	Corning	353014	Une fiole de culture cellulaire de 25 cm2 pour la culture du parasite Leishmania
centrifugeuse	Eppendorf	5804R	Un équipement utilisé pour séparer les échantillons en fonction de sa densité
CO2 incubateur 34 ° ; C	Thermo Scientific	3110	Un incubateur pour la différenciation des amastigotes
	éthanol Merck	K50237083820	Un désinfectant pour les articles généraux
fœtal bovin	Gibco	12657-029	Supplément ajouté au milieu de culture cellulaire M199
tube de broyage de tissu en verre	Thomas Scientific	3431 E04	Un tube pour recueillir et perturber le tissu
infecté des coussinets plantairesglucose	Synth	G1008.01.AH	Supplément ajouté au milieu de culture cellulaire M199
Logiciel GraphPad	Prism GraphPad		Un logiciel utilisé pour tracer les données et calculer la signification statistique
hemin	Sigma	H-2250	Supplément ajouté au milieu de culture cellulaire M199
HEPES	Promega	H5303	Supplément ajouté à l’incubateur de milieux de culture cellulaire M199
25 ° ; C	Fanem	347CD	Un incubateur pour la culture de promastigotes microscope
inversé	Nikon	TMS	Un équipement utilisé pour l’analyse visuelle des cultures de promastigotes et d’amastigotes
isoflurane			Un anesthésique inhalé pour souris (3-5 %)
armoire à flux laminaire	Veco	VLFS-09	Une armoire de biosécurité utilisée pour la zone de travail aseptique
cellule M199 milieux de culture	Gibco	31100-035	Un milieu de culture cellulaire pour la culture de Leishmania
Tube à microcentrifuger	Axygen	MCT150C	Un microtube utilisé pour la collecte, le traitement et le stockage d’échantillons
Pipette multicanal	Labsystems	F61978	Une pipette multicanaux utilisée pour le dosage de dilution limite
NaHCO3	Merck	6329	Supplément ajouté au milieu de culture cellulaire M199
NaOH	Sigma	S8045	Complément ajouté au milieu de culture cellulaire M199
Chambre Neubauer	HBG	2266	Un hémocytomètre pour compter le microscope optique à suspension parasitaire
	Nikon	E200	Un équipement optique utilisé pour compter
parasite	parasite Bemis	349	Un plastique souple et résistant pour sceller le plaque
pénicilline/streptomycine	Gibco	15140122	Complément ajouté au milieu de culture cellulaire M199
Boîtes de Pétri	TPP	93100	Une boîte stérile pour disséquer le coussinet plantaire
Kit pipeur	Gilson	F167360	Un kit de micropipette contenant quatre pipettes (P2 P20 P200 P1000)
balance	Quimis	BG2000	Un équipement utilisé pour peser le coussinet plantaire collecté lésions scalpel
	Solidor	10237580026	Un scalpel pour couper et recueillir les tissus des coussinets plantaires
Pipette sérologique 10 mL	Nest	327001	Une pipette stérile utilisée pour le transfert de volumes millilitres
pointes	Axygen		Une pointe de pipette utilisée pour transférer des volumes de microlitres
Bleu trypan	Gibco	15250-061	Un colorant utilisé pour compter les parasites viables
trypticase peptone	Merck		Supplément ajouté au milieu de culture cellulaire M199
seringue à tuberculine	BD	305945	Une seringue avec une aiguille 27G pour inoculer la suspension parasitaire

sérum le