Article de méthode

Analyse du séquençage de l'ARNm à cellule unique multiplexée des cellules embryonnaires de souris

DOI :

10.3791/60647

⸱

7 janvier 2020

 ,  , 
1Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici nous avons présenté une méthode multiplexée de séquençage d'ARNm de cellules simples pour profiler l'expression de gène dans les tissus embryonnaires de souris. La méthode de séquençage de l'ARNm à cellule unique à base de gouttelettes (scRNA-Seq) combinée à des stratégies de multiplexage peut dresser le profil des cellules uniques à partir de plusieurs échantillons simultanément, ce qui réduit considérablement les coûts des réactifs et minimise les effets expérimentaux des lots.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le séquençage de l'ARNm à cellule unique a fait des progrès significatifs au cours des dernières années et est devenu un outil important dans le domaine de la biologie du développement. Il a été utilisé avec succès pour identifier les populations de cellules rares, découvrir de nouveaux gènes marqueurs et décoder l'information sur le développement spatial et temporel. La méthode à cellule unique a également évolué de la technologie Fluidigm C1 à base de microfluidique aux solutions à base de gouttelettes au cours des deux à trois dernières années. Ici, nous avons utilisé le cœur comme un exemple pour démontrer comment profiler les cellules de tissu embryonnaire de souris en utilisant la méthode scRNA-Seq basée sur les gouttelettes. En outre, nous avons intégré deux stratégies dans le flux de travail pour profiler plusieurs échantillons dans une seule expérience. En utilisant l'une des méthodes intégrées, nous avons simultanément profilé plus de 9 000 cellules à partir de huit échantillons de cœur. Ces méthodes seront précieuses pour le domaine de la biologie du développement en fournissant un moyen rentable de profiler simultanément des cellules individuelles provenant de différents milieux génétiques, stades de développement ou endroits anatomiques.

Introduction

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Le profil transcriptionnel de chaque cellule varie selon les populations cellulaires au cours du développement embryonnaire. Bien que l'hybridation moléculaire in situ unique puisse être utilisée pour visualiser l'expression d'un petit nombre de gènes1, le séquençage de l'ARNm à cellule unique (scRNA-Seq) fournit une approche impartiale pour illustrer les modèles d'expression à l'échelle du génome des gènes dans les cellules individuelles. Après sa première publication en 20092, scRNA-Seq a été appliqué pour étudier plusieurs tissus à plusieurs stades de développement au cours des dernières années3

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Protocole

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La procédure animale est conforme au Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université de Pittsburgh (IACUC).

1. Dissection cardiaque embryonnaire de souris et préparation de suspension de cellules simples

REMARQUE : Cette étape peut prendre quelques heures en fonction du nombre d'embryons à disséquer.

  1. Pour acquérir des cœurs embryonnaires E18.5, euthanasiez une souris CD1 enceinte par administration de CO2. Utilisez un rasoir pour enlever les poils indésirables dans la région abdominale et désinfecter la peau avec 70% d'éthanol.
  2. Couper la peau de l'abdomen....

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Résultats

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Dans cette étude, nous avons utilisé le cœur embryonnaire de souris comme exemple pour montrer comment le séquençage multiplexé d'ARNm à cellule unique a été exécuté pour traiter les différents échantillons des parties séparées d'un organe simultanément. Les coeurs de souris CD1 d'E18.5 ont été isolés et disséqués dans l'oreillette gauche (LA), l'oreillette droite (RA), le ventricule gauche (LV) et le ventricule droit (RV). Les cellules auriculaires et ventriculaires ont ensuite été codée.......

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Discussion

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Dans cette étude, nous avons démontré un protocole pour analyser des profils transcriptionnels d'une seule cellule. Nous avons également fourni deux méthodes facultatives aux échantillons de multiplexe dans le flux de travail scRNA-Seq. Les deux méthodes se sont avérées réalisables dans divers laboratoires et ont fourni des solutions pour exécuter une expérience de cellule unique rentable et sans effet de lot18,26.

Il y a quelques étap.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts à divulguer.

Remerciements

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Nous remercions David M. Patterson et Christopher S. McGinnis du laboratoire Dr Zev J. Gartner pour leur aimable approvisionnement en réactifs à barres à base de lipides et leurs suggestions sur les étapes expérimentales et l'analyse des données. Ce travail a été fondé par les National Institutes of Health (HL13347202).

....

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
10 % Tween-20Bio-Rad1610781
10x Porte-puce10x Génomique120252 330019
10x Contrôleur Chromium10x Génomique120223
10x Séparateur Magnétique 10xGénomique120250 230003
10x Adaptateur Vortex10x Génomique330002, 120251
10x Clip Vortex10x Genomics120253 230002
4200 TapeStation SystemAgilentG2991AA
Agilent Kit d’ADN haute sensibilitéAgilent5067-4626Université de Pittsburgh Sciences de la santé Séquençage Core
Barcode OligoIntegrated DNA TechnologiesMono-nmol DNA Buffer25 nmol
EBQiagen19086
souris CD1Chales RiverStrain Code 022commandées souris enceintes Centrifuge
5424RAppendorf2231000214
Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns10x Genomics1000073Stocker à température ambiante
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns10x Genomics120262Stocker à -20 ° ; C
Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns10x Génomique1000094Stocker à -20 ° ; C
Chromium Single Cell 3' Library Kit v310x Genomics1000095Stocker à -20 ° ; C
Chromium Single Cell 3' v3 Perles de gel10x Genomics2000059Stocker à -80 ° ; C
Collagenase ASigma/Millipore10103578001Conserver la poudre à 4 ° ; C, conserver à -20 ° ; C après dissolution de
collagénase BSigma/Millipore11088807001Stocker la poudre à 4 ° ; C, conserver à -20 ° ; C après dissolution
D1000 ScreenTapeAgilent5067-5582Université de Pittsburgh Sciences de la santé Séquençage de l’ADN de base
Tube LoBind Tube de microcentrifugation, 1,5 mLEppendorf022431021
DNA Tube de microcentrifugation, 2,0 mLEppendorf022431048
Dynabeads MyOne SILANE10x Genomics2000048Conserver à 4 ° ; C, utilisé dans le mélange de nettoyage des billes (Tableau 1)
DynaMag-2 MagnetTheromo Scientific12321D
Éthanol, pur (200 Proof, anhydre)SigmaE7023-500mL
Falcon 15mL Tube à centrifuger en PP haute clartéCorning Cellgro14-959-70C
Falcon 50mL Tube à centrifuger en PP haute clartéCorning Cellgro14-959-49A
Sérum fœtal de bovin, qualifié, États-UnisFisher Scientific26140079Magasin à -20 ° ; C
Finnpipette F1 Pipettes multicanaux, 10-100&mu ; lTheromo Scientific4661020N
Finnpipette F1 Pipettes multicanaux, 1-10&mu ; lTheromo Scientific4661000N
Flowmi Cell StrainerSigmaBAH136800040Porosité 40 &mu ; m, pour 1000 uL Pointes de pipette, paquet de 50 chacun
Glycérine (glycérol), 50 % (v/v)Ricca Chemical Company3290-32
HBSS, sans calcium, sans magnésiumThermo Fisher Scientific14170112
Human TruStain FcX (solution de blocage des récepteurs Fc)BioLegend422301Ajouter 5 µ ; l de Human TruStain FcX par million de cellules dans 100 & micro ; l volume de coloration
Isopropanol (IPA)Fisher ScientificA464-4
Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X)Fisher ScientificNC0295239Magasin à -20 ° ; C, utilisé dans un mélange de bibliothèques de codes-barres marqués sur des lipides (Tableau 1)
Apprêt pour codes-barres lipidiques (Multi-seq Primer)Technologies d’ADN intégréesADN monocaténaire100 nmol
Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA)Thermo Fisher Scientific12090-015
MasterCycler ProEppendorf950W
Eau sans nucléase (Ambion)Thermo Fisher ScientificAM9937
Tubes PCR 0,2 ml 8 bandelettes de 8 tubesEppendorf951010022
Saline tamponnée au phosphate (PBS) 1X sans calcium ni magnésiumCorning Cellgro21-040-CV
Saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 10 % d’albumine bovine (alternative au produit Thermo Fisher)Sigma-AldrichSRE0036
Paquet de 4 pipettes (0,1 po ; 2,5 et 2 mu ; L, 0,5-10&mu ; L, 10&ndash ; 100&mu ; L, 100&ndash ; 1 000&mu ; L pipettes à volume variableFisher Scientific05-403-151
Réactif de sélection (SPRIselect Reagent Kit)Beckman CoulterB23318 (60ml)
Template Switch Oligo10x Genomics3000228Conserver à -20 ° ; C, utilisé dans Master Mix (Tableau 1)
La stratégie de codage à barres basée sur les anticorps est également connue sous le nom de Cell Hashing
Le navigateur de cellules est Loup Cell Browser10x Genomicshttps://support.10xgenomics. com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser
La ligne d’analyse disponible dans le commerce à l’étape 8.1 est Cell Ranger10x Genomicshttps://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/ latest/what-is-cell-ranger
La stratégie de codage à barres basée sur les lipides est également connue sous le nom de MULTI-seq
La plate-forme R bien entretenue est Seurat V3satijalabhttps://satijalab.org/seurat/
TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL pointe de pipette à filtre à rétention ultra faible rétentionUSA Scientific1180-3710
TipOne RPT 1000 ul XL pointe de pipette à filtre à très faible rétentionUSA Scientific1182-1730
TipOne RPT 200 ul pointe de pipette à filtre à très faible rétentionUSA Scientific1180-8710
TotalSeq-A0301 anti-souris Hashtag 1 AnticorpsBioLegend1558010.1 - 1.0 µ ; g d’anticorps chez 100 & micro ; l de tampon de coloration pour 1 million de cellules
TotalSeq-A0302 anti-souris Hashtag 2 AnticorpsBioLegend1558030,1 - 1,0 & micro ; g d’anticorps chez 100 & micro ; l de tampon de coloration pour 1 million de cellules
TotalSeq-A0302 anti-souris Hashtag 3 AnticorpsBioLegend1558050,1 - 1,0 & micro ; g d’anticorps chez 100 & micro ; l de tampon de coloration pour 1 million de cellules
Amorce TrueSeq RPITechnologies d’ADN intégréesADN Simple brin100 nmol, utilisé dans un mélange de banques de codes-barres marqués aux lipides (Tableau 1)
Solution de bleu de trypan, 0,4 %Scientific15250061
Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénolFisher Scientific25200-056
Universal I5Technologies d’ADN intégréesADN simple brin100 nmol
la Fisher

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877(2008).
  2. Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods

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Mots-clés

Single Cell mRNA SequencingMultiplexed scRNA SeqMouse Embryonic CellsDroplet Based MethodHeart Tissue ProfilingCellular Heterogeneity AnalysisGene Ontology PathwayCell Type AnnotationAnatomical Zone ComparisonBarcoded cDNA Library

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