Dans ce protocole, une méthode d’isolement et de transplantation d’îlot de murine dans le tissu sous-cutané sous-cutané inguinale d’adipeux est décrite. Des îlots murines syngénéiques isolés sont transplantés dans un récipient de murine utilisant un hydrogel de membrane de sous-sol. Le taux de glucose sanguin des receveurs est surveillé, et l’analyse histologique des greffes d’îcles est effectuée.
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Article de méthode
Modèle de transplantation inguinal Subcutaneous De tissu adipeux blanc (ISWAT) des îlots de Murine
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
La transplantation d’îlot pancréatique est un traitement thérapeutique bien établi pour le diabète de type 1. La capsule rénale est le site le plus couramment utilisé pour la transplantation d’îlots dans les modèles de rongeurs. Cependant, la capsule rénal serrée limite la transplantation d’îlots suffisants chez les grands animaux et les humains. Le tissu adipeux blanc sous-cutané inguinal (ISWAT), un nouvel espace sous-cutané, s’est avéré être un site potentiellement valable pour la transplantation d’îlots. Ce site a un meilleur approvisionnement en sang que d’autres espaces sous-cutanés. En outre, l’ISWAT accueille une plus grande masse d’îlot que la capsule rénale, et la transplantation en elle est simple. Ce manuscrit décrit la procédure de l’isolement et de la transplantation d’îlots de souris dans le site ISWAT des destinataires diabétiques syngénétiques de souris. Utilisant ce protocole, les îlots pancréatiques murines ont été isolés par la digestion standard de collagène et un hydrogel de matrice de membrane de sous-sol a été employé pour fixer les îlots purifiés dans le site d’ISWAT. Les niveaux de glucose sanguin des souris destinataires ont été surveillés pendant plus de 100 jours. Des greffes d’îlot ont été récupérées au jour 100 après transplantation pour l’analyse histologique. Le protocole de transplantation d’îlots dans le site ISWAT décrit dans ce manuscrit est simple et efficace.
Introduction
L’incidence et la prévalence mondiales du diabète sucré de type 1 (T1DM) augmentent rapidement, selon les données statistiques de la Fédération internationale du diabète (FDI)1. La transplantation d’îlots est l’une des approches les plus prometteuses pour le traitement du T1DM4. Puisque la grande percée faite dans la transplantation clinique d’îlot utilisant le protocole2 d’Edmonton a été rapportée, la survie fonctionnelle de greffe d’îlot dans des destinataires de T1DM après 5 ans atteint maintenant environ 50%3.
Dans le passé, plusieurs sites de transplantation, tels que le foie, la capsule rénale, la rate, la région intramusculaire, l’espace sous-cutané, la moelle osseuse et la poche mentale ont été explorés pour la transplantation expérimentale d’îlots5,6,7. Certains des sites ci-dessus ont été testés dans des milieux cliniques8. Bien que la transplantation d’îlot dans le foie reste la méthode la plus largement utilisée dans l’application clinique à l’heure actuelle9, il ya plusieurs problèmes importants à traiter lors de l’utilisation de ce site. Par exemple, comment réduire la perte précoce des îlots transplantés causée par la réaction inflammatoire instantanée de médiation sanguine (IBMIR) et l’approvisionnement en oxygène pauvre10,11 et comment récupérer les greffes d’îlots si nécessaire, parce qu’elles localisent diffusement dans le foie. La capsule rénale peut être un site idéal pour les receveurs de rongeurs. Cependant, la capsule rénaux serrée limite la transplantation d’îlots allogéniques suffisants chez l’homme, bien qu’il puisse être un meilleur ajustement pour la xénotransplantation d’îlot due aux préparations fortement purifiées d’îlot porcin employée médicalement5,12. Par conséquent, la recherche d’un site plus approprié pour la transplantation d’îlots est en cours.
L’espace sous-cutané peut être utilisé comme site cliniquement applicable pour la transplantation d’îlots en raison de son accessibilité. Cependant, l’efficacité de la transplantation d’îlots dans l’espace sous-cutané est extrêmement faible, ce qui nécessite un nombre relativement important d’îlots pour inverser l’hyperglycémie13. Récemment, une équipe de recherche japonaise a trouvé l’ISWAT, un nouveau site sous-cutané supérieur pour la transplantation d’îlots dans un modèle murine par rapport au foie14. L’ISWAT contient l’artère épigastrique et la veine, de sorte que l’approvisionnement en sang riche peut assurer la revascularisation de greffe d’înet. Dans ce manuscrit, nous proposons une méthode d’implantation facile utilisant un hydrogel de matrice de membrane de sous-sol pour fixer des îlots murines syngénéiques dans l’ISWAT. Ce protocole s’avère efficace pour la transplantation d’îlots.
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Protocole
Toutes les procédures de ce protocole ont suivi les principes du bien-être animal du Comité d’examen de l’éthique du Shenzhen Second People’s Hospital. Les receveurs et les donneurs de greffe d’ît étaient des souris mâles C57BL/6 de 8 à 10 semaines achetées au Centre des animaux médicaux de la province du Guangdong. La procédure de récolte, d’isolement, de culture ou d’administration des cellules récoltées a été effectuée dans des conditions aseptiques.
1. Préparation des islets
- Préparer une solution de travail de type V de collagène. Peser la collagène de type V et dissoudre avec le tampon de D-Hank à une concentration finale de 1 mg/mL, filtrer à l’aide d’une unité de filtre à seringues de 0,22 m et d’une seringue de 60 ml et de la pré-refroidir dans la glace. Un volume de 5 ml pour chaque receveur de donneur est requis.
- Euthanasiez une souris mâle C57BL/6 de 10 semaines (23 à 2 g) par luxation cervicale et vaporisez la partie externe de la souris avec 75 % d’éthanol pendant quelques secondes. Pendant ce temps, remplir une seringue de 5 ml de solution de collagène et changer l’aiguille de seringue avec une aiguille de perfusion émoussée (32 G).
- Placez la souris donneuse en position de supine sur un sac de glace sous la portée de dissection, coupez une ouverture transversale à l’aide de ciseaux ophtalmiques pointus droits dans la peau de la zone pubienne, et incisez complètement la peau vers la tête. Ouvrez ensuite complètement l’abdomen par une incision en V de la région pubienne au processus xiphoïde.
- Exposer la vésicule biliaire et toute la longueur du canal biliaire commun en repositionnant le foie. Puis serrer l’ouverture duodénale du conduit biliaire commun avec une pince vasculaire et couper une petite ouverture dans la vésicule biliaire.
REMARQUE : Le placement optimal d’aiguille est important pour empêcher le reflux dans le foie et la vésicule biliaire. - Cannuer le canal biliaire commun de l’ouverture de la vésicule biliaire à l’aide de l’aiguille de perfusion à l’étape 1.2, puis injecter 2 ml de solution de collagène dans le pancréas. Après cela, séparer le pancréas perfusé des intestins, de l’estomac et de la rate à l’aide de deux paires de microtweezers non invasifs, et le mettre dans un tube conique de 50 ml sur la glace.
REMARQUE : Répétez le processus pour toutes les souris donneuses. Trois pancréas perfusés consécutifs (pas plus de 40 min l’un de l’autre) peuvent être combinés dans un tube conique de 50 ml prérempli de 3 ml de solution de collagène pour chaque pancréas. - Ajouter 100 L DNase I (10 mg/ml) par pancréas dans les tubes coniques de 50 ml, et digérer les pancréas dans un bain d’eau à 37 oC en secouant les tubes coniques pendant 3 à 5 min.
REMARQUE: Secouer les tubes vigoureusement 40x dans les intervalles de 10 s pour dissocier le tissu avant la digestion dans le bain d’eau, puis secouer modérément les tubes pendant la digestion. - Ajouter la solution d’arrêt (2,5 mg/mL de solution BSA-HBSS) jusqu’à un volume final de 50 ml pour bloquer la digestion, et la centrifugeuse à impulsions les tubes à une vitesse de 750 x g à 4 oC et s’arrêter rapidement.
- Verser le supernatant et laver les granulés 2x en reconpendant délicatement dans 15 à 25 ml de BSA-HBSS. Centrifugeuse à impulsions du tube avec les mêmes conditions de vitesse que décrite s’il est indiqué à l’étape 1,7 pendant 1 min.
- Verser le supernatant et mettre en commun les granulés des trois tubes coniques dans un tube conique de 50 ml. Resuspendre les granulés dans un volume total de 10 ml d’histopaque-1119. Mélanger de façon homogène et ajouter séquentiellement 5 ml d’histopaque-1077 et 5 ml de HBSS en pipetting lentement le long du côté du tube.
- Faire tourner les échantillons dans la centrifugeuse à 750 x g à 4 oC pendant 10 min sans freins.
- Aspirez les îlots de l’interface HBSS/histopaque-1077 dans un tube conique de 50 ml à l’aide d’une pipette Pasteur jetable de 5 ml, ajoutez le BSA-HBSS à un volume final de 50 ml et la centrifugeuse à impulsions à 750 x g à 4 oC.
- Verser le supernatant et laver les îlots à l’aide de 30 ml de BSA-HBSS. Centrifugeuse de 1 min à 750 x g à 4 oC.
- Resuspendre les îlots en utilisant 30 ml de milieu de culture (10 % FBS-1%P/S-CMRL-1066) par tube et verser dans un plat de culture étanche à la lumière de 10 cm de diamètre. Sous un stéréomicroscope, à l’aide de pointes de tuyauterie à chargement de gel de 200 l, choisissez à la main les îlots de la solution en fonction de leur morphologie (c.-à-d. sphéroïdal, blanc). Mettre dans un plat de culture cellulaire non traité avec 10 ml de milieu de culture.
REMARQUE : Une deuxième sélection peut être effectuée si la pureté des îlots purifiés n’est pas optimale après la première cueillette. - Vérifiez la pureté des îlots cueillis à la main par tache de dithizone sous un microscope léger et détectez la viabilité des îlots par le diacète de fluorescéine (FDA)-propidium iodide (PI) tacher sous un microscope fluorescent.
- Culture des îlots isolés dans le milieu de culture (comme à l’étape 1.13) dans un incubateur à 37 oC, 95% air-5% CO2 avant la transplantation.
2. Transplantation d’îlots ISWAT
- Induire le diabète chez les souris mâles de 8 semaines C57BL/6 (22 à 2 g) par une seule injection de streptozotocine (STZ). Le jour -4, jeûnez les souris pour 4 à 6 h, puis préparez une solution STZ de 2 % à l’aide d’un tampon de citrate de 0,1 M (pH 4,4). Peser, suspendre à nouveau dans un tampon et injecter les souris par voie intrapéritone à une dose de 180 mg/kg.
REMARQUE : La solution STZ doit être fraîchement préparée avant utilisation et recouverte d’une feuille d’aluminium en raison de sa sensibilité à la lumière. Il doit être utilisé immédiatement, car il perdra de l’activité dans les 15 à 20 minutes. - Perforez les veines caudales des souris injectées par STZ pour recueillir un peu de sang vers 10 heures du matin -1 et le jour 0 et mesurer le taux de glucose sanguin non à jeun à l’aide d’une bandelette d’essai et d’un instrument de surveillance de base de la glycémie. Les souris seront utilisées comme receveurs de transplantation d’îlots si les niveaux de glucose sanguin des 2 jours consécutifs d’essai sont tous deux au moins 20 mmol/L.
- Le jour 0, peser et marquer toutes les souris récepteurs. Anesthésiez chaque receveur en injectant 60 mg/kg de sodium pentobarbital par voie intrapéritone.
REMARQUE : Administrer une pincée d’orteil pour vérifier la profondeur de l’anesthésie. Si la souris receveuse n’a pas de réflexe de sevrage, le niveau d’anesthésie est suffisant pour la chirurgie. Si ce n’est pas le cas, administrer un supplément de 10 mg/kg de sodium pentobarbital. Le sodium pentobarbital utilisé a été dilué dans la saline physiologique stérile à la concentration de 2% (m/v). - Sortir l’hydrogel d’un congélateur de -20 oC et le garder sur la glace pour permettre la décongélation. L’hydrogel est liquide à 4'10 oC et se solidifiera à une température plus élevée.
- Choisissez des équivalents d’îlots de 450 à 500 euros (IEQ) pour chaque receveur dans un tube stérile de centrifugeuse de 1,5 ml sous le stéréomicroscope (comme à l’étape 1,13) avec 200 l de milieu de culture et conservez-le sur la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt pour la transplantation.
- Écouvillonnez la zone inguinale gauche du receveur à l’aide de 75 % d’éthanol. Placez-le en position de supine et fixez les quatre membres à l’aide de ruban chirurgical. Raser les cheveux autour du site chirurgical avec des tondeuses électriques et écouvillonner la zone avec Iodophor.
- Faire une incision verticale de la peau dans cette zone en utilisant les ciseaux ophtalmiques et microtweezers non invasifs, identifier l’artère épigastrique inférieure et la veine dans l’ISWAT, et de créer une petite poche au-dessus des vaisseaux.
- Faites tourner le tube des îlots pendant 30 s à 200 x g et retirez le supernatant autant que possible. Aspirez 20 l d’hydrogel complètement décongelé et chargez-le dans le tube avec les îlots. Resuspendre doucement les îlots, en évitant les bulles.
- Livrer l’ensemble du mélange îtte-hydrogel dans le tube dans la poche (étape 2.7) du destinataire avec une pointe de pipette de 200 l.
REMARQUE : Ce processus nécessite deux techniciens, l’un pour ramasser les bords de la poche à l’aide de microtweezers non invasifs, et l’autre pour livrer le mélange d’înet dans la poche. - Ajouter 20 l de céphalosporine (5 à 10 mg) dans le site de transplantation après que le mélange îlots-hydrogel soit complètement solidifié, puis utiliser une suture chirurgicale de 5-0 pour fermer le muscle et la peau avec la méthode de suture continue.
REMARQUE : L’hydrogel a besoin d’environ 3 min pour se solidifier en raison de la température corporelle. - Placer le receveur dans une cage propre et garder au chaud à l’aide d’un tampon thermique. Gardez la surveillance jusqu’à ce que le destinataire récupère complètement et commence à se déplacer de façon autonome. Ensuite, administrer 0,03 mg/ml de buprénorphine avec une saline saline physiologique stérile par voie intrapéritone, selon la dose de 0,1 mg/Kg.
- Répétez les étapes 2.3-2.11 pour chaque souris destinataire.
- Mesurez les taux de glucose sanguin non à jeun des souris receveuses (comme à l’étape 2.2) 3 à 4 fois par semaine pendant le premier mois, et 1 x 1 par semaine par la suite.
- À la fin du suivi (100 jours après la transplantation), sous anesthésie (réalisée comme à l’étape 2.3) exciser l’ISWAT portant la greffe des destinataires suivant les étapes stériles décrites à l’étape 2.6. Fixer le tissu dans la formaline et le paraformaldéhyde selon les protocoles histologiques pour l’hématoxylin et l’éosine (H et E) coloration et immunofluorescence de l’insuline et le glucagon.
- Ajouter la céphalosporine et fermer l’incision des receveurs comme à l’étape 2.10, puis se préparer à la récupération comme à l’étape 2.11.
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Résultats
Deux procédures sont introduites dans ce protocole : la préparation des îlots murines et la transplantation d’îlots sur le site de l’ISWAT. Dans la première procédure, après avoir perfusé et digéré avec la solution de collagène de type V, purifiant avec Histopaque-1119 et Histopaque-1077 et une étape supplémentaire de cueillette à la main, les îlots de murine isolés seront suffisamment purs pour la transplantation (comme indiqué dans la figure 1) et les îlots isolés qui ont une viabilité éle...
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Discussion
La transplantation d’îlot de pancréas est une thérapie prometteuse pour traiter T1DM. L’effet de cette thérapie est affecté par de nombreux facteurs et le choix d’un site optimal pour l’implantation des îîaux est extrêmement important. Le site anatomique idéal pour la transplantation d’îlots devrait avoir les caractéristiques suivantes : accessibilité pour la transplantation simple, la biopsie, et les procédures de récupération de greffe ; complications réduites; taux de réussite élevé du contrôle de la glycémie; et la s...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par des subventions du National Key R-D Program of China (2017YFC1103704)Fonds spéciaux pour la construction d’hôpitaux de haut niveau dans la province du Guangdong (2019), Sanming Project of Medicine à Shenzhen (SZSM201412020), Fonds pour le haut niveau Medical Discipline Construction of Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021SZ Fondation de recherche scientifique de la province du Guangdong en Chine (A2019218), China Postdoctoral Science Foundation (2018M633218).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,22 &mu ; m Unité de filtration entraînée par seringue | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| Tube à centrifuger 1,5 mL | Axygen | MCT-150-C | |
| Pipette Pasteur 5 mL | JingAn Biological, Chine | J00085 | |
| Seringue de 5 mL | Szboon, Chine | 20170829 | |
| Tube conique de 50 mL | Corning | 430829 | |
| 5-0 suture chirurgicale | sh-Jinhuan, Chine | CR537 | |
| Seringue de 60 mL | Szboon, Chine | 20170623 | |
| 75 % d’éthanol | LIRCON, Chine | 9180527 | |
| Alexa Fluor 488 âne anti-souris IgG(H+L) | Invitrogen | A21202 | Dilution (1:200) |
| anti-souris Anticorps anti-glucagon | Abcam | ab10988 | Dilution (1:100) |
| anti-souris | insuline anticorps Cell Technologie de signalisation | 3014s | Dilution (1:100) |
| aiguille de perfusion à pointe émoussée | Oloey, Chine | 005 | 32G, jaune |
| BSA | Meilune, Chine | MB4219 | |
| C57BL/6 Souris | médical pour animaux de la province | 8 ~ 10 semaines | |
| boîte de culture cellulaire | BIOFIL, Chine | TCD000100 | Général, Non traité, 87,8 mm de diamètre |
| centrifugeuse | Thermo Scientific | ST16R | |
| céphalosporine | Lukang medical, Chine | 150303 | |
| CMRL-1066 | Sigma-Aldrich | C0422 | |
| Codos Pet Clipper | Szcodos, Chine | CP-8000 | |
| collagénase Type V | Sigma | C9262 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Tampon D-hank | Coolaber, Chine | PM5140-10 | |
| dithizone | Sigma-Aldrich | D5130 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | D4263 | |
| Média de coloration à l’éosine | Beyotime Biotech, Chine | C0109 | |
| FBS | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| diacétate de fluorescéine (FDA) | Thermo Fisher | Microscope fluorescent F1303 | |
| Leica | DMIL | ||
| pointes de pipette à chargement de gel | Corning | CLS4884 | |
| HBSS | Coolaber, Chine | PM5150-10 | |
| Média de coloration à l’hématoxyline | Technologie de signalisation cellulaire | 14166S | |
| HISTOPAQUE-1077 | Sigma-Aldrich | RNBG0522 | |
| HISTOPAQUE-1119 | Sigma-Aldrich | RNBG0536 | |
| Hydrogel | BD Biosciences | 356234 | Matrice de membrane basale |
| Iodophor | LIRCON, Chine | 5190313 | |
| plat de culture étanche à la lumière | DVS, Chine | AN-5058548 | auto-fabriqué, plat en verre pulvérisé de peinture |
| noire Ruban adhésif médical | Cofoe, Chine | K12001 | |
| micropince à épiler non invasive | RWD Life Science | F11033-11 et F12016-15 | |
| One Touch ultraeasy Système de base de surveillance de la glycémie | Johnson & Ciseaux | 33391713 | |
| RWD Life Science | S12012-12 et S11001-08 | ||
| P/S (pénicilline / streptomycine) | Gibco | 15140-122 | |
| pentobarbital sodique | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Iodure de propidium | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| STZ (streptozotocine) | Sigma-Aldrich | S0130 | |
| Bandelette de test | GenUltimate | 100-50 | |
| TRITC-conjuguée chèvre anti-lapin IgG(H+L) | proteintech | SA00007-2 | Dilution (1:200) |
| pince vasculaire | RWD Life Science | R31006-04 |
Références
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Réimpressions et autorisations
