Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Isolement concomitant des astrocytes primaires et des microglies pour l’infection de parasite de Protozoa

7.3K vues

⸱

DOI :

10.3791/60680

⸱

18 mars 2020

 ,  ,  ,  , 
1Centro de Terapia Celular e Molecular (CTCMol), Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2Departamento de Ciências Biológicas, Centro de Terapia Celular e Molecular (CTCMol), Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

L’objectif global de ce protocole est d’instruire comment extraire, maintenir et dissocier les cellules astrocytes murines et microglies du système nerveux central, suivies d’une infection par des parasites protozoaires.

Résumé

Les astrocytes et les microglies sont les cellules gliales les plus abondantes. Ils sont responsables du soutien physiologique et de l’entretien de l’homéostasie dans le système nerveux central (SNC). Les preuves croissantes de leur participation à la lutte contre les maladies infectieuses justifient l’intérêt croissant pour l’amélioration des méthodologies pour isoler les astrocytes primaires et les microglies afin d’évaluer leurs réponses aux infections qui affectent le SNC. Considérant l’impact de Trypanosoma cruzi (T. cruzi) et Toxoplasma gondii (T. gondii) infection dans le SNC, ici nous fournissons une méthode pour extraire, maintenir, dissocier et infecter les astrocytes murins et les cellules de microglie avec des parasites protozoaires. Les cellules extraites des cortices nouveau-nés sont maintenues in vitro pendant 14 jours avec le remplacement différentiel périodique de médias. Les astrocytes et les microglies sont obtenus à partir du même protocole d’extraction par dissociation mécanique. Après le phénotypage par cytométrie d’écoulement, les cellules sont infectées par des parasites de protozoaire. Le taux d’infection est déterminé par la microscopie de fluorescence à différents moments, permettant ainsi l’évaluation de la capacité différentielle des cellules gliales pour commander l’invasion et la réplication protozoaires. Ces techniques représentent des méthodes simples, bon marché et efficaces pour étudier les réponses des astrocytes et des microglies aux infections, ouvrant le champ à d’autres analyses neuroimmunologiques.

Introduction

Le CNS est principalement composé de neurones et de cellules gliales1,2,3. Les microglies et les astrocytes sont les cellules gliales les plus abondantes du SNC. Microglia, le macrophage résident, est l’immunocompétence et la cellule gliale phagocytique dans le CNS3,4, tandis que les astrocytes sont responsables du maintien de l’homéostasie et exercent des fonctions de soutien5.

En dépit des cellules gliales étant classiquement connues pour être responsables du soutien et de la protection des neurones6,7, les fonctions émergentes de ces cellules ont été décrites dans la littérature récente, y compris leurs réponses aux infections8,9,10,11. Ainsi, il ya une poussée pour développer des méthodes pour isoler ces cellules gliales pour comprendre leurs fonctions individuellement.

Il existe d’autres modèles pour étudier les cellules gliales plutôt que les cultures primaires, comme les lignées cellulaires immortalisées et les modèles in vivo. Cependant, les cellules immortalisées sont plus susceptibles de subir des changements génétiques à la dérive et morphologiques, tandis que les études in vivo imposent des conditions de manipulation limitées. Inversement, les cultures primaires sont faciles à manipuler, mieux ressembler aux cellules in vivo et nous permettent également de contrôler les facteurs expérimentaux12,13. Ici, nous décrivons des lignes directrices sur la façon d’extraire, maintenir et dissocier les astrocytes murins et les cellules primaires de microglie dans le même protocole. En outre, nous fournissons également des exemples sur la façon de travailler avec l’infection à protozoaires dans ces cultures.

Les cellules du SNC extraites de souris néonatales (jusqu’à 3 jours) ont été cultivées pendant 14 jours sur des supports différentiels qui permettent la croissance préférentielle des astrocytes et des cellules de microglies. Puisque les microglies reposent au-dessus des astrocytes attachés, les populations cellulaires ont été mécaniquement dissociées dans un incubateur orbital. Ensuite, nous avons recueilli tous les supernatants contenant des microglies et ajouté de la trypsine pour détacher les astrocytes. Les cellules gliales isolées ont été évaluées phénotypiquement par cytométrie d’écoulement et plaquées selon l’expérience désirée.

Nous avons également fourni des exemples sur la façon d’infecter ces microglies et astrocytes isolés avec des parasites protozoaires. T. gondii est un protozoaire hautement neurotrope responsable de la toxoplasmose14, tandis que T. cruzi est responsable de la maladie de Chagas qui peut conduit au développement de troubles neurologiques dans leSNC 15,16. En outre, il a également été signalé que l’infection par T. gondii17,18 ou T. cruzi19,20,21 étaient la cause vraisemblablement de la mort chez les patients immunocompromisés. Par conséquent, l’élucidation du rôle immunologique des cellules gliales du SNC dans le contrôle des infections de protozoaire est d’une grande importance.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales impliquant des souris ont été effectuées conformément à la loi nationale brésilienne (11.794/2008) et approuvées par les Comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université fédérale de Sao Paulo (UNIFESP).

1. Extraction, entretien et dissociation des cellules gliales

REMARQUE : Le nombre de souris utilisées pour l’extraction des cellules gliales dépend de la quantité de cellules nécessaires pour effectuer les expériences souhaitées. Dans ce protocole, un total de 2,7 x 107 astrocytes et 4 x 106 microglies ont été obtenus à partir de six souris néonatales C57BL/6. Toutes les procédures ont été exécutées sous état stérile dans un coffret de biosécurité de classe II.

  1. Jour 1
    1. Préparer la solution de sel équilibrée (HBSS) et le HBSS (HBSS) et 10 % du sérum bovin fœtal (FBS) inactivé à la chaleur (voir Tableau des matériaux).
    2. Préparer le Medium Aigle modifié (DMEM)/F12 de Dulbecco (10 % FBS - 0,08 mM Penicillin - 0,09 mM Streptomycin , 12,5 mM HEPES , 30 mM de bicarbonate desodium, pH 7,2) et filtrer avec un filtre de 0,22 m (voir de la table ).
      REMARQUE : Tous les supports culturels doivent être entreposés à 4 oC, mais il est nécessaire de les pré-attendre à 37 oC pendant 20 minutes avant de commencer l’expérience.
    3. Stériliser tous les instruments chirurgicaux (ciseaux, spatule et pincettes) dans un autoclave et utiliser 70% d’éthanol pendant l’intervention.
    4. Mettre les nouveau-nés (jusqu’à 3 jours) souris dans une chambre scellée contenant du coton imbibé d’isoflurane pendant 5 min pour une anesthésie profonde.
    5. Vaporiser le chiot souris avec 70% d’éthanol et décapiter l’animal avec des ciseaux.
    6. Faire la coupe sagittale (postérieure à antérieure) avec des ciseaux le long du crâne pour l’ouvrir et exposer le cerveau. Séparez le crâne du cerveau à l’aide de pincettes. Retirez le cerveau à l’aide d’une micro spatule pour maintenir l’intégrité du cerveau.
    7. Placer le cerveau dans un plat Sec Petri (6 cm de diamètre). Retirer l’ampoule olfactive et le cervelet à l’aide d’une micro spatule. Déplacez le cortex vers un autre plat Petri (6 cm de diamètre) contenant HBSS et 10 % de FBS (2 ml/Petri).
    8. Couper le tissu cérébral en petits morceaux avec des ciseaux stériles et à l’aide d’une micropipette p1000 transférer chaque tissu cérébral avec HBSS - 10% FBS à différents tubes coniques de 15 mL. Assurez-vous que le volume final est de 2 ml/tube. Si ce n’est pas le cas, avec HBSS - 10% FBS.
      REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. Si c’est le cas, les tubes coniques avec tissu DE SNC doivent être placés sur la glace jusqu’à 1 h.
    9. Laver le tissu cérébral coupé avec 3 ml de HBSS , 10% FBS (par tube) et après décantation. Retirez soigneusement le supernatant. Répétez cette étape 3 fois.
      REMARQUE : Cette étape vise à enlever les débris et à récupérer le tissu extrait.
    10. Laver le tissu cérébral coupé avec 3 ml de HBSS pur (par tube) et après décantation, enlever soigneusement le supernatant. Répétez cette étape 3 fois.
      REMARQUE : Cette étape vise à supprimer le sérum restant des lavages précédents, car les cellules seront trypsinisées à l’étape suivante.
    11. Ajouter 3 ml de trypsine par tube et placer dans un bain d’eau à 37 oC pendant 30 minutes, en secouant doucement les tubes toutes les 5 minutes. Évitez les bulles en inversant ou en mélangeant brusquement les tubes.
      REMARQUE : Cette étape vise à digérer le tissu recueilli.
    12. Pour inactiver la trypsine, laver le tissu avec 3 ml par tube de HBSS - 10% FBS et, après décantation du tissu, enlever soigneusement le supernatant. Répétez cette étape 3 fois.
    13. Laver le tissu avec 3 ml par tube de HBSS pur et enlever soigneusement le supernatant. Répétez cette étape 2 fois.
    14. Ajouter 7 ml par tube de HBSS pur et homogénéiser le tissu à travers des passages successifs dans les pipettes : d’abord avec la pipette sérologique de 10 ml, suivie de la 5 ml et enfin avec la micropipette p1000.
    15. Après homogénéisation, les tubes de centrifugeuse à 450 x g pendant 5 min à 4 oC.
    16. Jetez le supernatant et réutilisez la granule avec 4 ml de HBSS , soit 10 % de FBS par tube.
    17. Transférer les cellules dans un flacon T-75 prétraité pour une adhérence optimale à la culture cellulaire (voir Tableau des matériaux).
      REMARQUE : Traiter le tissu de chaque animal par flacon.
    18. Placer le flacon dans l’incubateur à 37 oC et 5% de CO2 pendant 30 min pour l’observance.
    19. Ajouter 10 ml de DMEM/F12 complété par flacon et incuber à 37 oC et 5 % de CO2.
      REMARQUE : Le volume final est de 14 ml par flacon.
  2. Jour 3
    1. Retirer 7 ml de milieu de culture du flacon T-75 et ajouter 7 ml de DMEM/F12 frais complété.
      REMARQUE : Les flacons contiendront beaucoup de débris cellulaires et un aspect nuageux.
  3. Jour 5
    1. Retirer tout le milieu du flacon T-75 et ajouter 14 ml de DMEM/F12 frais complété.
      REMARQUE : Le milieu est remplacé des flacons pour enlever les débris et les cellules non adhérentes.
    2. Après chaque 48 h, retirer 6 ml du supernatant et ajouter 7 ml de DMEM/F12 frais complété moyen jusqu’au jour 14 de la culture.
  4. Jour 14
    1. Après avoir enlevé 6 ml du supernatant et ajouté 7 ml de milieu frais DMEM/F12, fermez les flacons T-75.
    2. Placez-les dans le shaker orbital au sol à 200 tr/min et 37 oC pendant la nuit pour dissocier mécaniquement les microglies des astrocytes.
  5. Jour 15
    1. Prenez les flacons du shaker et lavez-les vigoureusement avec leur propre milieu afin d’optimiser la dissociation cellulaire et de récolter le nombre maximum de microglies. Ensuite, recueillir le supernatant (contenant des microglies) et le transférer à un tube conique de 50 ml.
    2. Ensuite, ajouter 4 ml de trypsine dans chaque flacon et incuber pendant 5 min à 37 oC afin de détacher les astrocytes.
    3. Ajouter 5 ml par flacon de DMEM/F12 complété pour inactiver la trypsine. Laver les flacons avec leur propre milieu et transférer le contenu dans un tube conique de 50 ml.
    4. Centrifuge tous les tubes contenant des microglies dissociées et des astrocytes à 450 x g pendant 5 min à 4 oC.
    5. Jetez le supernatant. Réutilisez le granule de microglie en 1 ml et les astrocytes dans 10 ml de DMEM/F12 complété.
    6. Procédez au comptage cellulaire dans une chambre Neubauer ou un compteur cellulaire automatique. Plaquez les cellules avec DMEM/F12 complété à la densité désirée dans une plaque de culture plate appropriée de cellules de fond (prétraité pour l’attachement optimal de cellules ; voir tableau des matériaux). Incuber les cellules à 37 oC et 5% de CO2 pour 24 h pour leur permettre de se fixer.
      REMARQUE : Réservez 1,5 x 106 de chaque population cellulaire pour confirmer leur pureté par cytométrie d’écoulement.
    7. Effectuez une analyse cytométrique du débit pour vérifier la pureté des populations cellulaires.
      REMARQUE: Nous considérons microglia CD11b '/CD45+'/GFAP- et astrocytes CD11b-/CD45-/GFAP+'. La coloration Iba1 et TMEM119 pourrait être envisagée afin de caractériser pleinement les microglies22.
    8. Ajouter un FMO (Fluorescence Moins One)23 et un échantillon non souillé pour chaque population cellulaire (astrocytes et microglies) comme témoins de l’analyse de cytométrie d’écoulement.
    9. Pour chaque population cellulaire, réservez 5 x 105 cellules pour chaque échantillon taché et non souillé. Pour l’OMF, réservez deux autres tubes de microglies contenant 2,5 x 105 cellules chacun et réservez également un autre tube de 5 x 105 astrocytes.
      REMARQUE : Étant donné que le nombre de microglies peut être un facteur limitant, il est possible d’utiliser moins de cellules pour des contrôles non contaminés et fMO.
    10. Centrifuge tous les microtubes à 450 x g pendant 5 min à 4 oC. Jetez le supernatant et réutilisez la granule avec 500 L/microtube de tampon FACS (saline tamponnée par phosphate (PBS) - 0,5% albumin de sérum bovin (BSA) - 2 mM EDTA, pH 7.2).
    11. Centrifuge tous les microtubes à 450 x g à 4 oC pendant 5 min. Jeter le supernatant et résuspendre la granule avec 100 L/microtube d’anti-CD16/CD32 (clone 93) (1:50) dilué dans le tampon FACS. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante.
    12. Ajouter 500 L/microtube de tampon FACS dans tous les microtubes et centrifugeuse à 450 x g à 4 oC pendant 5 min. Jeter le supernatant. Les astrocytes et les tubes de colorant de microglie et aussi le tube FMO astrocyte avec 50 l/microtube de marqueurs de surface se mélangent : anti-CD45 (PE, clone 30-F11) et anti-CD11b (eFluor 450, clone M1/70) (tous deux dilués à 1: 100 dans le tampon FACS).
    13. Pour les cellules non contaminées, réutilisez-la avec le même volume de tampon FACS. Pour les microglies FMO, incuber chaque tube de microglie avec anti-CD45 ou anti-CD11b. Incuber tous les échantillons à 4 oC pendant 20 minutes dans l’obscurité.
    14. Ajouter 500 L de tampon FACS par microtube. Centrifugeuse à 450 x g à 4 oC pendant 5 min. Jeter le supernatant et réutiliser la granule avec 100 lL/microtube de tampon de fixation (voir tableau des matériaux) pendant 20 minutes à température ambiante dans l’obscurité.
    15. Ajouter 500 l/microtube de tampon de perméabilisation 1x (voir tableau des matériaux) et incuber à 4 oC pendant 5 minutes dans l’obscurité.
    16. Centrifuge tous les microtubes à 450 x g à 4 oC pendant 5 min. Jeter le supernatant. Résuspendent des astrocytes et des tubes de colorant de microglies et aussi des tubes FMO de microglie avec 50 l/microtube d’anticorps intracellulaires anti-GFAP (APC, clone GA5) dans une dilution de 1:100 dans le tampon de perméabilisation de 1x. Pour les cellules non contaminées et l’astrocyte FMO, réutilisez les cellules avec le même volume de tampon FACS. Incuber tous les échantillons à 4 oC pendant 30 minutes dans l’obscurité.
    17. Laver tous les tubes en ajoutant 500 L/microtube de tampon de perméabilisation 1x. Centrifuge tous les microtubes à 450 x g, pour 5 min à 4 oC. Réutilisez chaque microtube dans 200 L de tampon FACS. Acquérir 1 x 105 événements/échantillon sur le cytomètre de flux.
    18. Pour l’analyse, les cellules doivent être fermées d’abord sur CD11b x CD45, puis GFAP histogramme.
      REMARQUE : Les contrôles non entretenus et les contrôles FMO sont utiles pour déterminer les portes.

2. Infection et évaluation des taux d’infection

  1. Infection des cellules gliales avec T. gondii
    1. Plaque 3 x 104 microglies ou astrocytes avec DMEM/F12 complété à 37 oC et 5% de CO2 pour 24 h dans une plaque plate prétraitée de 96 puits (voir Tableau des matériaux).
    2. Infecter chaque population cellulaire avec des tachyzoites de T. gondii RH souche exprimant la protéine fluorescente jaune (YFP) à une multiplicité d’infection (MOI) de 1:1 (parasite:cellule) dilué dans 200 L / puits de supplémenté RPMI (3 % FBS - 0,16 mM Pénicilline - 0,18 mM Streptomycine - 12,5 mM HEPES - 30 mM de bicarbonate de sodium, pH 7.2) (voir Tableau des matériaux). Incuber à 37 oC et 5% de CO2 pour 48 h.
    3. Ensuite, jetez le supernatant et fixez les cellules en ajoutant 100 L/puits de 1% de paraformaldéhyde (PFA) dilué dans PBS à 4 oC pour 24 h.
    4. Remplacer PFA par 100 L/puits de PBS à pH 7.2.
    5. Retirez soigneusement les noyaux des cellules supernatantes et des cellules tachetées en tuyautant 50 L/puits de DAPI (5 mg/mL) dilués dans PBS pH 7,2 (1:1 000) pendant 1 min à température ambiante dans l’obscurité.
    6. Remplacez la solution de coloration DAPI par 100 L/puits de PBS (pH 7.2) et analysez-la par microscopie à fluorescence.
  2. Infection des cellules gliales avec T. cruzi
    1. Plaque 3 x 104 microglies ou astrocytes avec DMEM/F12 complété à 37 oC et 5% de CO2 pour 24 h dans une plaque plate prétraitée de 96 puits (voir Tableau des matériaux).
      REMARQUE : Pour chaque fois, utilisez une plaque différente.
    2. Infectez les cellules gliales avec des trypomastigotes de la souche T. cruzi Y à un MOI de 5:1 (parasites:cell) dilués dans 200 L/puits de RPMI complété et incuber à 37 oC et 5% DE CO2 pour 2 h.
      REMARQUE: Cette étape est importante pour l’invasion cellulaire par le parasite.
    3. Retirez tous les supernatants et lavez les puits en ajoutant 200 L/puits de RPMI complété pour enlever tous les parasites extracellulaires. Retirez le supernatant et ajoutez 200 L/puits de RPMI frais complété.
      REMARQUE: Cette étape vise à éliminer tous les parasites qui n’ont pas envahi les cellules adhérentes.
    4. Incuber les cellules infectées pour 2 h, 48 h et 96 h pour évaluer la réplication de T. cruzi dans les cellules gliales11.
    5. Après chaque fois, retirez le supernatant et fixez les cellules avec 100 L/puits de méthanol pendant 15 minutes à température ambiante, puis remplacez le méthanol par 100 L/puits de PBS (pH 7.2).
    6. Après fixation, préparer les cellules pour l’essai d’immunofluorescence comme suit.
      1. Pour éviter l’autofluorescence, traiter les cellules avec 100 L/puits de 50 mM NH4Cl dilué dans PBS (pH 8.0) pendant 15 min. Laver les cellules en ajoutant 100 L/puits de PBS et l’enlever immédiatement (répéter cette étape 3 fois).
      2. Ensuite, perméabiliser les cellules en ajoutant 100 L/puits de 0,5% Triton dilué dans PBS pendant 15 min. Laver les cellules en ajoutant 100 L /puits de PBS et l’enlever immédiatement (répéter cette étape 3 fois).
      3. Ensuite, incuber la culture cellulaire avec 100 L /bien de solution de blocage (5% de lait non gras - 2% BSA dilué dans PBS [pH 7.2]) pour 1 h à température ambiante. Laver les cellules en ajoutant 100 L/puits de PBS et l’enlever immédiatement (répéter cette étape 3 fois).
      4. Afin de tacher les amastigotes, incuber avec 30 L/puits d’anticorps monoclonal non commercial (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 protéine (1:200) dilué dans la solution de blocage pour 1 h à température ambiante.
      5. Laver les cellules en ajoutant 100 L/puits de PBS et l’enlever immédiatement (répéter cette étape 3 fois). Incuber la plaque avec 30 L/puits d’anticorps anti-souris secondaires (1:500) dilués dans PBS pendant 1 h à température ambiante.
        REMARQUE : La protéine anti-Ssp-4 non commerciale de mAb 2C2 était un bon cadeau du professeur Renato A. Mortara du Département de microbiologie, d’immunologie et de parasitologie de l’Université fédérale de Sao Paulo.
      6. Retirez soigneusement les noyaux supernatants et tachetés en ajoutant 50 l/puits de DAPI (5 mg/mL) dilués dans PBS pH 7.2 (1:1,000) pendant 1 min à température ambiante dans l’obscurité.
      7. Remplacez la solution de coloration DAPI par une microscopie à 100 L/puits de PBS pH 7.2 et analysez-la par microscopie à fluorescence.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Le 14e jour, la culture des cellules gliales(figure 1A) a subi une dissociation mécanique. Les populations cellulaires isolées ont été analysées par cytométrie d’écoulement selon les marqueurs CD11b, CD45 et GFAP. Nous avons pu observer une pureté de 89,5% pour la population d’astrocytes et de 96,6% pour la population de microglies(figure 1B). Après l’isolement, les cellules ont été plaquées dans une plaque plate de 9...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

L’importance d’étudier les fonctions isolées des cellules gliales dans des contextes biologiques distincts s’est développée au cours des deux dernières décennies. Comprendre le SNC au-delà des neurones est encore un domaine croissant dans la biologie cellulaire, en particulier dans les infections ou les conditions inflammatoires8,9,24. Les cellules glials sont cruciales non seulement pour le soutien physique des neurones (comme ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier le professeur Renato A. Mortara de l’Université fédérale de Sao Paulo (UNIFESP) pour mAb 2C2 anti-Ssp-4. Ce travail a été soutenu par des subventions de Fundaço de Amparo à Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP, subvention 2017/25942-0 à K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient-fico e Tecnol-ogico (CNPq, 402100/2016-6 à K.R.B.), Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Vacinas (INCTV/CNPq) et Coordenaçao de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nàvel Superior (CAPES, Code financier 001). M.P.A. reçoit une bourse du CNPq, A.L.O.P. reçoit une bourse de CAPES, et I.S.F et L.Z.M.F.B. reçoivent une bourse de la FAPESP.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
70 %d’éthanol Dinâ ; mica Quí ; mica Contemporâ ; nea Cat : 2231Stériliser
75 cm2 FlaconCorningCat : 430720UMatière plastique
96 puits plaque de culture cellulaireGreiner CellstarCat : 655090Culture cellulaire
Chlorure d’ammonium (NH4Cl)Dinâ ; mica Quí ; mica Contemporâ ; neaCat : C10337.01.AHSupprimer l’autofluorescence
Anticorps anti-GFAPAbcamCat. : ab49874Immunofluorescence antidoby
Bottle Top Filter 0.22 &mu ; mm CACorningCat : 430513Milieu de culture
Filtre Albumine sérique bovine (BSA)Sigma AldrichCat : A7906FACS Préparation du tampon
CD11b (FITC)BD PharmigenCat. : 553310Anticorps de cytométrie en flux
CD45 (PE)InvitrogenCat. : 12-0451-83Centrifugeuse d’anticorps de cytométrie en flux
EppendorfCat : 5810RCentrifugeuse de centrifugation
Eppendorf5415RCentrifugation
Classe II Enceinte de biosécuritéPachaneCat : 200Armoire de biosécurité pour procédures stériles
CO2 IncubateurThermoScientificModèle : 3110Maintenance des cellules primaires
Tubes coniques 15 mLCorningCat : 430766Matière plastique
Tubes coniques 50 mLCorningCat : 352070Matière plastique
Compteur de cellules automatisé CountessInvitrogenCat : C10281Compteur de cellules
DAPIInvitrogenCat. : D1306Antidoby d’immunofluorescence
Appareil photo de microscope numériqueNikonCat : DS-RI1Capture d’images au microscope
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)GibcoCat : 12800-058Milieu de culture cellulaire
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)Sigma AldrichCat : E9884FACS Préparation du tampon
F12 Mélange de nutrimentsGibcoCat : 21700-026Milieu de culture cellulaire
FACS Canto IIBD BiosciencesCytomètre enflux
indisponible Sérum fœtal bovin (FBS)LGC BiotechnologyCat : 10-bio500-1Complément de milieu de culture cellulaire
Flow Jo (logiciel)Flow JoVersion : Flow Jo_9.9.4Analyse des données
Fluorescence lumière intenseComment : C-HGFISource de fluorescence
GFAP (APC)InvitrogenCat. : 50-9892-82Anticorps de cytométrie en flux
IgG de chèvre - anti-souris (FITC)Kirkeegood& Perry Lab (KPL)Cat. : 172-1806Antidoby d’immunofluorescence
HBSS - Solution saline équilibrée de HankGibcoCat : 14175079Milieu de culture cellulaire
HEPESSigma AldrichCat : H4034Supplément de milieu de culture
cellulaire IC Fixation BufferInvitrogenCat : 00-8222-49Fixation cellulaire pour citométrie en flux
Microscope inverséNikonModèle : ECLIPSE TS100Microscope
IsofluraneCristá ; liaCat : 21.2665Anesthésique inhalé
MethanolSynthCat : 01A1085.01.BJFixation pour immunofluorescence
Micro spatuleABC inoxydableIndisponibleMatériau chirurgical
Microtube 1,5 mLAxygenCat : MCT-150-CMatière plastique
Anticorps monoclonal (mAb) 2C2 anti-Ssp-4Non commercialcommercialImmunofluorescence antidoby
Pipette multicanaux (p200)CorningCat : 751630124Réactifs pour pipette
NIS Elements SoftwareNikonVersion 4.0Acquisition et analyse d’images
Lait écréméNestlé ;Cat : 9442405Solution bloquante pour l’immunofluorescence
Incubateur à agitateur orbitalThermoScientificModèle : 481 Cat : 11Dissocier la microglie des astrocytes
Paraformaldéhyde (PFA)Sigma AldrichCat : P6148Fixation pour l’immunofluorescence
PBSNon commercialcommercialTampon neutre
Pénicilline GSigma AldrichCat : P-7794Supplément de milieu de culture cellulaire
Tampon de perméabilisation (10x)InvitrogenCat : 00-8333-56Perméabilisation cellulaire pour citométrie en flux
Boîte de Petri 60 mm x 15 mm (jetable, stérile)ProlabCat : 0303-8PH-mètre en matière plastique
KasviK39-1014BCalibrer la solution de pH
RPMI 1640 MediumGibcoCat : 31800-014Milieu de culture cellulaire
CiseauxABC inoxCat : LO9-W4Matériel chirurgical
Pipette sérologique 10 mLCorningCat : 4101Matière plastique
Pipette sérologique 5 mLCorningCat : 4051Matière plastique
Pipette monocanal (p1000)Gilson PipetmanCat : F123602Réactifs de pipette
Simple Pipette à canal (p200)Gilson PipetmanCat : F123601Réactifs de pipette
Bicarbonate de sodium Sigma AldrichCat : S6297Supplément de milieu de culture cellulaire
Sel de sulfate de streptomycineSigma AldrichCat : S9137Supplément de milieu de culture cellulaire
Triton X-100Sigma AldrichCat : T9284Perméabilisation pour immunofluorescence
TrypsineGibcoCat : 27250-018Enzyme digestive
Pince à épilerABC inoxCat : L28-P4-172Matériel chirurgical
Bain d’eauNovatecnicaModèle : 09020095Digeste tissu à 37 ° ; C avec trypsine
Non Non

Références

  1. Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).
  2. Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
  3. Jäkel, S., Dimou, L. Glial Cells and Their Function in the Adult Brain: A Journey through the History of Their Ablation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 1-17 (2017).
  4. Streit, W. J. Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS. Glia. 40 (2), 133-139 (2002).
  5. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends in Neuroscience. 32 (12), 638-647 (2009).
  6. Virchow, R. Die Cellularpathologie in ihrer Begründung auf physiologische and pathologische Gewebelehre. Verlag von August Hirschfeld, Berlin. , (1858).
  7. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  8. Samartino, C. G., et al. Brucella abortus induces the secretion of proinflammatory mediators from glial cells leading to astrocyte apoptosis. American Journal of Pathology. 176 (3), 1323-1338 (2010).
  9. Jamilloux, Y., et al. Inflammasome activation restricts Legionella pneumophila replication in primary microglial cells through flagellin detection. Glia. 61 (4), 539-549 (2013).
  10. Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
  11. Pacheco, A. L., et al. The impairment in the NLRP3-induced NO secretion renders astrocytes highly permissive to T. cruzi replication. Journal of Leukocyte Biology. 160 (1), 201-207 (2019).
  12. Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115(2012).
  13. Lian, H., Roy, E., Zheng, H. Protocol for Primary Microglial Culture Preparation. Bio-Protocol. 6 (21), 1-10 (2016).
  14. Lüder, C. G. K., Giraldo-Velásquez, M., Sendtner, M., Gross, U. Toxoplasma gondii in primary rat CNS cells: Differential contribution of neurons, astrocytes, and microglial cells for the intracerebral development and stage differentiation. Experimental Parasitology. 92 (1), 23-32 (1999).
  15. Chagas, C. Nova tripanozomiaze humana: estudos sobre a morfolojia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi n. gen., n. sp., ajente etiolojico de nova entidade morbida do homem. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 1 (2), (1909).
  16. Berkowitz, A. L., Raibagkar, P., Pritt, B. S., Mateen, F. J. Neurologic manifestations of the neglected tropical diseases. Journal of Neurological Sciences. 349 (1), 20-32 (2015).
  17. Jones, J. L., et al. Toxoplasmic encephalitis in HIV-infected persons: risk factors and trends. The Adult/Adolescent Spectrum of Disease Group. AIDS. 10 (12), 1393-1399 (1996).
  18. Luft, B. J., et al. Toxoplasmic Encephalitis in Patients with the Acquired Immunodeficiency Syndrome. New England Journal of Medicine. 329 (14), 995-1000 (1993).
  19. Madalosso, G., et al. Chagasic meningoencephalitis: Case report of a recently included AIDS-defining illness in Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 46 (4), 199-202 (2004).
  20. Rocha, A., et al. Pathology of patients with Chagas’ disease and acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 50 (3), 261-268 (1994).
  21. Yasukawa, K., et al. Case report: Trypanosoma cruzi meningoencephalitis in a patient with acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (1), 84-85 (2014).
  22. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  23. Roederer, M. Compensation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 22 (1), (2002).
  24. Silva, A. A., et al. Priming astrocytes with TNF enhances their susceptibility to Trypanosoma cruzi infection and creates a self-sustaining inflammatory milieu. Journal of Neuroinflammation. 14 (182), (2017).
  25. Tsacopoulos, M., Evêquoz-Mercier, V., Perrottet, P., Buchner, E. Honeybee retinal glial cells transform glucose and supply the neurons with metabolic substrate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8727-8731 (1988).
  26. Nagase, M., Takahashi, Y., Watabe, A. M., Kubo, Y., Kato, F. On-site energy supply at synapses through monocarboxylate transporters maintains excitatory synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2605-2617 (2014).
  27. Buckman, L. B., Thompson, M. M., Moreno, H. N., Ellacott, K. L. J. Regional astrogliosis in the mouse hypothalamus in response to obesity. Journal of Comparative Neurology. 521 (6), 1322-1333 (2013).
  28. Vesce, S., Bezzi, P., Volterra, A. The active role of astrocytes in synaptic transmission. Cellular and Molecular Life Sciences. 56 (11-12), 991-1000 (1999).
  29. Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. The Pathophysiological Role of Microglia in Dynamic Surveillance, Phagocytosis and Structural Remodeling of the Developing CNS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 191(2017).
  30. Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
  31. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079(2013).
  32. Sarkar, S., et al. Rapid and refined CD11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility. Journal of Visualized Experiments. (122), e55364(2017).
  33. Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (66), e3814(2012).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Isolation de la microgliecytom trie en fluxmicroscopie fluorescencedissociation m caniqueculture cellulairetraitement la trypsinelavages au HBSSmilieu DMEM F12
Isolement concomitant des astrocytes primaires et des microglies pour l’infection de parasite de Protozoa
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.