Détection des espèces réactives totales d’oxygène dans les cellules adhérentes par 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacétate Staining

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour détecter l’espèce totale d’oxygène réactif cellulaire (ROS) à l’aide de 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacétate (DCFH-DA). Cette méthode permet de visualiser la localisation cellulaire de ROS dans les cellules adhérentes avec un microscope à fluorescence et de quantifier l’intensité de ROS avec un lecteur de plaque de fluorescence. Ce protocole est simple, efficace et rentable.

Résumé

Le stress oxydatif est un événement important dans des conditions physiologiques et pathologiques. Dans cette étude, nous démontrons comment quantifier le stress oxydatif en mesurant l’espèce réactive totale d’oxygène (ROS) en utilisant 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacétate (DCFH-DA) coloration dans les lignées cellulaires cancéreuses colorectales à titre d’exemple. Ce protocole décrit des étapes détaillées comprenant la préparation de la solution DCFH-DA, l’incubation des cellules avec la solution DCFH-DA, et la mesure de l’intensité normalisée. La coloration DCFH-DA est un moyen simple et rentable de détecter le ROS dans les cellules. Il peut être utilisé pour mesurer la génération de ROS après un traitement chimique ou des modifications génétiques. Par conséquent, il est utile pour déterminer le stress oxydatif cellulaire sur le stress de l’environnement, fournissant des indices pour les études mécanistes.

Introduction

Trois espèces réactives principales d’oxygène (ROS) produites par le métabolisme cellulaire qui sont de signification physiologique sont l’anion de superoxyde, le radical d’hydroxyle, et le peroxyde d’hydrogène^1. À de faibles concentrations, ils participent à des processus cellulaires physiologiques, mais à des concentrations élevées, ils ont des effets néfastes sur les voies de signalisation cellulaire¹. Notre corps a développé des systèmes antioxydants, qui sont efficaces contre le ROS excessif. Cependant, le stress oxydatif peut se produire lorsque ROS submerger la capacité détoxifiante de notre corps, ce qui contribue à de nombreuses conditions pathologiques, y compris l’inflammation, le cancer, et la maladie neurodégénérative^2,3,4. Le but de cette méthode est de déterminer le ROS cellulaire total dans les cellules adhérentes à l’aide de la coloration 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacétate (DCFH-DA). La raison en est que l’oxydation du DCFH-DA à 2'-7'dichlorofluorescein (DCF) a été largement utilisée pour la détection totale de ROS, y compris les radicaux hydroxyles (•OH) et le dioxyde d’azote (•NO₂). Mécaniquement, DCFH-DA est repris par les cellules où l’estérase cellulaire se fend des groupes d’acétyl, ce qui entraîne le DCFH. L’oxydation du DCFH par ROS convertit la molécule en DCF, qui émet une fluorescence verte à une longueur d’onde d’excitation de 485 nm et une longueur d’onde d’émission de 530 nm. Par rapport à la détection de la fluorescence avec la cytométrie de flux et d’autres méthodes alternatives⁵, les avantages de cette méthode à l’aide d’un microscope à fluorescence et un lecteur de plaque sont qu’il produit des images fluorescentes clairement visibles, et est facile à exécuter, efficace et rentable. Cette méthode a été largement utilisée pour détecter ros cellulaire pour l’étude de diverses conditions^6,7,8. Ce protocole est utilisé pour détecter le ROS total dans les cellules adhérentes. L’utilisation de cette méthode pour détecter le ROS dans les cellules de suspension peut avoir besoin de quelques modifications.

Protocole

1. Ensemencement cellulaire

1. Semences 2 x 10⁵ cellules cancéreuses colorectales HCT116 par puits dans une plaque de 24 puits et maintenir les cellules dans le milieu aigle modifié (DMEM) modifié de Dulbecco pendant la nuit à 37 °C.
2. Remplacer le milieu de culture par ou sans sulfate ferreux (FS) ou 10 μM de doxorubicine (DOX) contenant un milieu et un incuber pendant 24 h.

2. Préparation de la solution DCFH-DA

1. Dissoudre 4,85 mg de DCFH-DA dans 1 mL de sulfoxyde de diméthyle (DMSO) pour faire une solution de stock de 10 mM.
2. Diluer la solution de stock avec DMEM préchauffé en solution de travail de 10 μM juste avant de l’ajouter aux puits.
3. Vortex la solution de travail pour 10 s.

3. DCFH-DA coloration

1. Retirer le médicament contenant un milieu et laver une fois avec DMEM.
2. Ajouter 500 μL de la solution de travail DCFH-DA dans chaque puits et incuber à 37 °C pendant 30 min.
3. Supprimez la solution de travail DCFH-DA. Laver une fois avec DMEM et 2x avec 1x saline tamponnée de phosphate (PBS).
4. Ajouter 500 μL de 1x PBS à chaque puits.

4. Acquisition d’imagerie et mesure de l’intensité

1. Prenez des images fluorescentes représentatives pour chaque puits à l’aide du canal de protéine fluorescente verte (GFP) sur un microscope à fluorescence.
2. Après avoir pris des images, retirez PBS et ajoutez 200 μL de tampon d’essai de radioimmunoprécipitation (RIPA) à chaque puits.
3. Incuber sur la glace pendant 5 min, puis recueillir le lysate cellulaire dans des tubes de 1,5 mL.
4. Centrifugeuse à 21 130 x g pendant 10 min à 4 °C.
5. Transférer 100 μL du supernatant sur une plaque de puits noire de 96 et mesurer l’intensité de fluorescence à l’aide d’une fluorescence un lecteur de microplaques à une longueur d’onde d’excitation de 485 nm et une longueur d’onde d’émission de 530 nm.
6. Transférer 1 μL du supernatant sur une plaque claire de 96 puits contenant 100 μL de solution d’analyse protéique 1x pour mesurer la concentration de protéines à l’aide de l’essai de Bradford⁹.
7. Normaliser les intensités de fluorescence avec des concentrations de protéines.

Résultats

Les cellules cancéreuses colorectales HCT116 ont été traitées avec 100 μM FS ou 10 μM DOX pour induire un stress oxydatif⁷. Comme le montre la figure 1, la fluorescence verte a été considérablement augmentée par FS et DOX comme prévu. Pour quantifier le changement relatif d’intensité, les cellules ont été lysées après prise d’images et normalisées avec des concentrations de protéines. L’intensité quantifiée de fluorescence a été significativement augmentée par FS ou D...

Discussion

Le protocole expérimental décrit ici est facilement reproductible pour mesurer le total cellulaire ROS. Les étapes critiques incluent la fabrication de la solution DCFH-DA fraîche et l’évitement de l’exposition à la lumière, la minimisation des perturbations de l’état cellulaire et le lavage complet de PBS juste avant de prendre des images. Pour la préparation de la solution de travail DCFH-DA, la solution de stock doit être ajoutée dans DMEM préchauffé juste avant d’ajouter dans la plaque de puits 24. La raison en est q...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Diacétate de 2',7'-dichlorofluorescéine	Cayman Chemical, Ann Arbor, MI	20656
Chlorhydrate de doxorubicine	TCI America, Portland, OR	D4193-25MG
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Corning, Corning, NY	45000-304
Sulfate ferreux heptahydraté	VWR, Radnor, PA	97061-542
Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System	Thermo Fisher Scientific Waltham, MA	AMAFD1000	ou tout autre microscope à fluorescence
Dosage des protéines Solution Bradford	Bio-Rad, Hercules, CA	5000001
SpectraMax M2 Lecteur de microplaques	Dispositifs moléculaires, Radnor, PA	89429-532	ou tout autre lecteur de microplaques à fluorescence