L'approche décrite combine des tests expérimentaux de métastaser de veine de queue avec l'imagerie animale vivante in vivo pour permettre la surveillance en temps réel de la formation et de la croissance de métastes de cancer du sein en plus de la quantification du nombre et de la taille des métastes dans les poumons.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Utilisation combinée des essais de métastases de veine de queue et de l'imagerie in vivo en temps réel pour quantifier la colonisation métastatique et le fardeau du cancer du sein dans les poumons
Dans cet article
Résumé
Résumé
La métastase est la principale cause de décès liés au cancer et il existe peu d'options thérapeutiques pour les patients atteints de maladie métastatique. L'identification et l'essai de nouvelles cibles thérapeutiques qui faciliteront le développement de meilleurs traitements pour la maladie métastatique exigent des modèles précliniques in vivo. Démontré ici est un modèle de souris syngénéique pour assainer la colonisation métastatique de cancer du sein et la croissance suivante. Les cellules cancéreuses métastatiques sont traitées de façon stable avec des vecteurs viraux codant la luciferase firefly et les protéines ZsGreen. Les gènes candidats sont ensuite manipulés de façon stable dans les cellules cancéreuses exprimant la luciferase/ZsGreen, puis les cellules sont injectées chez la souris par l'intermédiaire de la veine latérale de la queue pour mettre en évidence la colonisation et la croissance métastatiques. Un dispositif d'imagerie in vivo est ensuite utilisé pour mesurer la bioluminescence ou la fluorescence des cellules tumorales chez les animaux vivants afin de quantifier les changements dans la charge métastatique au fil du temps. L'expression de la protéine fluorescente permet de quantifier le nombre et la taille des métastases dans les poumons à la fin de l'expérience sans avoir besoin de sectionnement ou de coloration histologique. Cette approche offre un moyen relativement rapide et facile de tester le rôle des gènes candidats dans la colonisation et la croissance métastatiques, et fournit beaucoup plus d'informations que les tests traditionnels de métastase de veine de queue. En utilisant cette approche, nous montrons que le renversement simultané de la protéine associée Oui (YAP) et du co-activateur transcriptionnel avec un motif liant PDZ (TAZ) dans les cellules cancéreuses du sein conduit à une réduction de la charge métastatique dans les poumons et que cette charge réduite est le résultat d'une colonisation métastatique considérablement altérée et d'une croissance réduite des métastases.
Introduction
Le cancer reste la deuxième cause de décès dans le monde1 et la métastes est responsable de la majorité de ces décès2,3. Cependant, une compréhension limitée des mécanismes moléculaires qui régissent la colonisation métastatique et la croissance subséquente a entravé le développement de traitements efficaces pour la maladie métastatique. L'identification de nouvelles cibles thérapeutiques nécessite un essai pour tester comment l'expression ou la fonction perturbée d'un gène candidat influence la formation et la croissance de métastes. Bien que les modèles de souris autochthonous aient l....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Ce protocole implique l'utilisation de souris et de matériaux biodangereux et nécessite l'approbation des comités de sécurité institutionnels appropriés. Tous les travaux in vivo décrits ici sont approuvés par le comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) du Collège médical d'Albany.
REMARQUE : Pour une vue d'ensemble du protocole, voir schéma à la figure 1.
1. Emballage de tous les rétrovirus et lentivirus requis
REMARQUE : Le protocole décrit utilise des vecteurs lentiviraux ou rétroviraux pour exprimer de façon stable une enzyme d....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Pour démontrer l'approche ci-dessus, nous avons effectué une expérience de preuve de concept dans laquelle un facteur critique de réplication, RPA3 a été renversé dans une lignée métastatique de cellules de carcinome mammaire de souris (4T122). Alors que le protocole décrit l'étiquetage des cellules avec des protéines à la fois luciferase et fluorescente avant la manipulation génétique, nous avons utilisé une approche modifiée parce que les vecteurs RNAi fournissent également ZsGreen (
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Étapes critiques de la méthode
Il est essentiel d'optimiser le nombre de cellules injectées (étape 3) pour une lignée cellulaire donnée et une souche de souris, car cela peut grandement influencer le nombre de métastases qui se forment et la durée de l'expérience. Si trop de cellules sont injectées ou si les métastases se développent trop longtemps, les métastases peuvent être difficiles à compter, ce qui rend les effets de la manipulation génétique difficiles à évaluer. Cependant, si trop peu de cell.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Nous remercions Emily Norton d'avoir aidé à l'aide aux infections virales et à la lecture critique du manuscrit. Nous remercions également Ryan Kanai pour son aide dans l'acquisition d'images des poumons et Kate E. Tubbesing pour l'aide à l'analyse de l'image des métastases vertes dans les poumons. Nous remercions le personnel des installations de recherche animale pour leur soutien et leur aide dans la préparation de cette vidéo. Ce travail a été soutenu par une subvention Susan G. Komen Catalyseur de carrière qui a été accordée à J.M.L. (#CCR17477184).
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 10 % SDS-PAGE Gel | Pour western blot | ||
| 2,5 % Trypsine | Gibco | 15090-046 | Trypsine pour la culture tissulaire |
| Plaque d’essai blanche à fond plat à 96 puits | Corning | 3922 | Pour mesurer le signal de la luciférase et de la renille dans les cellules cultivées |
| Lingettes imbibées | Pour steroliser le site d’injection avant l’induction de la veine caudale | ||
| souris BALB/C ( femelle, 6 semaines) | Taconic | BALB-F | Pour la colonisation métastatique de la veine caudale et les dosages de charge |
| BSA régulier | VWR Ameresco | 97061-416 | Pour le transfert western |
| Tampon de lyse cellulaire | Pour la collecte d’échantillons | ||
| Filtres de seringue Celltreat, PES 30mm, 0.45 &mu ; m | Celltreat | 40-229749-CS | Pour filtrer le surnageant viral |
| CO2 et la chambre | d’euthanasie Pour l’euthanasie des souris | ||
| Kit de dosage de la double luciférase rapporteur | Promega | E1960 | Pour mesurer le signal de la luciférase et de la renille dans les cellules cultivées |
| Dulbecco& 39; s solution saline tamponnée au phosphate | Himedia | TS1006 | Pour PBS |
| EDTA | VWR | 97061-406 | Utilisé pour diluer la trypsine pour la culture tissulaire |
| FBS 100 % Origine américaine | VWR | 97068-085 | Composant du milieu de croissance complet |
| Fujifilm LAS-3000 Imageur gel | Fujifilm | Pour western blot | |
| GAPDH(14C10) Rabibit mAb | Cell Signaling | 2118 | Pour Western blot |
| Anticorps IgG (H+L) secondaire de chèvre, conjugué HRP | Thermo Scientific | 31460 | Pour western blot |
| Cellules rénales embryonnaires humaines, HEK-293FT | Invitrogen | R70007 | Lignée cellulaire utilisée pour l’emballage du virus |
| HyClone DMEM/High clucose | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Composant du milieu de croissance complet |
| Hygromycine B, qualité Ultra Pure | VWR Ameresco | 97064-810 | Pour la sélection antibiotique des cellules infectées |
| I3-P/i3 Multimode Microplaque/EA | Dispositifs | Pour la mesure du signal de la luciférase et de la renille dans les cellules cultivées | |
| Imagej | Utilisé pour l’analyse d’images de métastases pulmonaires : seuil réglé sur 25 & 100 | ||
| Immuno-Blot Membrane PVDF Biorad | 1620177 | Pour western blot | |
| Isoflurane | Pour l’anesthésie de la souris | ||
| IVIS Lumina XRMS Système d’imagerie in vivo (dispositif d’imagerie in vivo d’animaux vivants) | PerkinElmer | CLS136340 | Pour l’imagerie in vivo de la charge métastatique |
| Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP et filtres en fond clair) | Leica Microsystems | Microscope et caméra pour la visualisation, le comptage et la prise de positions de métastases dans les poumons ; magnifacation 10X, exposition 3,5 sec, gain 1,4 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Composant du milieu de croissance complet |
| Lipofectamine 3000 | Life technologies | L3000008 | Pour la transfection |
| reporter YAP/TAZ-TEADLiving Image 3.2 (logiciel d’image) | Logiciel PerkinElmer | pour | |
| cellules cancéreuses du sein de souris IVIS, 4T1 | Karmanos Cancer Institute | Aslakson, CJ et al.,1992 | Lignée cellulaire de cancer métastatique de souris |
| Multi-Gauge version 3.0 | Fujifilm | Logiciel pour quantifier l’intensité de la bande de transfert western | |
| Opti-MEM (tampon de transfection) | Gibco | 31985-062 | Pour l’emballage du virus et la transfection |
| Pénicilline Streptomycine | Gibco | 15140-122 | Composant d’un milieu de croissance complet Kit de dosage des |
| protéines Pierce BCA | Thermo Scientific | 23225 | Pour quantifier la concentration en protéines |
| Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets | Thermo Scientific | A32957 | Ajouté au tampon de lyse |
| cellulaire Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets | Thermo Scientific | A32953 | Ajouté au tampon de lyse cellulaire |
| Polybrène (bromure d’hexadiméthrine) | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | Pour l’infection |
| Puromycine | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | Pour la sélection antibiotique des cellules infectées |
| Restricteur | Pour retenir les souris lors de l’induction de la veine caudale | ||
| Tampon | Pour le western blot | ||
| TAZ (V3886) | Signalisation cellulaire d’anticorps | 4883 | |
| tampon | |||
| compteur de cellules automatisé par transfert western TC20 | Bio-Rad | Pour le comptage des cellules | |
| Vecteurs | Voir le tableau 1 pour la liste complète des vecteurs | ||
| Microscope à fluorescence inversée VWR | VWR | 89404-464 | Pour la visualisation de la fluorescence dans Cellules marquées ZSGreen |
| de transfert Western | Pour transfert western | ||
| XenoLight D-Luciferin K+ Sel | PerkinElmer | 122799 | Substrat injecté à des souris pour des images IVIS bioluminescentes in vivo |
| Réactif de transfection d’ADN X-tremeGENE 9 (solution lipidique pour la transfection) | Roche | 6365787001 | Pour l’emballage du virus |
| YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb | Cell Signalisation cellulaire | 14074 | Pour western blot |
Références
- Ferlay, J. S. I., et al. GLOBOCAN 2012 v1.0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 11. , Available from: http://globocan.iarc.fr (2013).
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
