Quantification du lixiviation des métaux dans la chromatographie d'affinité métallique immobilisée

Résumé

Nous présentons un analyse pour la quantification facile des métaux introduits aux échantillons préparés utilisant la chromatographie immobilisée d'affinité de métal. La méthode utilise le bleu hydroxynaphthol comme indicateur de métal colorimétrique et un spectrophotomètre UV-Vis comme détecteur.

Résumé

La contamination des enzymes avec des métaux lessiminés à partir de chromatographie d'affinité métallique immobilisée (IMAC) colonnes pose une préoccupation majeure pour les enzymologues, comme beaucoup de cations communes di-et trivalents utilisés dans les résines IMAC ont un effet inhibiteur sur les enzymes. Cependant, l'étendue du lessivage des métaux et l'impact de divers réactifs d'éluetation et de réduction sont mal compris en grande partie en raison de l'absence de protocoles simples et pratiques de quantification des métaux de transition qui utilisent l'équipement habituellement disponible dans laboratoires de biochimie. Pour résoudre ce problème, nous avons développé un protocole pour quantifier rapidement la quantité de contamination des métaux dans les échantillons préparés à l'aide de l'IMAC comme étape de purification. La méthode utilise le bleu hydroxynaphthol (HNB) comme indicateur colorimétrique de la teneur en cation métallique dans une solution d'échantillon et la spectroscopie UV-Vis comme moyen de quantifier la quantité de métal présent, dans la gamme nanomolaire, basée sur le changement du spectre HNB à 647 nm. Bien que la teneur en métaux d'une solution ait toujours été déterminée à l'aide de la spectroscopie d'absorption atomique ou de techniques plasmatiques couplées inductivement, ces méthodes nécessitent un équipement spécialisé et une formation en dehors du champ d'application d'un laboratoire de biochimie typique. La méthode proposée ici fournit un moyen simple et rapide pour les biochimistes de déterminer la teneur en métaux des échantillons en utilisant l'équipement et les connaissances existants sans sacrifier la précision.

Introduction

Depuis sa création par Porath et ses collègues¹, la chromatographie d'affinité métallique immobilisée (IMAC) est devenue une méthode de choix pour séparer rapidement les protéines en fonction de leur capacité à se lier avec des ions métalliques de transition tels que Zn^{2 ,}Ni^{2 ,}Cu², et Co². Ceci est le plus souvent fait par l'intermédiaire des étiquettes de poly-histidine machinées et est maintenant l'une des techniques de purification chromatographique les plus communes pour l'isolement des protéines recombinantes^2. IMAC a également trouvé des applications au-delà de la purific....

Protocole

1. Préparation des composants d'essai

1. Déterminer les fractions de chromatographie à déterminer à l'aide de l'absorption optique à 280 nm ou d'autres méthodes de quantification des protéines pour identifier les fractions enrichies en protéines.
   REMARQUE : Pour ce travail, nous avons utilisé un spectrophotomètre UV-Vis de tableau de diode. Pour augmenter le débit, un lecteur de plaque capable de mesurer l'absorption UV-Vis peut être utilisé.
2. Préparation des composants d'essai nécessaires
   1. Préparer ou obtenir un tampon de 10 à 100 mm (« tampon d'échantillon ») avec un pH entre 7 et 12.
      REMARQUE : Les tampons biochimiques courants tels que....

Résultats

Le spectre de HNB libre au pH neutre (ligne noire) et les spectres représentatifs des fractions indiquées pour Ni^{2 '} de l'isolement de MSP1E3D1²⁹ sont indiqués dans la figure 2. Une série d'exemples réussies devrait démontrer une diminution de l'absorption à 647 nm par rapport au contrôle HNB, ce qui correspond à la formation de complexes HNB en présence d'un métal de transition. Un échec serait indiqué par une augmentation de l'absorption à 647 nm. Alterna.......

Discussion

La détection colorimétrique des métaux à l'aide de HNB fournit un moyen simple de quantifier le degré de contamination des protéines par les ions métalliques de transition provenant des résines IMAC. Comme nous l'avons établi dans l'arbitre 20, Ni^{2 s'associe} à HNB avec 1:1 stoichiométrie et la constante de dissociation pour le complexe Ni-HNB change avec le pH. Cependant, le complexe K_d est dans la gamme sous-nM pour toutes les valeurs recommandées (7-12) pH. Concrètement, cela signifie que tous les.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2xYT bouillon	Fisher Scientific	BP9743-500	milieu pour la croissance d’E.coli
HEPES, acide libre	BioBasic	HB0264	tampon alternatif
HisPur Ni-NTA résine	Thermo Scientific	88222
Hydroxynaphtol blue disoidum salt	Sigma-Aldrich	219916-5g
Imidazole	Fisher Scientific	O3196-500
Imidazole	BioBasic	IB0277
MOPS, acide libre	BioBasic	MB0360	tampon alternatif
Chlorure de sodium	Fisher Scientific	S271-500
Phosphate de sodium	Fisher Scientific	S369-500	tampon alternatif
Tricine	Gold Bio	T870-100
Base	TrisFisher Scientific	BP152-500
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500