Article de méthode

Quantifier la taille du foie chez le poisson zèbre larvaire à l'aide de la microscopie Brightfield

DOI :

10.3791/60744

⸱

2 février 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Department of Oncological Sciences, and Huntsman Cancer Institute, University of Utah School of Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici nous démontrons une méthode pour quantifier la taille du foie dans le poisson zèbre larvaire, fournissant un moyen d'évaluer les effets des manipulations génétiques et pharmacologiques sur la croissance et le développement de foie.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans plusieurs modèles transgéniques de poisson zèbre du carcinome hépatocellulaire (HCC), l'hépatomegaly peut être observé pendant les étapes larvaires tôt. La quantification de la taille du foie larvaire dans les modèles HCC du poisson zèbre fournit un moyen d'évaluer rapidement les effets des médicaments et d'autres manipulations sur un phénotype lié à l'oncogène. Ici, nous montrons comment fixer les larves de poissons zèbres, disséquer les tissus entourant le foie, photographier les foies à l'aide de microscopie de champ lumineux, mesurer la région du foie, et analyser les résultats. Ce protocole permet une quantification rapide et précise de la taille du foie. Comme cette méthode consiste à mesurer la région du foie, elle peut sous-estimer les différences dans le volume du foie, et des méthodologies complémentaires sont nécessaires pour différencier entre les changements dans la taille des cellules et les changements dans le nombre de cellules. La technique de dissection décrite ci-dessus est un excellent outil pour visualiser le foie, l'intestin, et le pancréas dans leurs positions naturelles pour une myriade d'applications en aval, y compris la coloration d'immunofluorescence et l'hybridation in situ. La stratégie décrite pour quantifier la taille du foie larvaire s'applique à de nombreux aspects du développement et de la régénération du foie.

Introduction

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Le carcinome hépatocellulaire (HCC) est la malignité primaire la plus commune du foie1 et la troisième cause principale de mortalité cancer-connexe2. Pour mieux comprendre les mécanismes de l'hépatocarcinogenèse et identifier les thérapeutiques HCC potentielles, nous et d'autres avons développé le poisson zèbre transgénique dans lequel l'expression hépatocyte-spécifique des oncogènes tels que la caténine3,4, Kras(V12)5,6, Myc7, ou Yap18 conduit à HCC chez les animaux adultes. Chez ces poissons zèbres, l'élargissement du foie est noté dès 6 jours après la fécondation (dpf), fournissant une plate-forme facile pour tester les effets des médicaments et des altérations génétiques sur la surcroissance du foie induite par les oncogènes. La mesure précise et précise de la taille du foie larvaire est essentielle pour déterminer les effets de ces manipulations.

La taille et la forme du foie peuvent être évaluées de façon semi-quantitative chez les larves fixes de poissons zèbres par CY3-SA étiquetant9 ou chez les larves vivantes de poissons zèbres à l'aide de reporters fluorescents spécifiques à l'hépatocyte et de la microscopie disséquer la fluorescence5,6. Cette dernière méthode est relativement rapide, et son manque de précision peut être abordé en photographiant et en mesurant la zone de chaque foie à l'aide d'un logiciel de traitement d'image7,10. Cependant, il peut être techniquement difficile de positionner uniformément toutes les larves vivantes dans une expérience telle que la région bidimensionnelle du foie est une représentation précise de la taille du foie. Une technique similaire pour quantifier la taille du foie consiste à utiliser la microscopie de fluorescence des feuilles légères pour quantifier le volume du foie larvaire8, qui peut être plus précis pour détecter les différences de taille lorsque le foie est élargi de façon non uniforme dans différentes dimensions. Le tri cellulaire activé par la fluorescence (FACS) peut être utilisé pour compter le nombre d'hépatocytes étiquetés fluorescents et d'autres types de cellules hépatiques dans les foies larvaires8,11. Dans cette méthode, les foies larvaires sont mis en commun et dissociés, de sorte que l'information sur la taille et la forme du foie individuel est perdue. En combinaison avec une autre méthode de détermination de la taille du foie, FACS permet la différenciation entre l'augmentation du nombre de cellules (hyperplasie) et l'augmentation de la taille des cellules (hypertrophie). Toutes ces méthodes utilisent une technologie de fluorescence coûteuse (microscope ou trieur de cellules) et, à l'exception de l'étiquetage CY3-SA, nécessitent l'étiquetage des hépatocytes avec un journaliste fluorescent.

Ici, nous décrivons en détail une méthode pour quantifier la zone du foie larvaire de poisson zèbre à l'aide de microscopie de champ lumineux et de logiciel de traitement d'image3,12,13,14. Ce protocole permet une quantification précise de la zone des foies individuels in situ sans l'utilisation de la microscopie de fluorescence. Tout en analysant la taille du foie, nous aveuglons l'identité de l'image pour réduire les biais des chercheurs et améliorer la rigueur scientifique15.

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Protocole

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Les études sur les animaux sont menées selon des procédures approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université de l'Utah.

1. Fixation des larves

  1. À 3 à 7 jours après la fécondation (dpf), euthanasiez les larves avec du méthane sulfonate de tricaine (0,03 %) et recueillir jusqu'à 15 larves dans un tube de 2 ml à l'aide d'une pipette en verre et d'une pompe à pipette.
  2. Laver les larves deux fois avec 1 ml de saline à phosphate (PBS) froide (4 oC) à l'alin tamponné par le phosphate (PBS). Pour chaque lavage, retirer autant de liquide que possible du tube avec une pipette en verre et une pompe à pipette, puis ajouter 1 ml de PBS froid au tube.
  3. Retirer autant de PBS que possible à l'aide d'une pipette en verre et d'une pompe à pipettes, et ajouter 1 ml de paraformaldéhyde froid (4 oC) à 4 % dans le PBS.
    CAUTION: PFA est un irritant et suspecté de cancérogène. Les gants doivent être portés lors de la manipulation de PFA, et les solutions concentrées doivent être manipulées dans une hotte chimique de fumée.
  4. Incuber à 4 oC au moins toute la nuit (mais jusqu'à plusieurs mois) avec un léger basculement.

2. Disséquer les tissus entourant le foie

  1. Retirer les larves de PFA en rinçant 3x avec 1 ml de PBS froid (4 oC) et en se balançant pendant 5 min entre les rinçants.
    REMARQUE : Il est acceptable de conserver les larves rincées dans le SCP pendant un jour ou deux à 4 oC.
  2. Pipette plusieurs larves dans PBS dans un puits d'un plat en verre à fond rond de 9 puits.
  3. Enlever la peau entourant le foie.
    1. Utilisez des forceps fins pour tenir la larve sur son dos (ventre vers le haut), saisissant de chaque côté de la tête aussi doucement que possible. Ensuite, utilisez des forceps très fins dans votre autre main pour saisir la peau juste au-dessus du cœur.
    2. Retirez la peau en diagonale vers la queue du poisson et le fond du plat sur le côté gauche ou droit du poisson. Répéter l'opération pour l'autre côté (droite ou gauche).
    3. Continuer à saisir les lambeaux de peau et en tirant vers le bas / dos jusqu'à ce que toute la peau et les mélanophores s'enlisant ou près du foie ont été enlevés.
  4. Retirer le jaune, s'il y a de la présence.
    1. Pour les larves de 5 à 6 dpf, soulever le jaune en un seul morceau en tenant le poisson avec de fines forceps sur le dos et en utilisant les forceps très fins pour pousser le jaune doucement.
    2. Pour les larves de 3 à 4 dpf, gratter le jaune en morceaux. Tenez le poisson avec de fines forceps sur le dos et utilisez les forceps très fins pour caresser le jaune, à partir du côté ventral.
  5. Placer les larves disséquées dans un PBS frais et froid à l'aide d'une pipette en verre et d'une pompe à pipette.

3. Imagerie

  1. Pour monter les larves, versez quelques ml de cellulose méthyle de 3 % sur le couvercle d'un plat Petri en plastique propre.
  2. Utilisez une pipette en verre et une pompe à pipettes pour ajouter des larves à la cellulose méthyle, en ajoutant le moins de PBS possible avec les larves.
  3. Sous un microscope disséquant à faible grossissement, utilisez des forceps fins pour orienter les poissons afin qu'ils soient couchés sur le côté droit, face à gauche.
    REMARQUE : Assurez-vous que les poissons sont parfaitement orientés sur le côté ou que les mesures du foie peuvent ne pas être exactes.
  4. Prenez une photo de chaque poisson.
    1. Confirmez que le poisson à photographier est parfaitement aligné, avec un œil directement sur le dessus de l'autre œil. Si nécessaire, utilisez des forceps fins pour taper légèrement sur la tête ou la queue des poissons pour ajuster l'orientation. Si la queue du poisson est pliée, retirez la queue en la pinçant avec force avec des forceps pour l'enlever afin que le poisson soit à plat.
    2. Zoom sur le grossissement élevé et se concentrer sur le foie, en s'assurant que le contour du foie est clairement visible.
    3. Prenez une photo et enregistrez le fichier.
    4. Répétez l'opération pour tous les poissons, en vous assurant que le grossissement est le même pour chaque image.
    5. Prenez une photo d'un micromètre en utilisant le même grossissement (voir Figure 2H).

4. Analyse d'image

  1. Mesurez la superficie du foie de chaque poisson à l'aide d'un logiciel de traitement d'image.
    1. Aveugle toutes les photos du foie pour éviter les biais potentiels des chercheurs et de promouvoir la rigueur scientifique15. Cette étape peut être effectuée manuellement par un autre membre du laboratoire ou à l'aide d'un programme informatique (Matériel supplémentaire). Renommer les fichiers au hasard et créer un « fichier de randomisation » contenant une liste des noms de fichiers originaux et des noms de fichiers aveugles correspondants.
    2. Ouvrez les fichiers randomisés dans l'ordre, en commençant par le fichier 1.
    3. Choisissez l'outil de sélections à main levée et définit chaque foie.
    4. Appuyez sur Ctrl-M pour mesurer la surface de chaque foie.
    5. Pour tous les foies qui ne peuvent pas être mesurés avec précision, insérez une mesure de placeholder (très petit ou très grand, ainsi il peut être facilement exclu plus tard).
    6. Enregistrer les mesures dans un fichier texte (« fichier de mesures »).
  2. Données non aveugles et d'analyse
    1. Ouvrez le « fichier de mesures » et le « fichier de randomisation » dans un programme de feuilles de calcul.
    2. Insérez une nouvelle colonne dans le « fichier de mesures » et ajoutez les noms de fichiers originaux pour les fichiers aveuglés, à l'aide du « fichier de randomisation ». Enregistrez ce fichier en tant que « fichier de mesures non aveuglés ».
    3. Trier les données par nom de fichier d'origine.
    4. Assurez-vous d'exclure toute mesure du foie pour laquelle les images étaient inadéquates (voir la figure 2A-G).
    5. Si nécessaire, convertir les valeurs de mesure en échelle désirée (mm2,par exemple).
      1. Ouvrez la barre d'échelle dans le logiciel de traitement d'image.
      2. Utilisez l'outil en ligne droite pour mesurer 1 mm sur la barre d'échelle. Le logiciel de traitement d'image mesurera dans les mêmes unités que les foies (pixels), donnant un facteur de conversion.
      3. Utilisez le facteur de conversion pour convertir les mesures dans le « fichier de mesures non aveuglés ».
    6. À l'aide du programme de feuilles de calcul ou de la saisie de données dans un logiciel de graphique et de statistiques scientifiques, déterminez l'écart entre la moyenne et la norme et calculez la valeur p.

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Résultats

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Le poisson zèbre transgénique exprimant l'hépatocyte-spécifique activé - caténine (Tg(fabp10a:pt---cat) zebrafish)3 et les frères et sœurs témoins non transgéniques ont été euthanasiés à 6 dpf et la zone hépatique a été quantifiée à l'aide d'un logiciel de microscopie et de traitement d'image brightfield. Les poissons zèbres transgéniques ont considérablement augmenté la taille du foie (0,0006 cm2) par rapport à leurs frères et sœurs non transgéniques (0,0004 cm2<...

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Discussion

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La quantification de la taille du foie est cruciale dans les études visant à comprendre le développement du foie, la régénération et l'oncogénèse. Le protocole décrit ici est une technique relativement rapide, facile et bon marché pour la quantification de la taille du foie chez le poisson zèbre larvaire. Faire preuve de prudence tout en exécutant certains aspects du protocole peut aider à une plus grande exactitude des résultats et à une diminution de la frustration.

Une bonne fixation des la...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous tenons à remercier Maurine Hobbs et la Ressource animale centralisée du poisson zèbre (CZAR) de l'Université de l'Utah pour avoir fourni de l'élevage de poissons zèbres, de l'espace de laboratoire et de l'équipement pour effectuer des parties de cette recherche. L'expansion de la CZAR est soutenue en partie par la subvention des NIH no 1G20OD018369-01. Nous tenons également à remercier Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum et le Huntsman Cancer Institute (HCI) Zebrafish Facility pour les soins du poisson zèbre. Nous tenons à remercier Kenneth Kompass pour son aide dans le programme R. Ces travaux ont été financés en partie par des subventions de la Huntsman Cancer Foundation (en conjonction avec la subvention P30 CA042014 accordée au Huntsman Cancer Institute) (KJE) et nih/NCI R01CA222570 (KJE).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Caméra pour microscope de dissectionLeica, par exemple
Microscope de dissectionLeica, par exemple
Pince fine (Dumont #5)Outils de science fine11254-20
Pipettes en verreVWR14672-608
Logiciel d’analyse d’imagesImage J/FIJIImageJ/FIJI peut être téléchargé gratuitement : https://imagej.net/Welcome
MéthylcelluloseSigmaM0387
ParaformaldéhydeSigma AldrichP6148
Solution saline tamponnée au phosphateDivers fournisseurs
Pompe à pipetteVWR53502-233
Boîtes de Pétri en plastiqueUSA Scientific Inc2906
Pyrex Boîte en verre à fond rond à 9 puitsVWR89090-482
Logiciel pour l’aveuglement des fichiersR projectR peut être téléchargé gratuitement : https://www.r-project.org/
Logiciel de graphiques et de statistiques scientifiquesGraphPad Prism
Tableur MicrosoftExcel
Méthanesulfonate de tricaïne (Tricaine-S)Western Chemical200-226
Pince très fine (Dumont #55)Outils scientifiques fins11255-20

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lin, D. -C., et al. Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).
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  5. Nguyen, A. T., et al. A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).
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Mots-clés

Liver Size QuantificationBrightfield MicroscopyZebrafish LarvaeTissue DissectionImage AnalysisPFA FixationMethylcellulose MountingFreehand SelectionScale Bar CalibrationHepatocellular Carcinoma

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