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Article de méthode

Évaluation de la fonction de mémoire chez les souris épileptiques induites par pilocarpine

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DOI :

10.3791/60751

⸱

4 juin 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Department of Biomedicine & Health Sciences, Catholic Neuroscience Institute, Institute of Aging and Metabolic Diseases, College of Medicine, The Catholic University of Korea

Dans cet article

Résumé

Cet article présente des procédures expérimentales pour évaluer des affaiblissements de mémoire dans les souris épileptiques pilocarpine-induites. Ce protocole peut être utilisé pour étudier les mécanismes pathophysiologic du déclin cognitif associé à l’épilepsie, qui est l’une des comorbidités les plus courantes dans l’épilepsie.

Résumé

L’affaiblissement cognitif est l’une des comorbidités les plus communes dans l’épilepsie de lobe temporel. Pour récapituler le déclin cognitif associé à l’épilepsie dans un modèle animal d’épilepsie, nous avons généré des souris épileptiques chroniques traitées par pilocarpine. Nous présentons un protocole pour trois tests comportementaux différents à l’aide de ces souris épileptiques : l’emplacement des objets nouveaux (NL), la reconnaissance d’objets nouveaux (NO), et les tests de séparation des motifs (PS) pour évaluer l’apprentissage et la mémoire des lieux, des objets et des contextes, respectivement. Nous expliquons comment définir l’appareil comportemental et fournir des procédures expérimentales pour les tests NL, NO et PS à la suite d’un essai en terrain ouvert qui mesure les activités locomotrices basales des animaux. Nous décrivons également les avantages techniques des essais de NL, de NO, et de PS en ce qui concerne d’autres essais comportementaux pour évaluer la fonction de mémoire chez les souris épileptiques. Enfin, nous discutons des causes et des solutions possibles pour les souris épileptiques ne parviennent pas à faire 30 s de bon contact avec les objets au cours des séances de familiarisation, qui est une étape critique pour les tests de mémoire réussies. Ainsi, ce protocole fournit des informations détaillées sur la façon d’évaluer les troubles de la mémoire associés à l’épilepsie à l’aide de souris. Les tests NL, NO et PS sont des essais simples et efficaces qui sont appropriés pour l’évaluation de différents types de mémoire chez les souris épileptiques.

Introduction

L’épilepsie est un trouble chronique caractérisé par des crises récurrentes spontanées1,2,3. Parce que les crises répétitives peuvent causer des anomalies structurelles et fonctionnelles dans le cerveau1,2,3, l’activité de crise anormale peut contribuer au dysfonctionnement cognitif, qui est l’une des comorbidités les plus communes associées à l’épilepsie4,5,6. Contrairement aux événements chroniques de saisie, qui sont transitoires et momentanés, les affaiblissements cognitifs peuvent persister tout au long de la vie des patients épileptiques, détériorant leur qualité de vie. Par conséquent, il est important de comprendre les mécanismes pathophysiologic du déclin cognitif associé à l’épilepsie.

Divers modèles animaux expérimentaux de l’épilepsie ont été utilisés pour démontrer les déficits d’apprentissage et de mémoire associés à l’épilepsie chronique7,8,9,10,11,12. Par exemple, le labyrinthe d’eau de Morris, le conditionnement contextuel de la peur, le tableau de trou, l’emplacement d’un objet nouveau (NL) et les tests de reconnaissance d’objets nouveaux (NO) ont souvent été utilisés pour évaluer le dysfonctionnement de la mémoire dans l’épilepsie du lobe temporel (TLE). Parce que l’hippocampe est l’une des régions primaires dans lesquelles TLE montre la pathologie, les tests comportementaux qui peuvent évaluer la fonction de mémoire dépendante de l’hippocampe sont souvent sélectionnés de préférence. Cependant, étant donné que les saisies peuvent induire la neurogenèse hippocampique aberrante et contribuer au déclin cognitif associé à l’épilepsie10, paradigmes comportementaux pour tester la fonction neuronale néonatale dentate (c.-à-d., séparation de modèle spatial, PS)8,13 peuvent également fournir des informations valables sur les mécanismes cellulaires des affaiblissements de mémoire dans l’épilepsie.

Dans cet article, nous démontrons une batterie de tests de mémoire, NL, NO, et PS, pour les souris épileptiques. Les tests sont simples et facilement accessibles et ne nécessitent pas un système sophistiqué.

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Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’Université catholique de Corée et ont été effectuées conformément au Guide national des instituts de santé pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire (publications des NIH no 80-23).

1. Test de localisation d’objets nouveaux (NL)

  1. Préparer les souris épileptiques C57BL/6 ou transgéniques 4 à 6 semaines après l’injection de pilocarpine.
    REMARQUE : Des saisies aigues ont été induites par l’injection intraperitoneal (IP) de pilocarpine, suivant le protocole détaillé dans notre rapport précédent14.
  2. Transférer les souris épileptiques de la salle de reproduction à la salle de comportement un jour avant le début des tests comportementaux. Laissez les souris s’habituer pendant au moins 12 h pendant la nuit.
  3. Dans la salle de comportement, séparer les souris individuelles dans de nouvelles cages pour un logement simple. Écrivez les informations pour chaque animal sur la carte de cage et gardez les animaux dans les mêmes cages tout au long des tests comportementaux. Plusieurs cages peuvent être transférées simultanément à l’aide d’un chariot.
  4. Le lendemain, commencez 3 jours de séances d’accoutumination (H1-H3) tôt le matin. Acclimatez les animaux à la faible lumière dans leurs cages domestiques pendant au moins 30 min.
  5. Préparer une boîte à champ ouvert avec des dimensions extérieures de 44 x 44 x 31 cm et des dimensions intérieures de 43 x 43 x 30,5 cm. Le jour 1 de l’accoutumance (H1), placez un illuminomètre au centre de la boîte à champ ouvert et ajustez l’éclairage à 60 lux.
  6. Vaporiser le sol et les murs de la boîte à champ ouvert avec 70% d’éthanol et essuyer avec un essuie-tout propre pour enlever les indices olfactifs possibles. Attendez ensuite au moins 1 min jusqu’à ce que l’alcool résiduel ait complètement séché.
  7. Évaluez l’activité locomotrice de chaque souris en effectuant un essai sur le terrain ouvert.
    1. Pour enregistrer et suivre le comportement de chaque souris expérimentale, utilisez un logiciel de suivi vidéo de comportement animal (voir Tableau des matériaux).
    2. Une fois le logiciel de suivi vidéo ouvert, étalonner la taille de la boîte à champ ouvert. Ensuite, définissez la zone de suivi. Définissez 3 s de latence et 15 min de temps d’acquisition pour éviter de suivre les mains d’un expérimentateur. Insérez les informations sur chaque souris expérimentale (groupe, sexe, âge, etc.).
    3. Ensuite, placez doucement une souris expérimentale dans la boîte à champ ouvert face au mur. Faites-le en le plaçant sur le couvercle de la cage pour minimiser le stress et l’anxiété associés à la manipulation. Ensuite, relâchez la souris près du mur de la boîte à champ ouvert qui est la plus éloignée de l’endroit où les objets seront pendant la session de familiarisation (étape 1.9.3.).
      REMARQUE : Une fois que la souris est dans la boîte ouverte, le logiciel de suivi de la souris la détectera automatiquement et commencera à enregistrer. Pour un suivi optimal de l’exploration, la caméra peut être placée directement au-dessus de la boîte à champ ouvert.
    4. Après 15 minutes d’enregistrement, remettre l’animal dans sa cage intérieure en le plaçant sur le couvercle de la cage. Nettoyez la boîte à champ ouvert avec un spray à 70 % d’éthanol et essuyez-le avec un essuie-tout propre entre les essais. Restaurer la lumière vive et mesurer la distance totale parcourue par l’animal à l’aide du logiciel de suivi vidéo selon les instructions du fabricant.
      1. Ouvrez le logiciel de suivi vidéo et les clips vidéo. Ensuite, cliquez sur Analyse pour calculer la distance totale parcourue en fonction de l’étalonnage de la taille de la boîte à champ ouvert.
  8. Le jour 2 et le jour 3, effectuez les séances d’accoutumétation (H2, H3) en répétant les étapes 1,3 à 1,7.
  9. Le jour 4, effectuer la séance de familiarisation (F1).
    1. Dans la pénombre, placez chaque souris dans le champ ouvert vide pendant 3 min. Après cette brève réadaptation, retournez l’animal dans sa cage.
    2. Pendant l’accoutumance, nettoyez soigneusement les objets avec 70% d’éthanol et essuyez-les avec un essuie-tout. Attendez qu’au moins 1 min pour que l’alcool résiduel sèche complètement.
    3. Placez deux objets identiques (poupées en caoutchouc, objet A) dans l’arène de champ ouvert à 5 cm des murs adjacents. Fixez les objets avec du ruban adhésif recto-verso. Introduisez la souris expérimentale dans la boîte à champ ouvert, face au mur le plus éloigné des objets.
    4. Autoriser l’exploration gratuite pendant 20 min et mesurer manuellement le temps passé à explorer les deux objets à l’aide de deux chronomètres. Une fois que la souris atteint le temps d’exploration minimum (30 s) pour les deux objets, arrêtez la session de F1 et transférez l’animal dans sa cage d’attache. Si la souris ne parvient pas à explorer les objets pendant 30 s dans les 20 minutes, retirez la souris de la boîte à champ ouvert et excluez-la des sessions supplémentaires.
    5. Une fois que l’animal est retiré de la boîte à champ ouvert, nettoyez soigneusement le sol et les murs de la boîte avec 70% de pulvérisation d’éthanol et essuyez-les avec un essuie-tout.
      REMARQUE : Mesurez l’heure à laquelle la souris touche les objets avec ses moustaches, son museau ou ses pattes avant. Ne quantifiez pas comme temps exploratoire tout comportement dans lequel le museau de l’animal ne pointe pas vers l’objet, comme s’asseoir sur l’objet, passer par l’objet, ou se reposer avec son extrémité postérieure pointant vers l’objet.
  10. Le jour 5, effectuez la séance d’essai de NL.
    1. Transférer la souris de sa cage à domicile à la zone ouverte pour la réadaptation pendant 3 min. Puis retournez l’animal dans sa cage.
    2. Pendant l’accoutumance, nettoyez soigneusement les objets avec 70% d’éthanol et essuyez-les avec un essuie-tout. Attendez qu’au moins 1 min pour que l’alcool résiduel sèche complètement.
    3. Déplacez un objet (poupée en caoutchouc, objet A) à la position diagonale, à 5 cm des murs adjacents. Fixez l’objet avec du ruban adhésif recto-verso. Transférer la souris expérimentale sur son couvercle de cage à la zone de champ ouvert et la placer face au mur de la boîte à champ ouvert.
      REMARQUE : Contrebalancer l’emplacement de l’objet déplacé pour réduire toute préférence innée potentielle pour une certaine direction. Par exemple, modifiez l’emplacement de l’objet préféré de la séance de familiarisation pour la moitié des animaux expérimentaux, et pour le reste des animaux, déplacez l’objet moins préféré de la séance de familiarisation.
    4. Autoriser 10 min d’exploration et d’enregistrement gratuits avec un système de suivi vidéo. Mesurer le temps passé à explorer chaque objet à l’aide de deux chronomètres et calculer le ratio de discrimination
      figure-protocol-1
      REMARQUE : Mesurez l’heure à laquelle la souris touche les objets avec ses moustaches, son museau ou ses pattes avant. Ne quantifiez pas comme temps exploratoire tout comportement dans lequel le museau de l’animal ne pointe pas vers l’objet, comme s’asseoir sur l’objet, passer par l’objet, ou se reposer avec son extrémité postérieure pointant vers l’objet.
    5. Attrapez la queue de la souris expérimentale et placez-la sur son couvercle de cage pour le transférer à sa cage à la maison. Pendant 3 jours (jours 6 à 8), laissez la souris se reposer avec un accès gratuit à la nourriture et à l’eau.
    6. Une fois que l’animal est retiré de la boîte à champ ouvert, nettoyez soigneusement le sol et les murs de la boîte avec 70% de pulvérisation d’éthanol et essuyez-les avec un essuie-tout.

2. Nouveau test de reconnaissance d’objets (NO)

  1. Le jour 9, effectuez une séance d’accoutumé 15 min en répétant les étapes 1.2-1.7.
  2. Le jour 10, effectuer la séance de familiarisation (F1).
    1. Dans la faible lumière, placer la souris dans le champ ouvert vide pendant 3 min. Après avoir réhabilité la souris à la zone de champ ouvert, retournez-la temporairement dans sa cage d’origine.
    2. Pendant l’accoutumance, nettoyez soigneusement les objets avec 70% d’éthanol et essuyez-le avec un essuie-tout. Attendez au moins 1 min pour que l’alcool résiduel sèche complètement.
    3. Placez deux objets identiques (tubes en plastique de 50 ml remplis de 40 ml d’eau, objet B) dans le champ ouvert à 5 cm des murs adjacents. Fixez les objets avec du ruban adhésif recto-verso. Introduisez la souris expérimentale dans la boîte à champ ouvert face au mur le plus éloigné des objets.
    4. Comme l’animal est exposé aux deux objets différents (tube en plastique de 50 ml rempli de 40 ml d’eau, objet B; bocal Coplin en verre, objet C) dans le test NO, contrebalancer l’objet pendant la session de F1. Par exemple, présenter deux objets identiques (pots coplin en verre, objet C) pour la moitié des animaux du groupe.
    5. Autoriser l’exploration gratuite pendant 20 min et mesurer manuellement le temps passé à explorer les deux objets à l’aide de deux chronomètres. Une fois que la souris atteint le temps d’exploration minimum (30 s) pour les deux objets, arrêtez la session de F1 et transférez l’animal dans sa cage d’attache. Si la souris ne parvient pas à explorer les objets pendant 30 s dans les 20 minutes, retirez-la de la boîte à champ ouvert et excluez-la des sessions supplémentaires.
    6. Une fois que l’animal est retiré de la boîte à champ ouvert, nettoyez soigneusement le sol et les murs de la boîte avec 70% de pulvérisation d’éthanol et essuyez-les avec un essuie-tout.
      REMARQUE : Mesurez l’heure à laquelle la souris touche les objets avec ses moustaches, son museau ou ses pattes avant. Ne quantifiez pas comme temps exploratoire tout comportement dans lequel le museau de l’animal ne pointe pas vers l’objet, comme s’asseoir sur l’objet, passer par l’objet, ou se reposer avec son extrémité postérieure pointant vers l’objet.
  3. Le lendemain (jour 11), effectuer la séance d’essai NO.
    1. Transférer la souris de sa cage à la maison au champ ouvert pour la réadaptation pendant 3 minutes, puis remettre l’animal dans sa cage d’origine.
    2. Pendant l’accoutumance, nettoyez soigneusement les objets avec 70% d’éthanol et essuyez-le avec un essuie-tout. Attendez qu’au moins 1 min pour que l’alcool résiduel sèche complètement.
    3. Remplacer un objet (tube en plastique de 50 ml rempli de 40 ml d’eau, objet B) par un autre objet (jar de coplin en verre, objet C) à 5 cm des murs adjacents. Fixez les objets avec du ruban adhésif recto-verso. Transférer la souris expérimentale sur le couvercle de la cage au champ ouvert, et la placer face au mur. Contrebalancer les objets présentés ensemble lors du test NO. Remplacer, par exemple, un bocal Coplin en verre (objet C) par un tube en plastique de 50 ml rempli de 40 ml d’eau (objet B) pour les souris exposées aux deux pots Coplin en verre (objet C) pendant la séance de familiarisation.
      REMARQUE : Contrebalancier l’emplacement de l’objet remplacé peut également être effectué pour réduire la préférence innée potentielle pour une certaine direction. Par exemple, pour chaque cohorte d’animaux exposés à l’ensemble de deux objets (objet B ou objet C), modifiez l’objet préféré dans la séance de familiarisation pour la moitié des animaux expérimentaux et remplacez l’objet moins préféré dans la séance de familiarisation.
    4. Autoriser 10 min d’exploration gratuite et enregistrer à l’aide d’un système de suivi vidéo. Mesurez le temps passé à explorer chaque objet à l’aide de deux chronomètres et calculez le ratio de discrimination.
      REMARQUE : Mesurez l’heure à laquelle la souris touche les objets avec ses moustaches, son museau ou ses pattes avant. Ne quantifiez pas comme temps exploratoire tout comportement dans lequel le museau de l’animal ne pointe pas vers l’objet, comme s’asseoir sur l’objet, passer par l’objet, ou se reposer avec son extrémité postérieure pointant vers l’objet.
    5. Prenez la queue de la souris expérimentale et placez-la sur le couvercle de la cage pour le transférer à sa cage à la maison. Pendant 3 jours (jours 12-14), laissez la souris se reposer avec un accès gratuit à la nourriture et à l’eau.
    6. Une fois que l’animal est retiré de la boîte à champ ouvert, nettoyez soigneusement le sol et les murs de la boîte à champ ouvert avec un spray à 70 % d’éthanol et essuyez-les avec un essuie-tout.

3. Test de séparation de modèle (PS)

  1. Le 15e jour, effectuer la première séance de familiarisation (F1) pour le test PS.
    1. Transférer la souris de sa cage à domicile à la zone de champ ouvert pour la réadaptation pendant 3 minutes, puis le retourner à sa cage à domicile.
    2. Pendant l’accoutumance, nettoyez soigneusement les objets et la plaque de plancher quadrillée avec 70% d’éthanol et essuyez-le avec un essuie-tout. Attendez qu’au moins 1 min pour que l’alcool résiduel sèche complètement.
    3. Placez la plaque de plancher (42,5 x 42,5 x 0,5 cm) avec la grille large (5,5 x 5,5 cm) dans la boîte à champ ouvert et placez deux objets identiques (T-flacons en plastique remplis de 50 ml d’eau, objet D) dans le champ ouvert à 5 cm des murs adjacents. Fixez les objets avec du ruban adhésif recto-verso. Introduisez la souris expérimentale dans la boîte à champ ouvert face au mur le plus éloigné des objets.
    4. Comme l’animal est exposé à deux objets différents (T-flask en plastique rempli de 50 ml d’eau, objet D; bouteille en verre, objet E) dans le test PS, contrebalancer l’objet pendant les sessions de F1 et F2. Par exemple, présenter deux objets identiques (bouteilles en verre, objet E) sur le plancher de la grille large pour la moitié des animaux du groupe.
    5. Autoriser l’exploration gratuite pendant 20 min, et mesurer manuellement le temps passé à explorer les deux objets à l’aide de deux chronomètres. Une fois que la souris atteint le minimum de temps d’exploration total (30 s) pour les deux objets, arrêtez la session de F1 et transférez l’animal dans sa cage d’origine. Si la souris ne parvient pas à explorer les objets pendant 30 s dans les 20 minutes, retirez-la de la boîte à champ ouvert et excluez-la des sessions supplémentaires.
      REMARQUE : Mesurez l’heure à laquelle la souris touche les objets avec ses moustaches, son museau ou ses pattes avant. Ne quantifiez pas comme temps exploratoire tout comportement dans lequel le museau de l’animal ne pointe pas vers l’objet, comme s’asseoir sur l’objet, passer par l’objet, ou se reposer avec son extrémité postérieure pointant vers l’objet.
    6. Après la fin de la première séance de familiarisation (F1), nettoyez soigneusement les objets et la plaque de plancher avec un spray à 70% d’éthanol et retirez-les de la boîte ouverte.
  2. Le lendemain (jour 16), effectuer la deuxième séance de familiarisation (F2) pour le test PS.
    1. Transférer la souris de sa cage à la maison à la zone ouverte pour la réadaptation pendant 3 minutes, puis retourner l’animal à sa cage à la maison.
    2. Pendant l’accoutumance, nettoyez soigneusement les objets et la plaque de plancher quadrillée avec 70% d’éthanol et essuyez-le avec un essuie-tout. Attendez qu’au moins 1 min pour que l’alcool résiduel sèche complètement.
    3. Placez la plaque de plancher (42,5 x 42,5 x 0,5 cm) avec la grille étroite (2,75 x 2,75 cm) dans la boîte à champ ouvert et placez deux objets identiques (bouteilles en verre, objet E) dans le champ ouvert à 5 cm des murs adjacents. Fixez les objets avec du ruban adhésif recto-verso. Introduisez la souris expérimentale dans la boîte à champ ouvert face au mur le plus éloigné des objets.
    4. Pour le contrepoids, présenter deux objets identiques (T-flacons en plastique remplis de 50 ml d’eau, objet D) sur le plancher étroit de la grille.
    5. Autoriser l’exploration gratuite pendant 20 min et mesurer manuellement le temps passé à explorer les deux objets à l’aide de deux chronomètres. Une fois que la souris atteint le minimum de temps d’exploration total (30 s) pour les deux objets, arrêtez la session F2 et transférez l’animal dans sa cage d’origine. Si la souris ne parvient pas à explorer les objets pendant 30 s dans les 20 minutes, retirez-la de la boîte à champ ouvert et excluez-la des sessions supplémentaires.
      REMARQUE : Mesurez l’heure à laquelle la souris touche les objets avec ses moustaches, son museau ou ses pattes avant. Ne quantifiez pas comme temps exploratoire tout comportement dans lequel le museau de l’animal ne pointe pas vers l’objet, comme s’asseoir sur l’objet, passer par l’objet, ou se reposer avec son extrémité postérieure pointant vers l’objet.
    6. Après la fin de la deuxième séance de familiarisation (F2), nettoyez soigneusement les objets et la plaque de plancher avec un spray à 70 % d’éthanol et retirez-les de la boîte ouverte.
  3. Le lendemain (jour 17), effectuer la séance d’essai PS.
    1. Transférer la souris de sa cage à domicile à la zone de champ ouvert pour la réadaptation pendant 3 minutes, puis le retourner à sa cage à domicile.
    2. Pendant l’accoutumance, nettoyez soigneusement les objets et la plaque de plancher quadrillée avec 70% d’éthanol et essuyez-le avec un essuie-tout. Attendez qu’au moins 1 min pour que l’alcool résiduel sèche complètement.
    3. Placez la plaque de plancher avec la grille étroite (2,75 x 2,75 cm) dans la boîte à champ ouvert et placez deux objets différents (T-flacon en plastique rempli de 50 ml d’eau, objet D; bouteille en verre, objet E) sur la plaque de plancher à 5 cm des murs adjacents. Fixez les objets avec du ruban adhésif recto-verso. Transférer la souris expérimentale sur le couvercle de la cage à la zone ouverte du champ et la placer face au mur.
    4. Contrebalancer les objets présentés ensemble lors du test PS. Par exemple, placez chaque objet (objet D, objet E) sur le plancher étroit de grille pour faire de l’objet E un objet nouveau dans ce contexte. Contrebalancer l’emplacement de l’objet D ou de l’objet E (un objet nouveau sur le motif de plancher étroit) peut également être effectuée pour réduire le potentiel d’une préférence innée pour une certaine direction. Par exemple, remplacez l’objet préféré de la deuxième séance de familiarisation pour la moitié des animaux expérimentaux, et pour le reste des animaux, remplacez l’objet moins préféré de la deuxième séance de familiarisation.
    5. Autoriser 10 min d’exploration et d’enregistrement gratuits à l’aide d’un système de suivi vidéo. Mesurez le temps passé à explorer chaque objet à l’aide de deux chronomètres et calculez le ratio de discrimination.
      REMARQUE : Mesurez l’heure à laquelle la souris touche les objets avec ses moustaches, son museau ou ses pattes avant. Ne quantifiez pas comme temps exploratoire tout comportement dans lequel le museau de l’animal ne pointe pas vers l’objet, comme s’asseoir sur l’objet, passer par l’objet, ou se reposer avec son extrémité postérieure pointant vers l’objet.
    6. Prenez la queue de la souris expérimentale et placez-la sur le couvercle de la cage pour le transférer à sa cage à la maison.

4. Coloration violette cresyl

  1. Après avoir effectué tous les tests comportementaux, anesthésiez l’animal en injectant un cocktail (4:0.5) de kétamine (50 mg/mL) et de xylazine (23,3 mg/mL) dissous en saline à une dose de poids corporel de 110 ml/kg (IP; seringue de 1 ml; 26 G d’aiguille). Vérifiez la profondeur de l’anesthésie par l’absence d’une réponse à une pincée d’ateil.
  2. Une fois que l’animal est profondément anesthésié, effectuer la perfusion transcardiale avec 4% de paraformaldéhyde pour fixer le cerveau15.
  3. Une fois la perfusion transcardiale terminée, décapiter l’animal avec une paire de ciseaux15. Ensuite, retirez le crâne à l’aide d’une paire de ciseaux d’iris pour exposer le cerveau. Après que le cerveau soit isolé, le postfixe dans 4% de paraformaldéhyde pendant la nuit, suivi de la cryoprotection dans 30% de saccharose dans 0,01 M phosphate-tamponné saline.
  4. Faire des sections coronales (30 m) à partir du cerveau surgelé à l’aide d’un cryostat.
  5. Montez les tissus cérébraux sur des toboggans et effectuez une série d’étapes d’hydratation de l’éthanol à l’eau du robinet à 100 % en lisant 3 min séquentiellement dans 100 %, 95 %, 90 %, 80 %, 70 % d’éthanol.
  6. Incuber les diapositives tissulaires dans 0,1% de solution violette cresyl pour 15 min.
  7. Enlever la tache excessive en immergeant les diapositives de tissu dans 95% d’éthanol/0,1% d’acide acétique glaciaire, puis déshydrater les tissus avec des solutions de 100% d’éthanol, 50% d’éthanol/50% de xylène, et 100% de xylène.
  8. Couvre les diapositives de tissu à l’aide d’un milieu de montage de xylène disponible dans le commerce.

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Résultats

Un calendrier expérimental général et la configuration pour évaluer la fonction cognitive sont indiqués dans la figure 1. Six semaines après l’introduction de crises aigues induites par la pilocarpine, les souris ont été soumises aux tests NL, NO et PS dans cet ordre séparé par des périodes de repos de 3 jours entre les tests(figure 1A). Pour le test de NL, deux objets identiques ont été placés dans le champ ouvert pendant la session de familiarisation (F1), et ...

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Discussion

Ce travail décrit des procédures expérimentales pour évaluer la fonction cognitive chez les souris atteintes d’épilepsie chronique. Beaucoup de paradigmes différents de test comportemental sont employés pour évaluer l’apprentissage et les fonctions de mémoire chez les souris18. Le labyrinthe d’eau Morris, le labyrinthe de bras radial, le labyrinthe Y, le conditionnement contextuel de la peur et les essais basés sur des objets sont les tests comportementaux les plus fréquemment utilisés et fourniss...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions le Dr Jae-Min Lee pour son soutien technique. Ces travaux ont été soutenus par les subventions de la National Research Foundation of Korea (NRF) financées par le gouvernement coréen (NRF-2019R1A2C1003958, NRF-2019K2A9A2A08000167).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Seringue de 1 mlSung-shimutiliser avec l’aiguille de calibre 26 ou 30
Éthanol 70 %DuksanUN1170Spray pour nettoyer la boîte et les objets
rideauPour éviter les repères visuels inutiles
Cresyl violetSigmaC5042Pour le colorage du violet Cresyl
cryotomeLeicaE21040041Pour les tissus sectionnement
ruban adhésifPour le placement ferme des objets
Support de montage DPXSigma06522
série éthanolDuksanUN1170Make 100 %, 95 %, 90 %, 80 %, 70 % ethanol solutions
plaque de sol avec des motifs de grille étroitsLeehyo-bioÉquipement d’expérimentation comportementale, taille de la plaque : 42,5 x 42,5 x 0,5 cm, taille de la grille : 2,75 x Plaque de sol de 2,75 cm
avec de larges motifs de grilleLeehyo-bioÉquipement d’expérimentation comportementale, taille de la plaque : 42,5 x 42,5 x 0,5 cm, taille de la grille : 5,5 x 5,5 cm
illuminomètreTES Electrical Electronic Corp.1334APour la mesure de l’éclairage de la pièce (60 Lux)
Unité de soins intensifsThermocare#W-1
chlorhydrate de kétamineYuhan7003Utilisation pour anesthésier la souris pour la perfusion transcardique
Lampe LEDLungoP13A-0422-WW-04Éclairage pour les objets
de la salle d’essai comportementalPoupée en caoutchouc, tube en plastique de 50 ml, pot Coplin en verre, flacon en T en plastique, bouteille en verre
boîte à champ ouvertLeehyo-bioMatériel d’expérience comportementale, taille : 44 x 44 x 31 cm
essuie-toutYuhan-Kimberly47201Utiliser pour sécher la boîte en champ ouvert et les objets
paraformaldéhydeMerck Millipore104005Fabriquer une solution à 4 %
chlorhydrate de pilocarpineSigmaP6503
Utiliser pour localiser les objets dans la boîte à champ ouvert
scopolamine méthyle nitrateSigmaS2250Make 10X stock
Système intelligent 3.0PanlabSystème de suivi vidéo
chronomètreJunsoJS-307Pour la mesure des activités exploratoires des souris
saccharoseSigmaS9378Pour la cryoprotection de coupes de tissus sel d’hémisulfate de
terbutalineSigmaT252810X
(caméra CCD)VisionVCE56HQ-12Placez la caméra directement au-dessus de la boîte à champ ouvert
xylazine (Rompun)Bayer koreaKR10381Utiliser pour anesthésier la souris pour la perfusion transcardique
xylèneDuksanUN1307Pour Coloration au violet de crésyle
À noir double face règle Fabriquer une caméra vidéo

Références

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