Croissance des couches cellulaires endothéliales coréennes humaines et brebis sur les membranes biomatériaux

La cornée est un tissu transparent qui est situé à l’avant de l’œil. Il est composé de trois couches principales : une couche épithéliale sur la surface extérieure, une couche de stroma moyenne, et une couche intérieure appelée l’endothélium cornéen. L’endothélium cornéen est une monocouche de cellules qui se trouve sur une membrane de sous-sol appelée membrane de Descemet et il maintient la transparence de la cornée en régulant la quantité de liquide qui pénètre dans le stroma de l’humour aqueux sous-jacent. Trop de liquide dans le stroma provoque un gonflement cornéen, l’opacité et la perte de vision. L’endothélium est donc essentiel pour maintenir la vision.

L’endothélium cornéen peut devenir dysfonctionnel pour un certain nombre de raisons, y compris le vieillissement, la maladie et les blessures, et le seul traitement actuel est la chirurgie de transplantation. Pendant cette chirurgie, l’endothélium et la membrane de Descemet sont enlevés de la cornée du patient et remplacés par une greffe de l’endothélium et de la membrane de Descemet obtenues d’une cornée de distributeur. Beaucoup de greffes d’endothélium contiennent également une fine couche de tissu stromal pour faciliter la manipulation et l’attachement à la cornée hôte¹.

Dans le monde entier, la demande de tissus de donneurs cornéens pour les chirurgies de transplantation est supérieure à la quantité qui peut être fournie par les banques oculaires². Il y a donc eu une volonté de développer des greffes d’endothélium cornéen tissulaire qui pourraient être utilisées pour pallier ce manque à gagner³. La raison d’être de ceci est basée sur le fait qu’actuellement, l’endothélium d’une cornée individuelle ne peut être transféré à un seul patient, cependant, si les cellules endothéliales cornéennes ont été d’abord étendues et cultivées sur des échafaudages de biomatériaux dans la culture de tissu, elles pourraient être employées pour traiter plusieurs patients.

Les principaux défis qui doivent être relevés avant que les greffes d’endothélium cornéen tissulal deviennent une option réalisable pour les chirurgiens comprennent: (1) l’établissement de techniques pour l’expansion des cellules endothéliales cornéennes de haute qualité et pour la production de maturité et couches endothéliales endothéliales cornées fonctionnelles in vitro, et (2) établissant des techniques pour cultiver les cellules sur des échafaudages de biomatériaux pour produire des greffes tissulaires qui sont égales, ou meilleures que, les greffes cornées de donneur qui sont actuellement employées.

Les cellules endothéliales cornéennes ont un très faible potentiel de prolifération in vivo, mais peuvent être stimulées pour diviser in vitro⁴. Néanmoins, ils ont une forte tendance à subir une transition épithéliale-mésenchymale in vitro (EMT), ce qui réduit leur capacité à former une couche endothéliale fonctionnelle et mature. Les déclencheurs connus de l’EMT dans les cellules endothéliales cornéennes comprennent l’exposition à certains facteurs de croissance et la perte de contact cellule-cellule⁵. Il est donc presque inévitable que les cultures endothéliales endothéliales cornéennes qui sont enzymatiquement dissociées pendant la sous-culture subiront des changements associés à l’EMT. Ici, nous présentons une méthode de culture cellulaire pour les cellules endothéliales cornéennes humaines ou brebis qui est conçue pour minimiser la perturbation des contacts de cellule à cellule pendant les étapes d’isolement, d’expansion et de sous-culture, afin de réduire le potentiel d’EMT. En outre, nous démontrons comment les greffes tissulaires qui ressemblent à l’endothélium/greffes de tissu stromal de la cornée dérivée de la cornée de donneur peuvent être produites en cultivant des couches de cellules cultivées des deux côtés d’une membrane de biomatériau dans un dispositif de montage fait sur mesure.

Des cornées humaines avec le consentement des donateurs pour la recherche ont été obtenues de la Queensland Eye Bank et utilisées avec l’approbation éthique du Comité d’éthique de la recherche humaine du Metro South Hospital and Health Service (HREC/07/QPAH/048). Des cornées de mouton ont été obtenues des animaux euthanasiés au centre médical de recherche de Herston de l’université du Queensland en vertu d’un accord de partage de tissu.

1. Préparation d’outils de dissection

1. Stérilisez deux paires de forceps d’horloger numéro 4 en les trempant dans une solution de 70% d’éthanol pendant 5 min ou en les autoclantant.

2. Préparation des plaques de culture moyenne et de culture tissulaire

1. Préparer 100 ml de milieu de culture contenant opti-MEM 1 (1x) - GlutaMAX-1, 5% de sérum bovin fœtal et 100 U/mL Pen/Strep. Ce milieu de culture est adéquat pour les cultures endothéliales endothéliales de cornée de mouton, cependant, pour les cultures endothéliales endothéliales cornées humaines le milieu devrait être complété avec l’extrait pituitaire bovin de 50 g/mL, 0.08% de sulfate de chondroitin, 200 'g/mL de chlorure de calcium et 0.3 mM d’acide l’ascorbique 2-phosphate. Le milieu de culture peut être stocké dans l’obscurité à 4 oC pendant deux semaines.
2. Enrober les puits d’une plaque de culture de tissu de 6 puits avec le facteur d’attachement en utilisant les instructions du fabricant et puis ajouter 1 ml de milieu de culture à chaque bien enduit. Préparer un puits pour chaque cornée.

3. Dissection d’explantation et procédure de culture cellulaire

1. Placer la cornée, côté endothélium vers le haut, dans un plat stérile Petri sur la scène d’un microscope disséquant. Ajuster l’éclairage de façon à ce que la surface cornéenne soit bien éclairée avec un contraste suffisant pour mettre en évidence la couche endothéliale. Ajustez le zoom de sorte que le bord et un peu d’endothélium cornéen central est en vue.
2. Utilisez des forceps d’horloger stérilisés pour soulever et déchirer doucement la membrane de Descemet du stroma sous-jacent (Figure 1). La membrane se détachera du stroma comme une bande qui se recroqueville immédiatement. Placez la bande dans un puits d’une plaque de culture de tissu de 6 puits qui a été enduite avec le facteur d’attachement et contient 1 ml de milieu de culture. Le couvercle de la plaque de culture tissulaire doit être maintenu en tout temps, sauf lorsque des explants y sont ajoutés, afin de réduire le risque de contamination.
3. Enlever les bandes de la membrane de Descemet de la périphérie extrême de l’endothélium d’abord, puis des régions centrales plus tard. Placer toutes les bandes d’une cornée dans un seul puits dans la plaque de 6 puits.
4. Incuber les explants dans un incubateur de culture cellulaire humidifié fixé à 5% CO₂ et 37 oC. Laissez la culture intacte pendant 2 jours pour permettre aux explants de se déposer et de s’attacher à la surface de la plaque. En règle générale, jusqu’à un tiers des explants ne se fixent pas à la plaque.
5. Retirer le milieu et les explants non attachés de la culture après 4 jours et ajouter doucement 2 ml de milieu de culture frais en prenant soin de ne pas déranger les explants attachés. Le média culturel doit être modifié deux fois par semaine.

4. Production continue de cellules endothéliales cornéennes par culture d’explantation en série

REMARQUE : Les plantes peuvent être transférées dans des plaques de culture de tissus frais après 10 jours afin d’établir d’autres cultures endothéliales endothéliales cornéennes.

1. Placez la culture d’explantation sur le stade d’un microscope disséquant et ajustez l’éclairage et le zoom de sorte que les explants soient visibles.
2. À l’aide de forceps d’horloger stérilisés, arracher délicatement chaque explante de sa plaque de culture et la transférer dans un puits frais d’une plaque de culture de 6 puits qui a été recouverte d’un facteur d’attachement et contient 1 ml de milieu de culture.
3. Laisser les explants s’installer sur la surface de leur nouvelle assiette pendant 4 jours avant de remplacer le milieu de culture par 2 ml de milieu de culture frais. Le milieu de la culture du changement a changé deux fois par semaine.

5. Cultiver des cellules endothéliales cornéennes sur des couvertures en verre pour des analyses d’immunofluorescence

REMARQUE : Les cultures cellulaires qui sont destinées à être analysées à l’aide de l’immunofluorescence doivent être établies sur des couvercles en verre qui peuvent être montés sur des lames de microscope en verre suivant la procédure de coloration.

1. Stériliser un paquet de couvercles en verre rond de 13 mm de diamètre dans un autoclave ou en trempant à 70 % d’éthanol pendant 15 min, suivi de trois rinçants en salin tamponné par phosphate (PBS).
2. Placez les couvertures individuelles dans les puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits, enrobez-les d’un facteur d’attachement, puis ajoutez 0,5 ml de milieu de culture à chaque puits.
3. À l’aide de forceps horrisés, les explants retirent les explants de leurs plaques de culture tissulaire et les transfèrent dans des puits contenant des plaques de couverture. Laisser les explants s’installer sur les couvertures pendant 4 jours avant de changer le milieu.
4. Après la période d’incubation requise, fixer et tacher les cultures de couverture dans leurs puits de culture. Montez les couvercles tachés sur des lames de microscope en verre pour les analyser au microscope à fluorescence.

6. Sous-culture des cellules endothéliales cornéennes utilisant Dispase II

REMARQUE : Les grandes cellules fibroblastiques peuvent être sélectivement enlevées des cultures d’explantation dans les plaques de 6 puits avant de subculper utilisant cette procédure. Si toutes les cellules doivent être sous-cultivées, n’effectuez pas les étapes 6.2 à 6.4. Le but de cette procédure est de transférer les cellules dans des plaques fraîches tout en maintenant leurs contacts de cellule à cellule autant que possible. Les cellules doivent être manipulées en douceur. Les puits complètement confluents doivent être passages à un rapport de 1:2, tandis que les puits subconfluents doivent être passages à un rapport de 1:1 ou moins.

1. Retirez le milieu de la culture et rincez brièvement avec DPBS.
2. Ajouter 1 ml de verse. Incuber à température ambiante pendant 30 s.
3. Retirer le versene et ajouter 1 ml de TrypLE. Incuber à 37 oC dans l’incubateur de culture tissulaire pendant 3 min.
4. Observez la culture à l’aide d’un microscope à contraste de phase. Appuyez doucement sur la culture pour déloger les cellules de la plaque. Dès que les grandes cellules fibroblastiques se sont détachées de la plaque, retirez-les et le TrypLE à l’aide d’une pipette de 1 ml. Laver trypLE résiduel des cellules restantes en rinçant deux fois avec 2 ml de DPBS.
5. Ajouter 1 ml de 1 mg/mL de dispase II à la culture et incuber dans l’incubateur de culture tissulaire pendant 1 à 2 h ou jusqu’à ce que toutes les cellules se soient détachées de la plaque. Les cellules doivent progressivement flotter loin de la plaque en touffes.
6. Recueillir les cellules à l’aide d’une pipette de 1 ml et transférer à 20 ml de DPBS dans un tube de centrifugeuse de 50 ml. Centrifugeuse de 5 min à 300 x g à température ambiante.
7. Retirer le supernatant et resuspendre doucement le granule cellulaire par trituration avec une pipette de 1 ml dans 1 ml de milieu de culture. Transférer la suspension cellulaire à un ou deux puits d’une plaque de 6 puits, au passage à un ratio de 1:1 ou 1:2 respectivement.
8. Rehaussez le milieu dans chaque puits pour faire 2 ml et placez les cultures dans l’incubateur de culture tissulaire. Remplacer le milieu par 2 ml de milieu frais deux fois par semaine.

7. Croissance des couches de cellules endothéliales cornéennes sur les membranes biomatériaux

REMARQUE : La procédure suivante décrit les étapes impliquées dans le montage d’un biomatériau membranaire dans un dispositif de montage sur mesure, appelé chambre micro-Boyden, pour la culture cellulaire. Veuillez consulter notre publication récente⁶ pour plus d’informations sur l’appareil et pour l’achat de détails.

1. Assembler la chambre supérieure de la chambre micro-Boyden en plaçant un anneau O rouge en son centre.
2. Utilisez une trephine de 18 mm de diamètre pour percer un disque d’une feuille de biomatériau sur une planche à découper en polytétrafluoroéthylène (PTFE). Placez ce disque sur l’anneau O rouge dans la chambre haute de la chambre micro-Boyden.
3. Visser la chambre inférieure sur la chambre supérieure, en fixant le disque de biomatériau entre les deux.
4. Faire tremper la chambre micro-Boyden assemblée dans 70% d’éthanol pendant 1 h pour la stériliser.
5. Immerger complètement la chambre micro-Boyden assemblée dans le HBSS stérile pendant 10 min pour enlever l’éthanol. Répétez cette étape de lavage deux fois. Effectuer une dernière étape de lavage pendant 10 min dans un milieu de culture non complété.
6. Transférer la chambre micro-Boyden stérilisée au milieu de culture dans le puits d’une plaque de 6 puits en veillant à ce que la chambre haute soit la plus haute. Ajuster le niveau du milieu de culture afin qu’il entre en contact avec la surface inférieure de la membrane biomatériau, mais ne coule pas dans la chambre supérieure.
7. Préparer une suspension des cellules endothéliales cornéennes en utilisant la procédure décrite à la section 6. Une densité cellulaire suffisante dans la suspension devrait être atteinte pour permettre une densité d’ensemencement d’au moins 100 000 cellules par cm² sur la membrane de la chambre micro-Boyden. La surface de la culture dans la chambre micro-Boyden est de 0,5 cm² et elle peut contenir un volume de 100 L. Par conséquent, une suspension contenant 500 000 cellules/mL doit être préparée.
8. Pipette 100 l de suspension cellulaire (50 000 cellules) sur la membrane de la chambre micro-Boyden. Incuber dans l’incubateur de culture tissulaire pendant 4 h avant de remplir le milieu pour immerger complètement la chambre. Incuber la culture pendant la période de temps requise, en remplaçant le milieu deux fois par semaine.
   REMARQUE : Une fois que les cellules endothéliales cornéennes se sont attachées à la surface supérieure de la membrane de biomatériau la chambre micro-Boyden peut être renversée au sein de la culture bien de sorte que la chambre inférieure soit la plus haute. Plus de cellules peuvent alors être ajoutées à la chambre pour initier des cultures cellulaires sur l’autre surface de la membrane. Par exemple, les cellules stromales cornéennes peuvent être facilement appliquées à la surface alternative imitant ainsi l’emplacement relatif des types de cellules cornéennes comme on le voit dans la cornée postérieure.

La méthode d’isoler et d’élargir les cellules endothéliales cornéennes des cornées humaines ou brebis est résumée dans la figure 1 et la figure 2. La plupart des explants qui sont dérivés des cornées de moutons de 1 à 2 ans ou de donneurs humains de moins de 30 ans se fixent aux plaques de culture tissulaire enduites de facteur d’attachement dans une semaine, cependant, il n’est pas rare de constater que jusqu’à un tiers des explants ne se fixent pas dans ce délai. Ces explantations « flottantes » peuvent être retirées des cultures. Les explantes provenant de donneurs humains âgés de plus de 30 ans sont moins susceptibles de s’attacher à la plaque et aussi moins susceptibles de produire des cultures cellulaires. Des images représentatives des cultures de cellules endothéliales cornéennes générées par les moutons et les explants humains sont présentées dans la figure 3 et la figure 4. Les cellules qui émergent des explants restent généralement en contact les unes avec les autres lorsqu’elles migrent sur la plaque. Ce type de migration est connu sous le nom de migration cellulaire collective, et c’est une caractéristique des cellules épithéliales7. D’ici 2 semaines de culture, des parcelles de petites cellules serrées se seront formées immédiatement à côté de beaucoup d’explants de brebis et de cornées humaines8. Ces taches de cellules ne présentent pas de caractéristiques morphologiques de l’EMT et se dilatent lentement au fil du temps. De plus grandes cellules avec des formes plus irrégulières et fibroblastiques peuvent être trouvées en dehors de ces corrections. Une fois que les cultures ont été établies, les explants peuvent être enlevés à l’aide de forceps et placés dans des assiettes fraîches pour établir de nouvelles cultures.

Les petites cellules bien emballées dans les cultures de cellules endothéliales cornéennes sont très résistantes à la digestion avec TrypLE, tandis que les plus grandes cellules fibroblastiques y sont plus sensibles. Cette différence dans la résistance de TrypLE peut être exploitée pour enlever sélectivement de grandes cellules des cultures avant de transférer les plus petites cellules à de nouvelles plaques. Des images représentatives des cultures cellulaires endothéliales cornéennes humaines tout au long du processus de subculturing à l’aide de TrypLE et Dispase II sont montrées à la figure 4.

Des analyses d’immunofluorescence peuvent être effectuées sur les cultures endothéliales cornées pour localiser des protéines spécifiques dans les cellules. Un exemple de cela est présenté dans la figure 5. Des plantes de moutons et de cornées humaines ont été placées sur des couvertures en verre enduites de facteur d’attachement dans des assiettes de 24 puits et cultivées pendant 4 semaines. Les explants ont été enlevés, puis les cultures ont été analysées à l’aide de l’immunofluorescence pour la présence de ZO-1, une protéine de jonction serrée, et N-cadherin, une protéine adhérente jonction, selon notre protocole publié9. Les mêmes anticorps anti-ZO-1 et anti-N-cadherin ont été utilisés pour les cellules ovines et humaines, et les résultats ont montré que les deux protéines ont été détectées dans les membranes plasmatiques des cellules des deux espèces. ZO-1 est normalement présent comme une bande distincte à la frontière cellulaire, mais devient faible ou absent dans les cellules subissant EMT. Par conséquent, l’expression robuste de ZO-1 dans ces cultures a indiqué que les cellules n’avaient pas subi EMT.

Nos chambres micro-Boyden sur mesure sont conçues pour suspendre une membrane biomatériau dans le puits d’une plaque de culture tissulaire de 6 puits (figure 6). La procédure de montage d’une membrane biomatériau dans une chambre micro-Boyden est montrée dans la figure 7. La conception de la chambre micro-Boyden permet aux deux côtés de la membrane suspendue à l’intérieur d’être utilisé comme surfaces de culture cellulaire simultanément. Pour démontrer cela, les cellules stromales de moutons dérivées du tissu stromal cornéen ont été enseventées à une densité de 100 000 cellules/cm2 sur un côté d’une membrane de collagène de type I, puis 24 h plus tard, la chambre a été renversée et les cellules endothéliales cornéennes ont été enseventées de l’autre côté de la membrane à une densité de 400 000cm/2. Les couches cellulaires tissulées ont été cultivées pendant 4 semaines, puis fixées avec 10% de formaline tamponnée neutre et tachées à l’aide de la phalloïde de rhodamine et du colorant nucléaire Hoechst 33342. Ils ont ensuite été examinés et photographiés à l’aide d’un microscope confocal (Figure 8). Une vue transversale de la construction de cellules tissulaires a indiqué une seule couche de cellules endothéliales cornéennes sur une surface de la membrane de collagène et une culture multi-couches des cellules stromales cornéennes sur l’autre surface.

Figure 1 : Technique d’obtention d’explants d’endothélium/membrane de Descemet à partir de cornées fraîches. (A) La cornée est placée côté endothélium vers le haut dans un plat Petri sous un microscope disséquant. (B) Fermez la vue de la zone indiquée par un rectangle rouge dans (A). Les forceps de l’horloger sont utilisés pour décoller doucement la membrane de Descemet du stroma sous-jacent. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Procédure d’établissement et d’expansion des cultures des cellules endothéliales cornéennes à partir des explants de membrane de l’endothélie/Descemet. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Images contrastées de phase représentative des cultures cellulaires endothéliales lors de l’établissement initial à partir d’explants d’endothélium cornée de moutons/membrane de Descemet. (A) Une évènement cornéen onée/descémet explante après 3 jours de culture. Les cellules endothéliales cornéennes ont commencé à migrer sur la plaque. (B) Une culture d’explantation de moutons après 1 semaine. L’explantation est entourée d’une feuille de cellules confluentes. (C) Une culture d’explantation de moutons après 2 semaines. De petites cellules entourent l’explante tandis que les cellules plus grandes sont situées plus loin. (D) Une culture d’explantation de moutons après 6 semaines. Une région de petites cellules serrées est vue à côté d’une région de plus grandes cellules. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Isolement de petites cellules endothéliales cornées humaines bien emballées pour les sous-cultures. (A) Une culture d’explantation de membrane de la membrane de l’endothélium/Descemet après 7 semaines. De nombreuses petites cellules bien emballées sont présentes à côté de l’explantation. (B) Les régions de petites cellules serrées se développent dans les cultures d’explantation humaine d’une manière similaire à celle observée dans les cultures d’explantation s’explantent chez les moutons. (C) Une culture humaine d’explantation après l’enlèvement de l’explantation et après 20 min d’exposition à TrypLE. Les petites cellules bien emballées ont conservé leur attachement à la plaque tandis que les plus grandes cellules ont flotté loin. (D) Une culture endothéliale endothéliale cornée humaine après 1 h dans Dispase II. La plupart des cellules se sont détachées de la plaque sous forme d’amas flottants. (E) Une sous-culture endothéliale endothéliale humaine de cellules cornée après 1 jour. Les cellules ont migré vers l’extérieur à partir d’amas cellulaires qui ont été isolés de la culture d’explantation d’origine. (F) Une sous-culture endothéliale endothéliale humaine de cellules cornée après 12 jours. Les cellules ont formé une monocouche confluente. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 : Localisation des protéines ZO-1 et N-cadherin dans les membranes des cellules endothéliales de la cornée humaine et de l’homme par immunofluorescence à double étiquetage. Des cultures d’explantation smembranaire de moutons et de cornée humaines ont été établies sur des couvertures en verre enduites de facteur d’attachement et analysées après 4 semaines. Le ZO-1 (tache verte) et le N-cadherin (tache rouge) ont été détectés dans les membranes des moutons (A et B) et des cellules endothéliales cornéennes(D et E) humaines ( D et E). L’analyse des images fusionnées a révélé que les deux protéines étaient fortement co-localisées au sein des cultures (C et F). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6 : Diagramme d’une chambre micro-Boyden montré en coupe transversale. Notre chambre micro-Boyden sur mesure se compose d’une chambre haute, d’une chambre basse et d’un anneau O. Il peut être utilisé pour suspendre tout type de matériau membranaire dans une culture tissulaire bien. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7 : Procédure de montage d’une membrane biomatériau dans une chambre micro-Boyden pour la culture tissulaire. (A) L’équipement requis pour cette procédure comprend une planche à découper en polytétrafluoroéthylène, une paire de forceps, une trephine de 18 mm de diamètre, une chambre micro-Boyden sur mesure et une membrane biomatériau. (B) Utilisez la trephine pour percer un disque de la membrane biomatériau. (C) Placez l’anneau O dans la chambre supérieure du dispositif de montage, puis placez le disque biomatériau sur celui-ci. (D) Visser la chambre inférieure sur la chambre supérieure de l’appareil de montage. (E) La chambre micro-Boyden assemblée est prête à être stérilisée avec 70% d’éthanol. (F) Immerger la chambre micro-Boyden stérilisée dans le milieu de culture de tissu dans le puits d’une plaque de culture de tissu de 6 puits. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 8 : Cellules endothéliales endothéliales et stromales cornéennes de mouton sur les côtés opposés d’une membrane de collagène de type I. Les cellules ont été tachées avec de la rhodamine de phalloidin pour visualiser l’actine (rouge) et Hoechst pour visualiser des noyaux (bleu). La membrane de collagène de type I n’était pas tachée et n’est donc pas visible dans ces images qui ont été recueillies à l’aide d’une microscopie confocale. (A) Un grossissement faible, vue transversale de la construction tissulaire. Une fine couche d’actine représentant une culture endothéliale cornéenne est visible sur la surface supérieure de la membrane, et une couche plus épaisse d’actine représentant une culture cellulaire stromale est présente sur la surface inférieure de la membrane. Les noyaux bleus ne sont pas représentés dans cette image. (B) En vue du visage de la couche de cellules endothéliales cornéennes montrant à la fois l’actine et la coloration des noyaux. (C) Vue de visage de la couche de cellules stromales cornéennes montrant à la fois l’actine et la coloration des noyaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.