Article de méthode

Quantification des niveaux d’éthanol dans les embryons de poisson zèbre à l’aide de la chromatographie de gaz de l’espace de tête

DOI :

10.3791/60766

⸱

11 février 2020

1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, Alcohol Research Center, University of Louisville

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail décrit un protocole pour quantifier les niveaux d’éthanol dans un embryon de poisson zèbre à l’aide de la chromatographie de gaz de l’espace de la tête à partir de méthodes d’exposition appropriées au traitement des embryons et à l’analyse de l’éthanol.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les troubles du spectre de l’alcoolisation fœtale (ETCAF) décrivent un continuum très variable de défauts développementaux induits par l’éthanol, y compris les dysmorphologies faciales et les déficiences neurologiques. Avec une pathologie complexe, l’ETCAF touche environ 1 enfant sur 100 né aux États-Unis chaque année. En raison de la nature très variable de l’ETCAF, les modèles animaux se sont avérés essentiels dans notre compréhension mécaniste actuelle des défauts de développement induits par l’éthanol. Un nombre croissant de laboratoires se sont concentrés sur l’utilisation du poisson zèbre pour examiner les défauts de développement induits par l’éthanol. Les poissons zèbres produisent un grand nombre d’embryons fécondés, génétiquement traitables et translucides. Cela permet aux chercheurs de contrôler avec précision le moment et la posologie de l’exposition à l’éthanol dans de multiples contextes génétiques et de quantifier l’impact de l’exposition à l’éthanol embryonnaire grâce à des techniques d’imagerie en direct. Ceci, combiné avec le degré élevé de conservation de la génétique et du développement avec l’homme, s’est avéré le poisson zèbre pour être un modèle puissant dans lequel étudier la base mécaniste de la tératogénicité d’éthanol. Cependant, les schémas d’exposition à l’éthanol ont varié entre les différentes études sur le poisson zèbre, ce qui a confondu l’interprétation des données sur le poisson zèbre dans ces études. Voici un protocole pour quantifier les concentrations d’éthanol dans les embryons de poissons zèbres à l’aide de la chromatographie de gaz de l’espace de la tête.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les troubles du spectre de l’alcoolisation fœtale (ETCAF) décrivent un large éventail de déficiences neurologiques et de dysmorphologies craniofaciales associées à l’exposition à l’éthanol embryonnaire1. De multiples facteurs, y compris le moment et la posologie de l’exposition à l’éthanol et le bagage génétique, contribuent à la variation de l’ETCAF2,3. Chez l’homme, la relation complexe de ces variables rend difficile l’étude et la compréhension de l’étiologie de l’ETCAF. Les modèles animaux se sont avérés cruciaux dans le développement de notre compréhension de la base mécaniste de la tératogénicité de l’éthanol. Une grande variété de systèmes de modèles animaux a été utilisé pour étudier de multiples aspects de l’ETCAF et les résultats ont été remarquablement compatibles avec ce qui se trouve dans l’exposition chez l’homme4. Les systèmes modèles de rongeurs sont utilisés pour examiner de nombreux aspects de l’ETCAF, avec des souris étant les plus communs5,6,7. La majorité de ces travaux ont porté sur les défauts de développement à l’exposition précoce à l’éthanol8, bien que l’exposition ultérieure à l’éthanol a été montré pour causer des anomalies du développement ainsi9. En outre, les capacités génétiques des souris ont grandement aidé dans notre capacité à sonder les fondements génétiques de l’ETCAF10,11. Ces études chez la souris suggèrent fortement qu’il existe des interactions gènes-éthanol avec la voie du hérisson sonore, la signalisation acide rétinoïque, Superoxide dismutase, oxyde nitrique synthase I, Aldh2 et Fancd28,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21. Ces études montrent que les modèles animaux sont essentiels pour faire progresser notre compréhension de l’ETCAF et de ses mécanismes sous-jacents.

Le poisson zèbre a émergé comme un système modèle puissant pour examiner de nombreux aspects de la tératogenèse de l’éthanol22,23. En raison de leur fécondation externe, de leur fécondité élevée, de leur région génétique et de leurs capacités d’imagerie vivante, le poisson zèbre est idéal pour étudier des facteurs tels que le moment, la posologie et la génétique de la tératogénèse à l’éthanol. L’éthanol peut être administré à des embryons mis en scène avec précision et les embryons peuvent ensuite être représentés pour examiner l’impact direct de l’éthanol pendant les processus de développement. Ce travail peut être directement lié à l’homme, parce que les programmes génétiques de développement sont fortement conservés entre le poisson zèbre et l’homme et peuvent donc aider à guider les études humaines de l’ETCAF24. Alors que le poisson zèbre a été utilisé pour examiner la tératogénèse à l’éthanol, un manque de consensus dans la déclaration des concentrations d’éthanol embryonnaire rend la comparaison avec les humains difficile25. Dans les systèmes de mammifères, les niveaux d’alcool dans le sang sont directement corrélés aux niveaux d’éthanol tissulaire26. Bon nombre des études sur le poisson zèbre traitent les embryons avant la formation complète de leur système circulatoire. En l’absence d’échantillon maternel à examiner, un processus d’évaluation des concentrations d’éthanol est nécessaire pour quantifier les niveaux d’éthanol à l’intérieur de l’embryon. Ici nous décrivons un processus pour quantifier des concentrations d’éthanol dans un embryon en développement de poisson zèbre utilisant la chromatographie de gaz d’espace de tête.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tous les embryons de poissons zèbres utilisés dans cette procédure ont été élevés et élevés selon les protocoles établis de l’IACUC27. Ces protocoles ont été approuvés par l’Université du Texas à Austin et l’Université de Louisville.

REMARQUE: La ligne de poisson zèbre Tg(fli1:EGFP)y1 a été utilisée dans cette étude28. Toute l’eau utilisée dans cette procédure est stérile eau d’osmose inverse. Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l’aide de Graphpad Prism v8.2.1.

1. Faire des médias d’embryon

  1. Pour faire un stock 20x de médias embryonnaires, dissoudre 17,5 g de NaCl, 0,75 g de KCl, 2,9 g de CaCl2, 0,41 g de K2HPO4, 0,142 g de NA2HPO4, et 4,9 g de MgSO47H2O en 1 L d’eau. Ignorer le précipité blanc qui se forme; cela n’aura pas d’impact sur les médias. Filtrer la stérilisation de la solution de stock et le stocker à 4 oC.
  2. Pour créer la solution de support embryonnaire de travail, dissoudre 1,2 g de NaHCO3 en 1 L de 20x stock de médias embryonnaires et ajouter 19 L d’eau. Maintenir la solution de support embryonnaire de travail à 28 oC.

2. Mesurer le volume embryonnaire à l’aide du déplacement de l’eau

REMARQUE : Dans ce protocole, 24 h d’embryons postfertilisation (hpf)(figure 1) sont utilisés. Les embryons utilisés dans les mesures de volume ne sont pas utilisés dans l’analyse de l’éthanol.

  1. Placez 10 embryons et du liquide extraembryonnaire dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml marqué à un volume de 250 l(figure 2A). Ajouter de l’eau à la ligne de remplissage de 250 l (voir l’échantillon avec de l’eau teintée à la figure 2B).
  2. Répétez l’étape 2.1 pour mettre en place des réceptacles pour les embryons qui ont eu leurs chorions enlevés.
    1. Pour enlever le chorion, placer les embryons dans leurs chorions dans un plat Petri de 100 mm avec 2 mg/ml de cocktail de protéase dans le support embryonnaire à température ambiante (RT) pendant 10 min. Toutes les quelques minutes, faites tourbillonner doucement les embryons pour briser le chorion.
    2. Une fois que tous les embryons sont exempts de leur chorion, retirer les embryons déchorions du cocktail de protéase/gène et le placer dans un nouveau plat Petri de 100 mm avec des supports d’embryons frais pour laver les embryons. Répétez cette étape de lavage 1 fois de plus (pour un total de 2 lavages). Transférer les embryons dans un plat Petri frais de 100 mm.
  3. En utilisant la plus petite pointe possible et sans endommager les embryons, retirez soigneusement tout le liquide autour des embryons à l’aide d’un micropipettor p200(figure 2C) et pesez l’eau avec une balance avec une précision de 0,1 mg. Pour déterminer le volume de l’échantillon de 10 embryons, soustrayez le poids/volume de l’eau (1 ml d’eau et 1 g d’eau. Pour déterminer le volume d’un seul embryon, divisez la différence entre 250 L et le poids de l’eau enlevée par 10.

figure-protocol-1

figure-protocol-2

3. Traiter les embryons avec de l’éthanol

  1. Rassemblez les embryons des réservoirs d’accouplement et placez-les dans un plat Petri standard de 100 mm. Comptez pas plus de 100 embryons par plat Petri unique et incuber à 28,5 oC.
    REMARQUE : Si le chorion doit être enlevé (étape 2.2), il doit être enlevé avant d’ajouter de l’éthanol.
  2. À 6 hpf, ajouter jusqu’à 100 embryons à une nouvelle norme de 100 mm Petri plat soit avec le média embryonnaire ou le média embryonnaire - 1% d’éthanol (v/v). Couvrir, mais NE PAS sceller le plat Petri. Placer les embryons dans un incubateur à basse température réglé à 28,5 oC pendant 18 h, ou jusqu’à ce que les embryons atteignent le point de temps de développement de 24 hpf.

4. Préparation du flux de travail avant le traitement des embryons pour la chromatographie de gaz de l’espace de la tête

  1. Faire une solution de 5 M NaCl dans l’eau (450 L sera nécessaire par tube d’échantillon) pour dénaturer toutes les protéines et prévenir le métabolisme de l’éthanol. Faire le cocktail de protéase (Table of Materials) à une concentration de 2 mg/mL dans les médias embryonnaires.
  2. Étiqueter un tube microcentrifuge de 1,5 ml et une flacon de chromatographe gazeux de 2 ml pour chaque échantillon. Étiquetez des flacons de chromatographe stéatographe sérogaz supplémentaires de 2 ml pour les normes d’éthanol décrites ci-dessous ainsi que l’air, l’eau et les blancs de cocktail NaCl/protéase de 5 M.
  3. Mettre en place trois micropipettors p200 deux ensemble à 50 L, et le troisième ensemble à 200 l; un micropipettor p1000 réglé à 450 L et un micropipettor p2 réglé à 2 ll. Pour les pipettes en verre utilisées pour transférer les embryons de la vaisselle Petri aux tubes microcentrifuges de 1,5 ml, passez rapidement la pointe de la pipette à travers une flamme pour lisser les bords pour ne pas endommager les embryons lors de leur dessin dans la pipette.

5. Traitement des embryons pour la chromatographie de gaz de l’espace de la tête

REMARQUE : Les deux embryons dans leurs chorions et ceux précédemment retirés de leurs chorions sont traités de la même manière pour la cohérence dans le calcul des facteurs de dilution.

  1. À l’aide des deux micropipettors p200 réglés sur 50 l, puisez 50 l de la solution de cocktail de protéase en une et puisez 50 l’eau dans la seconde.
  2. À l’aide de la pipette en verre et du micropipettor, placez rapidement 10 embryons (à partir de l’étape 3.2) dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml et fermez le bouchon (tel que décrit à la figure 2A). Répétez l’essai pour tous les échantillons à tester, les contrôles et les embryons traités à l’éthanol.
  3. À l’aide du micropipettor p200 réglé sur 200 l, ouvrez rapidement le bouchon et retirez tous les supports embryonnaires résiduels (tels que décrits dans la figure 2C). Placez rapidement la pipette contenant 50 ll d’eau dans le tube et rapidement mais doucement (pour ne pas endommager les embryons) ajouter, puis retirer l’eau. Ajouter rapidement 50 l de la solution de cocktail de protéase du pipettor d’attente et fermer le bouchon du tube (Figure 2D).
    REMARQUE : Effectuez ce processus un échantillon à la fois.
  4. Laisser l’échantillon s’asseoir à RT pendant 10 min pour permettre au cocktail de protéase de dégrader le chorion. Ensuite, ajoutez rapidement 450 l de 5 M NaCl et fermez le bouchon du tube (Figure 2E). Vortex les échantillons pendant 10 min. Pour accélérer le processus, configurez le mélangeur pour vortexr plusieurs échantillons en même temps.
    REMARQUE : Ajouter une petite quantité (100 l) d’un mélange de perles de silice (2 tailles, 0,5 mm et 1 mm de perle) à n’importe quel tube dont les embryons de plus de 24 hpf. Chez les embryons plus âgés, le notochord restera intact indépendamment de combien de temps ils sont homogénéisés.
  5. Après homogénéisation pendant 10 min, retirer rapidement 2 l de supernatant d’embryon homogénéisé et ajouter à un flacon de chromatographe gazeux. Scellez rapidement le flacon avec le bouchon de polytétrafluoroéthylène.

6. Préparation des normes sur les médias et l’éthanol

  1. Pour préparer les normes des médias, diluer les médias par un facteur de 10 avec une solution de cocktail NaCl/protéase de 5 M. Ajouter 2 ll de chaque échantillon à un flacon de chromatographe à gaz et sceller avec un bouchon de polytétrafluoroéthylène.
  2. Pour préparer les normes d’éthanol, créez une dilution sérielle de 100 % d’éthanol dans une solution de cocktail NaCl/protéase de 5 M à des concentrations suivantes : 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 et 40 mm. Ajouter 2 ll de chaque norme à un flacon de chromatographe à gaz et sceller avec un bouchon de polytétrafluoroéthylène.

7. Préparation du chromatographe de gaz de l’espace de tête

REMARQUE : Cette configuration et ce protocole peuvent devoir être modifiés en fonction du chromatographe à gaz utilisé. La chromatographie de gaz de l’espace de tête est utilisée pour quantifier les niveaux d’éthanol, et non pour la séparation.

  1. Fixer le chauffe-eau de l’autosampler à 58 oC et allumer. Laisser le chauffe-eau atteindre 58 oC et allumer les conduites d’air et d’hydrogène alimentant le chromatographe à gaz (pour l’ionisation des flammes utilisée pour quantifier l’éthanol).
    REMARQUE : Le psi doit être réglé pour fonctionner correctement le chromatographe selon les spécifications du fabricant. Assurez-vous que la ligne d’hélium est allumée et réglé sur le psi approprié.
  2. Pour le septum, assurez-vous que le nombre d’échantillons injectés n’est pas le numéro de 100. Pour la fibre d’injection, assurez-vous que le nombre d’échantillons injectés n’est pas 'gt;500.
    REMARQUE : Si l’une ou l’autre est au-dessus de la quantité d’injections, elles devront être changées avant d’exécuter les échantillons d’essai.
  3. Activez le logiciel d’analyse et assurez-vous que le poste de travail est correctement installé. Stockez toutes les données selon les normes du laboratoire et du département. Créez une nouvelle liste d’échantillons pour les échantillons à exécuter.
  4. Lancez la méthode de démarrage et attendez que le détecteur d’ionisation des flammes se stabilise avant d’exécuter les échantillons. Une fois stable, exécutez la méthode de démarrage du logiciel pour nettoyer la fibre.

8. Mesures d’échantillon utilisant la chromatographie de gaz d’espace de tête

  1. Une fois la méthode de démarrage terminée, créez 1 nouvelle ligne par échantillon dans la liste d’échantillons. À partir du menu des méthodes du logiciel d’analyse, chargez 436 Current spme éthanol 2013 3min absorber 2_5min rg run. METH pour chaque échantillon de la liste d’échantillons.
    1. Remplissez la liste d’échantillons, en commençant par l’air, l’eau, 5 M NaCl /protéase cocktail blanc. Ensuite, entrez dans les normes dans l’ordre, de 0.3125 à 40 mM. Suivez les normes avec un deuxième tour de l’air, de l’eau, et 5 M NaCl / blanc cocktail de protéase.
    2. Entrez tous les échantillons de supernatants d’embryons homogénéisés à tester, de la plus faible à la plus élevée concentration prévue d’éthanol. Terminez par entrer dans un troisième et dernier tour de l’air, de l’eau, et 5 M NaCl / blanc cocktail de protéase.
  2. Ajouter les flacons de chromatographe à gaz à l’autosampler dans l’ordre dans lequel les échantillons ont été entrés. Laisser les échantillons se réchauffer pendant 10 à 15 min. Démarrer l’échantillon s’exécute dans le logiciel.
  3. Après que tous les échantillons et les blancs finaux ont exécuté, activez la méthode d’arrêt dans le logiciel en ajoutant un échantillon final dans la liste d’échantillons et en cours d’exécution en attente. METH. Sauvegarder toutes les données acquises lors des exécutions de l’échantillon. Éteignez l’équipement dans l’ordre suivant : chauffe-autosampler, réservoir d’hydrogène et, seulement après que la température du chromatographe atteigne 30 oC, le réservoir d’air. Laissez le réservoir d’hélium pour préserver la colonne de cire.

9. Échantillon d’analyse maximale de l’éthanol et de concentration de l’échantillon

REMARQUE : Toutes les valeurs à partir de 9,3 sur ont été calculées dans un fichier Excel que toutes les équations préremplies.

  1. Une fois la méthode d’arrêt terminée, cliquez sur Le chromatogramme ouvert. Ouvrez le dossier contenant les résultats. Les échantillons sont automatiquement intégrés dans ce programme.
  2. Dans les résultats, assurez-vous que les pics corrects ont été intégrés (les pics d’éthanol entre 2 et 2,5). Une fois que tous les échantillons ont été confirmés, imprimez ou exportez les résultats.
  3. Tracer la hauteur maximale des normes d’éthanol sur un graphique. Calculez la pente, l’interception Y et les valeurs R2 pour les normes d’éthanol (R2 devrait être 'gt;0.99).
    REMARQUE : Ces valeurs seront utilisées pour déterminer la concentration d’éthanol à partir de la hauteur de pointe de l’échantillon.
  4. Pour chaque échantillon, soustrayez la hauteur maximale de l’échantillon de l’interception Y des normes d’éthanol. Divisez cette valeur par la pente des normes d’éthanol pour obtenir la valeur de l’éthanol pour chaque échantillon dans les flacons GC.

figure-protocol-3

  1. Pour calculer la concentration d’éthanol dans les embryons, calculez d’abord le facteur de dilution pour chaque échantillon. Prenez la mesure de volume calculée à l’étape 2.3 de ce protocole et divisez-la par la mesure de volume plus 500 L. Il s’agit de la solution de cocktail NaCl/protease de 5 M ajoutée à chaque échantillon pendant le traitement de l’embryon (étapes 5.3 et 5.4).

figure-protocol-4

  1. À l’aide de ce facteur de dilution de l’échantillon, multipliez la valeur de l’éthanol de l’échantillon pour chaque échantillon. Les résultats seront dans la concentration mM. Calculez les échantillons de référence des médias en multipliant la valeur de l’éthanol média par le facteur de dilution de 10.

figure-protocol-5

figure-protocol-6

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les niveaux d’éthanol dans le sang ne peuvent pas être déterminés chez les poissons zèbres embryonnaires précoces, car ils n’ont pas de système circulatoire entièrement formé. Pour déterminer le niveau de concentration d’éthanol dans les embryons de poissons zèbres, les niveaux d’éthanol sont mesurés directement à partir de tissus embryonnaires homogénéisés. Pour bien mesurer les concentrations embryonnaires d’éthanol, il faut tenir compte du volume embryonnaire. L’embryon (jaune attaché) se trouve à l’intérieur du chori...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En tant que modèle de développement, le poisson zèbre est idéal pour étudier l’impact des facteurs environnementaux sur le développement. Ils produisent un grand nombre d’embryons fécondés à l’extérieur, ce qui permet un moment précis et des paradigmes de dosage dans les études sur l’éthanol. Ceci, combiné avec les capacités d’imagerie en direct et la conservation génétique et développementale avec les humains, font du poisson zèbre un puissant système modèle pour les études de tératologie. Décrit est un protocole pour m...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La recherche présentée dans cet article a été soutenue par des subventions antérieures des National Institutes of Health/National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIH/NIDCR) R01DE020884 à J.K.E. et National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIH/NIAAA) F32AA021320 to C.B.L. et par la subvention actuelle des National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 to C.B.L. Nous remercions Rueben Gonzales d’avoir fourni et aidé à l’analyse des chromatographes à gaz. Nous remercions Tiahna Ontiveros et la Dre Gina Nobles.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Airfourni par contrat à l’université
Balance analytiqueVWR10204-962
Échantillonneur automatique, CP-8400Chromatographe en phase gazeuse Varian
Chlorure de calciumVWR97062-590
EthanolDecon Labs2701
Flacon de chromatographe en phase gazeuse avec septum en polytétrafluoroéthylène/silicone et bouchon en plastique 2 mLAgilent8010-0198Peut réutiliser les flacons après le nettoyage, mais pas les bouchons/septa
Chromatographe en phase gazeuse, CP-3800Varian
HeliumFourni par contrat à l’université
Colonne capillaire HP InnowaxAgilent19095N-123I30 m x 0,53 mm x 1,0 &mu ; m film épais
HyrdogenFourni par contrat à l’université Sulfate de
magnésium (heptahydraté)Fisher ScientificM63-500
Tube de microcentrifugation 1,5 mLFisher Scientific2682002
pointes de micropipette 10 &mu ; LFisher Scientific13611106
Pointes de micropipette 1000 &mu ; LFisher Scientific13611127
Pointes de micropipette 200 &mu ; LFisher Scientific13611112 boîtes de
Pétri 100 mmFisher ScientificFB012924
Pipetman L p1000L MicropipetteGilsonFA10006M
Pipetman L p200L MicropipetteGilsonFA10005M
Pipetman L p2L MicropipetteGilsonFA10001M
Septum en polytétrafluoroéthylène/silicone et bouchon en plastiqueAgilent5190-7021Bouchons de rechange/septa pour flacons de chromatographe en phase gazeuse
Chlorure de potassium FisherScientificP217-500
Phosphate de potassium (dibasique)VWRBDH9266-500G
PronaseVWR97062-916
Perles de silice .5 mmBiospec Products11079105z
Perles de silice 1,0 mmBiospec Products11079110z
Bicarbonate de sodiumVWRBDH9280-500G
Chlorure de sodiumFisher ScientificS271-500
Phosphate de sodium (dibasique)Fisher ScientificS374-500
Assemblage de fibres de microextraction en phase solide Carboxen/Polydimethylsiloxane MilliporeSigma57343-UFibres de remplacement Station
travail de chromatographie en étoileLogiciel dechromatographie
Septa Thermogreen Low Bleed (LB-2) SeptaMillipore Sigma23154Septa d’entrée de remplacement
Échantillonneur automatique de Varian

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study. Archive of Diseases in Childhood. 93 (9), 732-737 (2008).
  2. Cudd, T. A. Animal model systems for the study of alcohol teratology. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 389-393 (2005).
  3. Williams, J. F., Smith, V. C. Committee on Substance Abuse. Fetal Alcohol Spectrum Disorders. Pediatrics. 136 (5), 1395-1406 (2015).
  4. Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93(2014).
  5. Petrelli, B., Weinberg, J., Hicks, G. G. Effects of prenatal alcohol exposure (PAE): insights into FASD using mouse models of PAE. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 131-147 (2018).
  6. Mayfield, J., Arends, M. A., Harris, R. A., Blednov, Y. A. Genes and Alcohol Consumption: Studies with Mutant Mice. International Review Neurobiology. 126, 293-355 (2016).
  7. Marquardt, K., Brigman, J. L. The impact of prenatal alcohol exposure on social, cognitive and affective behavioral domains: Insights from rodent models. Alcohol. 51, 1-15 (2016).
  8. Sulik, K. K. Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism. Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 366-375 (2005).
  9. Lipinski, R. J., et al. Ethanol-induced face-brain dysmorphology patterns are correlative and exposure-stage dependent. PLoS One. 7 (8), 43067(2012).
  10. Eberhart, J. K., Parnell, S. The genetics of fetal alcohol spectrum disorders. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (6), 1154-1165 (2016).
  11. Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Randall, C. L. Teratogenic actions of ethanol in the mouse: a minireview. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 55 (4), 501-513 (1996).
  12. Ahlgren, S. C., Thakur, V., Bronner-Fraser, M. Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10476-10481 (2002).
  13. Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 85 (6), 556-567 (2009).
  14. Hong, M., Krauss, R. S. Cdon mutation and fetal ethanol exposure synergize to produce midline signaling defects and holoprosencephaly spectrum disorders in mice. PLoSGenetics. 8 (10), 1002999(2012).
  15. Aoto, K., Shikata, Y., Higashiyama, D., Shiota, K., Motoyama, J. Fetal ethanol exposure activates protein kinase A and impairs Shh expression in prechordal mesendoderm cells in the pathogenesis of holoprosencephaly. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 82 (4), 224-231 (2008).
  16. Deltour, L., Ang, H. L., Duester, G. Ethanol inhibition of retinoic acid synthesis as a potential mechanism for fetal alcohol syndrome. The FASEB Journal. 10 (9), 1050-1057 (1996).
  17. Wentzel, P., Eriksson, U. J. Ethanol-induced fetal dysmorphogenesis in the mouse is diminished by high antioxidative capacity of the mother. Toxicological Sciences. 92 (2), 416-422 (2006).
  18. Karacay, B., Mahoney, J., Plume, J., Bonthius, D. J. Genetic absence of nNOS worsens fetal alcohol effects in mice. II: microencephaly and neuronal losses. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 39 (2), 221-231 (2015).
  19. Bonthius, D. J. Jr, Winters, Z., Karacay, B., Bousquet, S. L., Bonthius, D. J. Importance of genetics in fetal alcohol effects: null mutation of the nNOS gene worsens alcohol-induced cerebellar neuronal losses and behavioral deficits. Neurotoxicology. 46, 60-72 (2015).
  20. Bonthius, D. J., et al. Deficiency of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) worsens alcohol-induced microencephaly and neuronal loss in developing mice. Brain Research. Developmental Brain Research. 138 (1), 45-59 (2002).
  21. Langevin, F., Crossan, G. P., Rosado, I. V., Arends, M. J., Patel, K. J. Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice. Nature. 475 (7354), 53-58 (2011).
  22. Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. Fishing for Fetal Alcohol Spectrum Disorders: Zebrafish as a Model for Ethanol Teratogenesis. Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).
  23. Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
  24. McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140 (15), 3254-3265 (2013).
  25. Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish. Alcohol. 48 (6), 595-602 (2014).
  26. Harris, R. A., Trudell, J. R., Mihic, S. J. Ethanol's molecular targets. Science Signaling. 1 (28), (2008).
  27. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (1993).
  28. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).
  29. Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. Water Distribution and permeability of zebrafish embryos, Brachydanio rerio. Journal of Experimental Zoology. 278 (6), 356-371 (1997).
  30. Lippi, G., et al. The alcohol used for cleansing the venipuncture site does not jeopardize blood and plasma alcohol measurement with head-space gas chromatography and an enzymatic assay. Biochemia Medica. 27 (2), 398-403 (2017).
  31. Poklis, J. L., Wolf, C. E., Peace, M. R. Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID). Drug Testing and Analysis. 9 (10), 1637-1640 (2017).
  32. Heit, C., et al. Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (9), 1825-1831 (2016).
  33. Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. E. Development and Validation of a Method for Alcohol Analysis in Brain Tissue by Headspace Gas Chromatography with Flame Ionization Detector. Journal of Analytical Toxicology. 40 (8), 653-658 (2016).
  34. Schlatter, J., Chiadmi, F., Gandon, V., Chariot, P. Simultaneous determination of methanol, acetaldehyde, acetone, and ethanol in human blood by gas chromatography with flame ionization detection. Human and Experimental Toxicology. 33 (1), 74-80 (2013).
  35. Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4142(2012).
  36. Adalsteinsson, E., Sullivan, E. V., Mayer, D., Pfefferbaum, A. In vivo quantification of ethanol kinetics in rat brain. Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2683-2691 (2006).
  37. Quertemont, E., Green, H. L., Grant, K. A. Brain ethanol concentrations and ethanol discrimination in rats: effects of dose and time. Psychopharmacology. 168 (3), 262-270 (2003).
  38. Flentke, G. R., Klinger, R. H., Tanguay, R. L., Carvan, M. J., Smith, S. M. An evolutionarily-conserved mechanism of calcium-dependent neurotoxicity. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 38 (5), 1255-1265 (2014).
  39. Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish. Neurotoxicology and Teratology. 26 (6), 769-781 (2004).
  40. Zhang, C., Ojiaku, P., Cole, G. J. Forebrain and hindbrain development in zebrafish is sensitive to ethanol exposure involving agrin, Fgf, and sonic hedgehog function. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 97 (1), 8-27 (2013).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Ethanol QuantificationHead Space Gas ChromatographyZebrafish EmbryosFetal Alcohol Spectrum DisordersProtease Cocktail TreatmentEmbryo Volume MeasurementGas Chromatography AnalysisEthanol Concentration CalculationMedia Reference SamplesEmbryonic Water Content

Articles connexes