Article de méthode

Correction à haute précision des changements chromatiques 3D à l’ère de l’imagerie biologique à haute résolution à l’aide de Chromagnon

DOI :

10.3791/60800

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16 juin 2020

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1Advanced ICT Research Institute Kobe, National Institute of Information and Communications Technology, 2Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University, 3Micron Advanced Bioimaging Unit, Department of Biochemistry, University of Oxford

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La correction des changements chromatiques dans les images de microscopie multicolore en trois dimensions (3D) est cruciale pour l’analyse quantitative des données. Ce protocole est développé pour mesurer et corriger les changements chromatiques dans les échantillons biologiques par l’acquisition d’images de référence appropriées et le traitement avec le logiciel open-source, Chromagnon.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microscopie quantitative de fluorescence multicolore repose sur l’appariement spatial soigneux des canaux de couleur acquis à différentes longueurs d’onde. En raison de l’aberration chromatique et de l’alignement imparfait des caméras, les images acquises dans chaque canal peuvent être déplacées, et magnifiées, ainsi que tournées les unes par rapport aux autres dans l’une des trois dimensions. Avec la méthode classique d’étalonnage, les décalages chromatiques sont mesurés par des perles multicolores attachées à la surface d’un couvercle, et un certain nombre de logiciels sont disponibles pour mesurer les changements chromatiques de ces échantillons d’étalonnage. Cependant, l’aberration chromatique peut varier avec la profondeur, changer avec les conditions d’observation et être induite par l’échantillon biologique lui-même, ce qui entrave la détermination de la quantité réelle de changement chromatique dans l’échantillon d’intérêt et dans le volume. La correction des changements chromatiques à une plus grande précision est particulièrement pertinente pour la microscopie à super résolution où seuls de légers changements chromatiques peuvent affecter les analyses quantitatives et modifier l’interprétation des images multicolores. Nous avons développé un logiciel open-source Chromagnon et des méthodes d’accompagnement pour mesurer et corriger les changements chromatiques 3D dans les échantillons biologiques. Nous fournissons ici un protocole d’application détaillé qui inclut des exigences spéciales pour la préparation des échantillons, l’acquisition de données et le traitement des logiciels pour mesurer les changements chromatiques dans les échantillons biologiques d’intérêt.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’imagerie multicolore est l’un des aspects fondamentaux de la microscopie de fluorescence biologique, dans les cas où la relation spatiale de différentes molécules ou structures est d’un intérêt majeur. L’aberration chromatique, une aberration optique de la lumière polychromatique causée par la dispersion, modifie la position apparente des objets colorés d’intérêt. De même, les microscopes équipés de plusieurs caméras consacrées à l’acquisition de chaque couleur ont des changements chromatiques plus complexes en raison des différences dans les éléments optiques et l’alignement imparfait entre les canaux. Ainsi, de tels changements chromatiques peuvent conduire à une fausse conclusion à moins d’être explicitement corrigés par l’utilisateur. Bien que les changements chromatiques n’aient pas été un problème majeur tant que la résolution de la microscopie est limitée par la limite classique de résolution, le développement récent de la microscopiesuper-résolution 1 a incité la nécessité d’une correction plus précise des changements chromatiques.

Il a été une pratique courante de mesurer les changements chromatiques des systèmes de microscope à l’aide d’une diapositive multicolore d’étalonnage des perles2. La méthode d’étalonnage à base de perles est appropriée pour mesurer les déplacements chromatiques de l’ensemble de l’optique du microscope vers la surface du couvercle2. Cette méthode, cependant, est incapable de mesurer les changements chromatiques dans les échantillons biologiques d’intérêt. Il est important de noter que de nombreux échantillons biologiques sont tridimensionnels (3D), et les déplacements chromatiques de ces échantillons sont différents de ceux à la surface du couvercle. En outre, les changements chromatiques changent avec les conditions d’imagerie2,3. Nous avons mesuré les changements chromatiques dans les échantillons biologiques 3D et constaté que l’incertitude des changements chromatiques était souvent jusqu’à 350 nm par la méthode classique d’étalonnage multicolore-perle3. Par conséquent, les changements chromatiques doivent être mesurés dans des échantillons biologiques à la profondeur d’intérêt et dans les conditions d’imagerie utilisées.

Ici, nous décrivons les procédures pour mesurer les changements chromatiques dans les échantillons biologiques et corriger ces changements à l’aide de notre logiciel, Chromagnon3. Pour mesurer les changements chromatiques dans les échantillons biologiques, notre méthode utilise deux types d’ensembles de données, une image « cible » et une image « de référence ». L’image « cible » est une image multicolore d’intérêt, par exemple, des images tachées d’ADN, d’enveloppe nucléaire et de microtubules. Il est souvent impossible de mesurer les changements chromatiques dans une telle image. Par conséquent, nous avons besoin d’une image de « référence » qui est dédiée à la mesure des changements chromatiques dans l’échantillon. La seule définition d’une image de « référence » est une image multicolore du même objet. En ce sens, une image multicolore de perles est également un type d’image de référence. Ici, nous décrivons trois types différents d’image de référence qui sont utilisés pour mesurer les changements chromatiques dans les échantillons biologiques : « images de référence croisées », « images de référence de champ lumineux » et « images de référence d’étalonnage biologique ». Le type d’image de référence dépend du type de microscope utilisé ou de l’exactitude de correction requise comme résumé dans le tableau 1.

CrosstalkChamp lumineuxÉtalonnage biologique (sur une diapositive différente)Étalonnage biologique (sur la même diapositive)
Précisiona ++++++b +++
Simplicité+++++++++
Microscopie applicableChamp largeChamp largeTousTous
Disponibilité de l’alignement local++-c -c
a: Nombre de « » indique une note croissante. Single plus est d’environ 50 nm et trois plus est d’environ 15 nm en 3D.
b: La précision dépend de la durée de la constante des conditions d’imagerie.
c: L’étalonnage local mesuré par des échantillons de perles multicolores peut être combiné tel que décrit à la section 4 du protocole.

Tableau 1 : Paramètres lors du choix du type d’images de référence.

Les « images de référence Crosstalk » ont la plus grande précision de correction et sont relativement simples à réaliser3,4 (Tableau 1). L’inconvénient est leur limitation dans les applications de microscopie en raison de leur incapacité à mesurer les changements chromatiques dans les chemins d’excitation. En outre, pour obtenir de telles images, le microscope doit être équipé de miroirs dichroiques multibands, et de filtres d’émission qui sont contrôlés indépendamment des filtres d’excitation ou des sources lumineuses. La microscopie appropriée comprend la microscopie classique à large champ, la microscopie de localisation à molécule unique (SMLM) comme la microscopie de localisation/microscopie de reconstruction optique stochastique (PALM/STORM)5,,6 et la microscopie d’expansion7 observée avec la microscopie à large champ. Une image de référence croisée est acquise à partir de l’échantillon cible lui-même. Il s’agit d’une image de fluorescence croisée (saignement) d’un colorant obtenu dans tous les canaux requis. L’émission de fluorescence se développe toujours vers les longueurs d’onde plus longues, c’est pourquoi les colorants avec la longueur d’onde d’émission la plus courte sont excités d’obtenir la fluorescence croisée dans les canaux de longueurs d’onde plus longues. Par exemple, lorsque l’échantillon est taché de bleu, de vert et de rouge, seul le colorant bleu est excité, et la lumière d’émission est obtenue dans les canaux bleu, vert et rouge. Dans ce protocole, l’ADN taché de 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) a été utilisé pour obtenir la fluorescence de crosstalk.

Les « images de référence de champ lumineux » sont une alternative plus facile et moins phototoxique aux « images de référence croisées » mais sont les3 moins précises (tableau 1). Il s’agit d’images lumineuses de l’échantillon cible, acquises dans tous les canaux de couleur utilisés dans l’image cible.

Les « images de référence d’étalonnage biologique » ont l’avantage de s’appliquer à tout type de microscopie en raison de leur capacité à mesurer les changements chromatiques tant dans les voies d’excitation que dans les voies d’émission3,8 (Tableau 1). La microscopie appropriée comprend la microscopie à large champ, la microscopie confocale, la microscopie de feuille de lumière, l’épuisement stimulé des émissions (STED)9, la microscopie d’éclairage structurée (SIM)10, Airyscan/SORA11,12, SMLM observé avec le mode de fluorescence de réflexion interne totale (TIRF), super résolution Olympus (OSR)13, et ainsi de suite. Une image de référence d’étalonnage biologique est acquise à partir d’un échantillon d’étalonnage préparé de la même façon que l’échantillon cible, mais avec la coloration d’une seule structure avec plusieurs couleurs. La précision de correction excelle dans la résolution de la plupart des microscopies à super résolution et la préparation d’un échantillon d’étalonnage biologique peut être relativement simple. Un autre avantage est la disponibilité pour « ess » plusieurs images de référence. Par conséquent, même si les images individuelles contiennent de mauvaises informations pour la mesure des changements chromatiques, le contenu de l’information peut être augmenté en moyenne plusieurs images. La précision dépend de la façon dont les conditions d’imagerie sont maintenues constantes. À cet égard, la meilleure performance est obtenue lorsque les échantillons cible et de référence sont sur la même diapositive, en utilisant, par exemple, des verres à couverture à chambre de 8 puits(tableau 1, à droite). Dans ce protocole, l’actine tachée de trois couleurs de phalloïdine a été utilisée comme étalonnage biologique.

Une fois qu’une image de référence est obtenue, le décalage chromatique est mesuré et corrigé par notre logiciel Chromagnon. Il n’y a aucune limitation sur le nombre de canaux, les sections Z et les délais que Chromagnon peut mesurer et corriger les changements chromatiques pour. Chromagnon mesure les changements chromatiques en deux étapes. La première étape acquiert les paramètres d’alignement « global » ou « affine » de la traduction dans les axes X, Y, Z, grossissement le long des axes X, Y, Z et rotation autour de l’axe Z. La précision de calcul de l’alignement global est de ~16 nm en 3D et ~8 nm en 2D. La deuxième étape est un « alignement local » itératif 2D en option sur les images projetées afin d’obtenir une précision plus élevée. Dans le processus d’alignement local, les images sont subdivisées en plusieurs régions et les changements chromatiques dans ces régions locales sont mesurés. Par la suite, les régions sont encore divisées et les changements chromatiques dans les sous-régions sont mesurés itérativement jusqu’à ce que le nombre de pixels dans la région atteigne le nombre minimum de pixels (généralement 60 x 60 pixels). La carte d’alignement locale qui en résulte est combinée avec le paramètre d’alignement global et est appliquée à l’image cible par une transformation élastique. Après cette étape, la précision de calcul est améliorée à ~14 nm en 3D et ~6 nm en 2D. L’alignement local n’est pas adapté aux images de référence d’étalonnage biologique parce que la structure biologique de la référence est différente de celle de la cible (tableau 1). Par conséquent, seul l’alignement global est utilisé pour les images de référence d’étalonnage biologique.

Les changements chromatiques locaux proviennent de deux sources; microscope distorsion locale instrumentale et inhomogeneity structurel biologique. Étant donné que la distorsion locale instrumentale au microscope est constante, elle peut être mesurée à partir de l’échantillon de référence de perles multicolores et corrigée comme paramètre fixe. Chromagnon peut combiner la carte de distorsion locale instrumentale du microscope et les paramètres d’alignement global des étalonnages biologiques (tableau 1). À l’aide de cette méthode, on s’attend à ce que la précision moyenne de l’étalonnage biologique soit améliorée de 1 à 2 nm supplémentaires.

Ici, nous décrivons un protocole pour corriger les décalages chromatiques des images de fluorescence 3D à l’aide de notre logiciel Chromagnon, du bas de gamme le plus facile à la plus haute précision. Nous utilisons l’immunostaining des cellules HeLa comme exemple et les avons observées à l’aide de la microscopie 3D à large champ et de la 3D-SIM. Dans la première section, nous décrivons comment préparer des échantillons cibles et des échantillons d’étalonnage biologique. Cette partie du protocole doit être optimisée pour les cibles spécifiques de la recherche. Dans la deuxième section, nous décrivons les méthodes d’acquisition de trois types d’images de référence au microscope. L’hypothèse était d’obtenir des canaux bleus, verts et rouges, mais la composition des canaux devrait être modifiée par les cibles spécifiques de la recherche et par les configurations du microscope. Peu importe si le microscope est équipé d’une seule caméra ou de plusieurs caméras. Dans la troisième section, nous décrivons comment on peut utiliser notre logiciel pour mesurer et corriger les changements chromatiques de l’image cible en utilisant des images de référence. Enfin, dans la quatrième section, nous décrivons une méthode pour compléter les images de référence d’étalonnage biologique en utilisant l’étalonnage local instrumental d’un microscope.

Protocole

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1. Préparation de l’échantillon

  1. Préparation d’un échantillon cible
    1. Graines 2,5 x 105 cellules HeLa sur un plat à fond de verre de 35 mm et les cultiver dans 2 mL de milieu de croissance (milieu aigle modifié de Dulbecco avec L-glutamine et pyruvate de sodium complétée par 10% de sérum bovin fœtal [FBS]) à 37 °C et une concentration de CO2 de 5%. Alternativement, les graines 6 x 104 cellules HeLa sur un verre à couverture de 8 puits et les cultiver dans 0,5 mL de milieu de croissance à 37 °C et une concentration de CO2 de 5%. Utilisez #1,5 verre de couverture (d’une épaisseur de 0,170 mm) pour la microscopie haute résolution.
      REMARQUE : Utilisez 1/4 de volumes pour le verre à couverture à chambre de 8 puits pour d’autres étapes, à l’exception des étapes 1.1.5, 1.1.6, 1.1.8, 1.1.11 et 1.2.5 lorsque le volume est de 100 μl indépendamment du type de récipient.
    2. Après environ 24 h d’incubation, remplacez la solution par 2 mL de formaldéhyde de 3,7 % dans la solution saline tamponnée par phosphate (PBS). Après un mélange doux, continuer à fixer les cellules pendant 15 min à température ambiante (RT) sur une plate-forme de rotation.
      ATTENTION : Travaillez dans une hotte de fumée.
    3. Laver les cellules avec 2 mL de PBS, 3x chacune pendant 5−10 min sur une plate-forme de rotation.
      REMARQUE : Suivez les règlements locaux pour éliminer les déchets de formaldéhyde.
    4. Permeabiliser les cellules avec 2 mL de 0,1% Triton X-100 en PBS pendant 5 min sur une plate-forme de rotation, suivie de trois lavages avec 2 mL de PBS, chacun pour 5−10 min sur une plate-forme de rotation.
    5. Incuber les cellules dans 100 μL d’albumine de sérum bovin (BSA) à 1% en PBS pendant 1 h à RT sur une plate-forme de rotation.
    6. Remplacer la solution par 100 μL d’un mélange d’anticorps primaires (anticorps polyclonal anti-emerine14 et anticorps monoclonal anti-tubuline15)dans 1% BSA en PBS à des dilutions appropriées (1/500 pour l’anti-emerine et 1/100 pour l’anti-tubuline), et incuber toute la nuit à 4 °C.
    7. Laver les cellules avec 2 mL de PBS, 3−5x chacune pendant 10 min sur une plate-forme de rotation.
    8. Remplacez la solution par 100 μL d’un mélange d’anticorps secondaires (anti-lapin IgG par Alexa Fluor 488 et IgG anti-souris par Alexa Fluor 555) dans 1% de BSA en PBS à 1/500 dilution, et incuber pendant 3−4 h à RT.
    9. Laver les cellules avec 2 mL de PBS, 3−4x chacune pendant 5 min sur une plate-forme de rotation.
    10. Remplacez la solution par 2 mL de 0,5 μg/mL DAPI en PBS pour tacher l’ADN pendant 30 min à RT sur une plate-forme de rotation.
      NOTE: Au lieu de DAPI, Hoechst 33342 à la même concentration peut également être utilisé.
    11. Remplacer la solution par ~100 μL de support de montage (Table des matériaux).
  2. Préparation d’un échantillon d’étalonnage biologique
    1. Préparer les cellules fixes décrites aux étapes 1.1.1−1.1.4.
      REMARQUE : De préférence, des échantillons sont préparés sur un verre à couverture chambré pour placer à la fois la cible et les échantillons de référence dans des chambres séparées sur le même couvercle (tableau 1, droit le plus). Cette préparation est préférable lorsque l’expérience nécessite la plus grande précision de correction. Lorsque l’échantillon doit être préparé sur une couverture régulière, utilisez des couvercles de précision avec une faible variation d’épaisseur (« no 1.5H ») pour assurer la reproductibilité.
    2. Préparer la solution de bouillon de phalloïdine fluorescente conjuguée à la teinture dans 1,5 mL de méthanol et conserver à -20 °C. Mélanger la solution de stock de phalloïdine dans PBS à la dilution suivante : 1/100 pour la phalloïdine avec Alexa Fluor 405, 1/1000 pour la phalloïdine avec Alexa Fluor 488, et 1/200 pour la phalloïdine avec Alexa Fluor 594.
    3. Remplacer la solution par 1 mL du mélange de phalloïdine préparé à l’étape 1.2.2 et incuber pendant 30 min à RT sur une plate-forme de rotation.
    4. Laver les cellules avec 2 mL de PBS, 3−5x chacune pendant 10 min sur une plate-forme de rotation.
    5. Remplacez la solution par ~100 μL de support de montage.
      REMARQUE : Les échantillons d’étalonnage peuvent être stockés à 4 °C ou -20 °C pour une utilisation répétée.

2. Acquisition d’images de référence

  1. Images de référence Crosstalk
    1. Placez l’échantillon cible préparé à l’étape 1.1 sur un microscope à large champ.
    2. Acquérir une image de fluorescence de la cible dans les canaux bleus, verts et rouges.
      REMARQUE : Pour les images 3D, la taille de l’étape Z de l’image de référence peut être différente de celle de l’image cible tant que le fichier image contient des informations pour la taille de l’étape. La taille de l’étape Z pour les images de référence et de cible est de préférence inférieure à la moitié de la résolution optique de l’axe Z, qui est calculée par figure-protocol-1 pour une microscopie limitée par diffraction, où λ est la longueur d’onde dans les nanomètres et NA est l’ouverture numérique de la lentille objective. Par exemple, si la résolution axiale est de 550 nm, utilisez une étape Z inférieure à 275 nm. Aucune série de temps n’est requise pour l’image de référence.
    3. Par la suite, pour acquérir une image de fluorescence de la référence, sélectionnez la lumière d’excitation uniquement pour DAPI, et choisissez d’acquérir en canaux bleus, verts et rouges. Acquérir l’image de référence exactement à la même position de stade et la hauteur Z, dans le cas d’une pile 3D.
      REMARQUE : Pour les longueurs d’onde d’émission plus longues, il faudra augmenter l’intensité de l’éclairage et le temps d’exposition.
  2. Images de référence de champ lumineux
    1. Placez l’échantillon cible préparé à l’étape 1.1 sur un microscope à large champ.
    2. Acquérir une image de fluorescence de la cible dans les canaux bleus, verts et rouges.
      REMARQUE : La taille de l’étape Z remplit de préférence le critère nyquiste tel que décrit à l’étape 2.1.2.
    3. Acquérir une image de champ lumineuse de la cible en canaux bleus, verts et rouges exactement à la même position de stade que dans 2.2.2 et la même hauteur Z dans le cas d’une pile 3D.
  3. Images de référence d’étalonnage biologique
    1. Placez l’échantillon cible préparé à l’étape 1.1 sur un microscope 3D-SIM.
    2. Acquérir une image de fluorescence de la cible dans les canaux bleus, verts et rouges par 3D-SIM. Reconstruire l’image super-résolue.
      REMARQUE : Le type de microscope peut être de n’importe quel type tel que 3D-SIM, confocal, STED, etc. La taille de l’étape Z remplit de préférence le critère nyquiste tel que décrit à l’étape 2.1.2.
    3. Acquérir plusieurs images de fluorescence de la référence préparées à l’étape 1.2 à différentes positions d’étape semblables à l’image cible (étape 2.3.2) par 3D-SIM. Reconstruire les images super-résolues.
      REMARQUE : Le nombre total de pixels dans XY doit être le même dans toutes les images de référence. La taille de l’étape en Z doit être la même dans toutes les images de référence. Le nombre total de sections Z est préféré pour être le même que dans l’image cible, mais ce n’est pas une exigence absolue. La position XY sur la scène pour ces images de référence n’a pas d’importance parce que la position ou coverslip est déjà différente de la position de l’échantillon cible et en outre la différence de décalage chromatique sur un seul couvercle est inférieure à 15 nm3. Les conditions d’imagerie, y compris la lentille objective, la température d’observation, l’huile d’immersion, la taille du trou d’épingle en microscopie confocale et l’angle d’inclinaison dans la microscopie d’éclairage très inclinée16,devraient tous correspondre à la référence pour la meilleure performance. Si le microscope équipe plusieurs caméras pour acquérir plusieurs canaux simultanément, les images de référence doivent être acquises aussi souvent que chaque semaine pour corriger la dérive instrumentale.

3. Correction du décalage chromatique à l’aide du logiciel Chromagnon

  1. À l’aide d’un navigateur Web, accédez à https://github.com/macronucleus/Chromagnon/releaseset téléchargez la plus récente version binaire de Chromagnon.
    REMARQUE : Les versions binaires sont disponibles pour Windows, Mac et certaines versions Linux.
  2. Extraire le programme et mettre le fichier exécutable à un endroit pratique. Sur un Windows ou Un Mac, double-cliquez sur le fichier pour l’ouvrir, ou exécutez le fichier binaire à partir de la ligne de commande d’un système Linux.
    REMARQUE : L’interface utilisateur graphique telle qu’elle figure 1 s’ouvre. Le programme peut être empêché d’ouvrir en double cliquant pour la première fois pour une raison de sécurité. Dans ce cas, utilisez la méthode dépendante de la plate-forme pour ouvrir le programme téléchargé à partir d’Internet.

figure-protocol-2
Figure 1 : Capture d’écran de l’interface utilisateur graphique de Chromagnon. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

  1. Faites glisser et déposer les fichiers de référence dans la « zone de référence » (figure 1) ou cliquez sur Fichiers de référence ( Figure1A) pour ouvrir une boîte de dialogue sélecteur de fichiers. Selon les formats de fichier, si le programme demande à installer un kit de développement Java (JDK), appuyez sur oui et l’utilisateur sera navigué vers la page de téléchargement. Téléchargez et installez le JDK pour le système d’exploitation tel qu’indiqué. Chromagnon devrait être en mesure de lire le format de fichier image après le redémarrage du programme.
    NOTE: Chromagnon peut lire la plupart des formats de fichiers d’image (multipage 'tif', 'czi', 'nd2', 'oib', 'lif', 'dv', etc.). Le format d’image de microscope d’origine est préféré à cette étape car les métadonnées peuvent être perdues lorsqu’un format d’image est converti en un fichier tif multipage. Si le nom du canal est affiché comme 0, 1, 2, etc. au lieu de longueurs d’onde telles que 528, 609(figure 2A, boîtes vertes), alors Chromagnon ne connaît pas l’identité des canaux dans l’image. Dans ce cas, assurez-vous que l’ordre des canaux et la taille du pixel dans le fichier de référence correspondent à ceux du fichier cible. Par exemple, si l’ordre des canaux dans la référence est vert et rouge, alors l’ordre des canaux dans la cible doit également être vert et rouge, mais pas rouge et vert.

figure-protocol-3
Figure 2 : Exemple de capture d’écran pour le chargement de plusieurs fichiers. (A) Un cas dans lequel toutes les images de référence ont les images cibles correspondantes. Les noms de canal sont correctement identifiés par les longueurs d’onde (indiquées par une zone verte) dans les fichiers d’image utilisés dans cet exemple. BB) Cas dans lequel une seule image de référence est utilisée pour corriger plusieurs images cibles. (C) Un cas dans lequel plusieurs images de référence (indiquées par une boîte rouge) sont en moyenne, et l’image de référence résultante après la moyenne est utilisée pour corriger plusieurs images cibles. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

  1. Faites glisser et déposer les fichiers cibles dans la « zone cible » (figure 1) ou cliquez sur Fichiers cibles (figure 1B) pour ouvrir une boîte de dialogue sélecteur de fichiers.
    REMARQUE : S’il existe plusieurs images cibles et que chacune d’entre elles a des images de référence correspondantes,l’imagede référence correspondante et l’image cible doivent se trouver sur la même ligne dans les cases de référence et de cible respectives ( Figure 2A). Une seule image de référence peut également être utilisée pour aligner plusieurs images cibles (Figure 2B).
  2. Cochez la case à cocher des marges de culture si elle n’est pas cochée ( figure1C).
    REMARQUE : Si cette case est cochée, les marges résultant de l’alignement sont rognées. Vérifiez cette option pour une utilisation générale, mais décochez si une comparaison au niveau des pixels est nécessaire entre les images avant et après l’alignement.
  3. Choisissez un format d’image de sortie dans la liste de choix (Figure 1D).
    REMARQUE : Les formats disponibles sont 'tif' (format ImageJ17), 'dv', et 'ome.tif'; le format 'ome.tif' n’est disponible qu’après l’installation de JDK.
  4. Spécifiez le suffixe pour le nom de fichier de sortie (Figure 1E, la valeur par défaut est '_ALN'), qui est ajouté au nom de fichier cible.
  5. Pour les images de référence crosstalk avec un rapport signal/bruit élevé, utilisez l’alignement local de la liste de choix de l’alignement local (Figure 1F), choisissez Projection pour utiliser l’alignement local et Aucun pour le désactiver. Utiliser une fenêtre minimale de 60 (figure 1G).
    REMARQUE : Lors de l’utilisation de l’alignement local, toutes les images cibles doivent avoir des images de référence correspondantes (Figure 2A). L’alignement local n’est pas recommandé pour les images de référence d’étalonnage biologique, car les déplacements chromatiques locaux varient d’un échantillon à l’autre (tableau 1). Pour la même raison, un seul alignement local ne peut pas être appliqué à de nombreuses images cibles (Figure 2B). À titre d’exception, il peut être utilisé lorsque l’échantillon d’intérêt n’est qu’à la surface du couvercle, et que le champ de vision est rempli d’objets lumineux, tout comme les échantillons multicolores de perles fluorescentes.
  6. Pour les images de référence d’étalonnage biologique multiple, vérifiezl’option de référence moyenne ( Figure 1H) pour mesurer un seul paramètre d’alignement à partir de l’image moyenne, et le paramètre d’alignement unique est ensuite appliqué à toutes les images cibles (Figure 2C). Choisissez Aucun pour l’alignement local ( Figure1F).
  7. Cliquez sur Exécuter tous les (Figure 1I) pour commencer les mesures; les paramètres d’alignement sont appliqués aux images cibles.
    REMARQUE : Après avoir mesuré les décalages chromatiques des fichiers de référence, le programme fabrique des fichiers avec extension " chromagnon.csv " ou " chromagnon.tif « . Le type de fichier de sortie dépend de l’entrée en vigueur de l’alignement local (Figure 1F). Si l’alignement se fait sans alignement local, la sortie est « chromagnon.csv », tandis que si l’alignement local est utilisé, la sortie est « chromagnon.tif ». Les noms de fichiers sont les mêmes que le fichier de référence, à l’exception du suffixe spécifié(figure 1J, la valeur par défaut est sans suffixe) et de l’extension (« chromagnon.csv » ou « chromagnon.tif »). Une description détaillée du processus d’alignement peut être trouvée dans le fichier « chromagnon.log » créé dans le même dossier.
  8. Attendez que l’image corrigée apparaît dans le spectateur (Figure 3).
    REMARQUE : Glisser l’image avec la souris déplace l’image et déplacer la roue de la souris change le zoom. Déplacez la section curseur (Figure 3A) pour modifier la section Z (et/ou T, le cas échéant), pour l’affichage. Si la visionneuse est trop lente pour actualiser une image, cliquez sur le bouton Charger des données entières dans la mémoire ( Figure3B) pour l’empêcher d’accéder aux données sur le disque dur. Le fait de faire glisser le bord gauche ou droit des boîtes de couleur (Figure 3C) peut contrôler les valeurs minimales ou maximales pour l’affichage. En cliquant sur le bouton de chaque canal (Figure 3D) bascule entre l’affichage ou la dissimulation du canal sélectionné dans le spectateur. En cliquant avec le bouton droit sur la zone de couleur (Figure 3D) permet aux utilisateurs de choisir les couleurs pour l’affichage, ou de modifier les options d’affichage de la barre de couleur, et il permet également aux utilisateurs de spécifier les valeurs minimales et maximales exactes pour la mise à l’échelle de l’affichage en choisissant « échelle à ... ». En cliquant sur le bouton d’affichage orthogonal (figure 3E) montre les images des vues ZY et XZ. Le déplacement des lignes transversales modifie la position pour qu’elle s’affiche dans les vues latérales.

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Figure 3 : Capture d’écran de la visionneuse d’images. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

  1. Pour vérifier si la mesure a été effectuée correctement, faites glisser et déposer les images de référence dans la case « Référence » et la « zone cible ». Exécutez le programme, et vérifiez si les images sont parfaitement superposées.
    REMARQUE : Lorsqu’ils sont disponibles, les fichiers « chromagnon.csv » ou « chromagnon.tif » peuvent être utilisés comme références afin d’ignorer les mesures. Si le décalage chromatique de l’image n’est pas corrigé, essayez des solutions résumées dans le tableau 2.
  2. Pour accéder aux paramètres d’alignement de l’exemple ou lorsque les paramètres d’alignement doivent être modifiés manuellement, ouvrez les fichiers « chromagnon.csv » directement avec n’importe quel éditeur de texte ou logiciel de feuille de calcul. Lorsqu’il est édité, enregistrez-le sous le titre de « s ».
    NOTE: Les valeurs sont en pixels pour « tz », « ty », « tx », et en degrés pour « r », et dans les facteurs de grossissement pour « mz », « mon », et « mx ».
    1. Sinon, chargez un fichier « chromagnon.csv » ou « chromagnon.tif » dans la case De référence ou cible de Chromagnon(figure 1), puis double-cliquez dessus pour ouvrir l’éditeur d’alignement (figure 4).
    2. Pour voir dans quelle mesure un canal est déplacé lorsque les paramètres sont modifiés, faites glisser et déposer le fichier d’image de référence sur la zone inférieure (Figure 4A) pour ouvrir l’image dans l’éditeur. Lors de l’édition des valeurs du tableau (figure 4B) et en appuyant sur la touche entrée/retour, observez comment l’image du canal correspondant se déplace au fur et à mesure que les valeurs changent. Après modification, cliquez sur Enregistrer sous la figure4Cpour enregistrer les modifications.

figure-protocol-5
Figure 4 : capture d’écran d’un éditeur de paramètres d’alignement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

  1. Pour vérifier la carte d’alignement locale, chargez le « chromagnon.tif » via la case Référence ou Cible de Chromagnon(Figure 1), et double-cliquez dessus pour ouvrir l’éditeur d’alignement (Figure 4). Cliquez sur la vue (Figure 4D) pour afficher le décalage local indiqué par les lignes dont les longueurs sont amplifiées par le facteur spécifié dans la liste de choix de grossissement ( figure4E).
    REMARQUE : En spécifiant le « fichier d’image d’origine » (figure 4F),les décalages sont mappés avec l’image d’origine.

4. Génération d’une carte d’alignement local spécifique au microscope

  1. Diluer 2 μL de perles fluorescentes multicolores de 200 nm de diamètre dans 18 μL d’éthanol.
  2. Vortex la solution et placer 10 μL de la solution de perles au centre d’un plat en verre. Assurez-vous d’utiliser #1,5 verre de couverture (d’une épaisseur de 0,170 mm) pour la microscopie haute résolution.
  3. Laisser le plat à RT pendant 1 h pour sécher complètement.
  4. Placez le plat sur un microscope à calibrer et concentrez-vous sur les perles fluorescentes.
  5. Obtenez des images 2D ou 3D avec la microscopie à calibrer. Obtenez plusieurs images en changeant la position de la scène.
  6. Ouvrez l’interface utilisateur graphique de Chromagnon.
  7. Faites glisser et déposer les fichiers d’image de perles dans la « zone de référence » (figure 1) ou cliquez sur Fichiers de référence ( Figure1A) pour ouvrir une boîte de dialogue sélecteur de fichiers.
  8. Vérifiez l’option références moyennes (Figure 1H). Dans la liste de choix de l’alignement local (Figure 1F), choisissez Projection. Utiliser une fenêtre minimale de 60 (figure 1G). Cliquez sur Exécuter tous les (Figure 1I) pour commencer les mesures.
    REMARQUE : Un fichier « chromagnon.tif » est créé, dans lequel la carte d’alignement locale du microscope est stockée.
  9. Après mesure, cliquez sur Paramètres supplémentaires (Figure 1K). Dans la zone de distorsion locale de votre boîte d’instruments microscope, cliquez sur la liste de choix et choisissez Nouveau... pour ouvrir une boîte de dialogue. Faites glisser et déposer le fichier « chromagnon.tif » généré à l’étape 4.8 dans la zone nom de fichier ou cliquez sur choisir le bouton de fichier pour ouvrir une boîte de dialogue sélecteur de fichiers. Entrez le nom du microscope et cliquez sur OK.
  10. Lorsque vous mesurez les décalages chromatiques des images de référence en crosstalk ou en étalonnage biologique, cliquez sur Paramètres supplémentaires (Figure 1K). Dans la zone de distorsion locale de votre boîte d’instruments de microscope, choisissez le nom du microscope spécifié à l’étape 4.9. Cliquez sur OK.
    REMARQUE : Le choix de la « distorsion locale de votre instrument de microscope » n’est pas enregistré après l’arrêt du programme.
  11. Procéder à la correction chromatique sans alignement local comme à la section 3.
    REMARQUE : Il est également possible d’utiliser l’alignement local en plus de l’étalonnage au microscope. Dans ce cas, l’alignement local commence par l’étalonnage du microscope.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un exemple de correction chromatique de décalage à l’aide d’une image de référence crosstalk est illustré à la figure 5. L’image a été obtenue avec un microscope à large champ équipé d’une seule caméra. L’émission de fluorescence du DAPI a été utilisée comme référence (figure 5A,B)pour corriger les canaux bleu, vert et rouge. L’image comprend 3 canaux de 60 tranches Z, chacun composé de 256 x 256 pixels. Les images ont été déconcerles avant de mesurer les changements chromatiques. La mesure des changements chromatiques locaux à l’aide de Chromagnon a pris 51 s sur un Mac avec Intel Core i7 (quad core, 8 threads, 2,7 GHz), 16 Go de RAM et 1 To de stockage flash. Le paramètre d’alignement a été appliqué àl’imagecible ( Figure 5C,D), qui a exactement le même nombre de voxels que l’image de référence. La préparation du fichier aligné a pris 3 s. En raison de la coupe des pixels de bord pendant le processusd’alignement (case à cocher marges de culture dans la figure 1C),le nombre de voxels a été réduit après alignement (figure 5B, 51 tranches Z, 252 x 251 pixels). L’ADN dans le pont anaphase (indiqué par des pointes de flèche) est vu incorrectement à l’extérieur de l’enveloppe nucléaire avantl’alignement ( figure 5C, évident dans le panneau inférieur montrant la vue XZ), mais comme prévu à l’intérieur de l’enveloppe après alignement (figure 5D).

Un exemple de correction chromatique de décalage à l’aide d’une image de référence d’étalonnage biologique est illustré à la figure 6. Les images ont été obtenues avec un microscope SIM équipé de trois caméras. Trois images de cellules HeLa tachées de phalloïdants conjugués à des colorants bleus, verts et rouges ont été calculées en moyenne (Figure 6A). L’image de référence comprend 3 canaux de 76 tranches de Z, chacun composé de 1 024 x 1 024 pixels. La mesure des changements chromatiques à l’aide de Chromagnon sans alignement local a nécessité 194 s sur le système Mac décrit ci-dessus. Le paramètre a été appliqué à une image cible composée de 3 canaux de 73 tranches Z, chacun composé de 1 024 x 1 024 pixels. La génération du fichier aligné a pris 25 s. La vue XZ montre les positions incorrectes du canal le long du Z, et légèrement le long des directions X (Figure 6A,C) mais cette erreur d’enregistrement a été corrigée après alignement (Figure 6B,D).

figure-results-1
Figure 5 : Exemple d’alignement avec une image de référence crosstalk. Les cellules HeLa ont été tachées avec DAPI pour l’ADN (montré dans magenta), Alexa Fluor 488 (montré en jaune) pour l’enveloppe nucléaire, et Alexa Fluor 555 (montré en bleu) pour les microtubules. Les images ont été acquises par microscopie 3D à large champ avec une seule caméra et déconcelvées. (A,B) Image de référence croisée représentative utilisant l’émission DAPI, avant et après l’alignement par Chromagnon. Trois canaux de couleur sont affichés comme superposés. (C,D) Une section optique de la pile 3D en trois canaux avant et après l’alignement. L’aberration chromatique axiale est évidente au pont anaphase montré par des pointes de flèche. La barre d’échelle du panneau A indique 5 μm pour tous les panneaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 6 : Exemple d’alignement avec une image de référence d’étalonnage biologique Des images ont été acquises avec 3D-SIM équipé de trois caméras. (A,B) Une image de référence en moyenne à partir de trois images avant (A) et après (B) alignement. Les cellules hela ont été tachées de phalloïdin conjugué avec Alexa Fluor 405, 488 ou 594. (C,D) Image cible avant (C) et après (D) alignement. Les cellules HeLa ont été tachées avec DAPI pour l’ADN (montré dans magenta), Alexa Fluor 488 (montré en jaune) pour l’enveloppe nucléaire, et Alexa Fluor 594 (montré en bleu) pour les microtubules. La barre d’échelle du panneau A indique 5 μm pour tous les panneaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La procédure de correction chromatique est un compromis entre l’exactitude et l’effort. Pour économiser les efforts inutiles, il est préférable de savoir combien de précision est nécessaire pour votre étude. La plus grande précision peut ne pas être requise pour l’imagerie conventionnelle à large champ (en direct), et par conséquent, des images de référence de champ lumineux sont souvent suffisantes pour corriger le décalage chromatique. De même, lorsque l’état d’imagerie et l’environnement sont constants, l’utilisation répétée d’un étalonnage biologique permettra de gagner du temps. D’autre part, si un enregistrement très précis est souhaité, des images de référence de haute qualité sont nécessaires. Pour la meilleure performance, les images de référence doivent être obtenues avec des conditions et des timings aussi similaires que possible aux images cibles. Tant que les images de référence et de cible sont obtenues par la même microscopie, une résolution spatiale plus élevée améliorera la précision de correction. Si la déconvolution est disponible pour les images de référence et de cible, l’implémentation de cette méthode avant correction peut améliorer l’exactitude de la correction. En outre, pour la meilleure performance, le théorème d’échantillonnage de l’axe optique (Z) doit être rempli dans le fichier de référence et de cible pour une interpolation sous-pixel précise (étape 2.1.3 du protocole).

Le défaut de corriger le décalage chromatique conduit à des conclusions erronées. En outre, l’utilisation d’un mauvais étalonnage peut même aggraver les changements chromatiques plutôt que de les corriger, et cela doit donc être évité. Nous avons résumé les causes possibles des échecs et leurs solutions communes dans le tableau 2. Pour examiner la cause d’une défaillance, il est d’abord nécessaire de vérifier visuellement si le décalage chromatique de l’image de référence est corrigé avec précision (étape 3.12 du protocole). La plupart des défaillances sont dues à la qualité des images de référence et sont facilement corrigées selon les descriptions du tableau 2. En ce qui concerne la qualité des images de référence, il est important de noter que l’exactitude de l’alignement global diminue si l’ensemble du champ de vision n’est pas rempli de l’échantillon (Figure 7, Tableau 2). Par rapport au bon exemple illustré à la figure 7A, le mauvais exemple illustré à la figure 7B ne contient que trois enveloppes nucléaires dans la région de la gauche supérieure, et Chromagnon n’a pas réussi à aligner une partie de cette image. C’est parce que la méthode d’alignement global de Chromagnon divise le champ de vision en quatre régions (Figure 7C) afin de mesurer les différences de rotation et de grossissement avec une grande précision3. Cette méthode, si elle est correctement exploitée, est un ordre plus précis que d’autres méthodes linéaires telles que la transformation polaire de journal et les méthodes simplex3. Si l’une des quatre régions n’est pas disponible, Chromagnon passera à des méthodes linéaires moins efficaces. Par conséquent, pour la meilleure performance, les exemples présentés à la figure 7B et à la figure 7C ne sont pas souhaitables, et les quatre régions doivent être remplies d’objets. Les utilisateurs peuvent vérifier si une région quadratique du champ de vision n’est pas disponible pour la mesure en regardant le fichier journal (« Chromagnon.log »; voir l’étape 3.10 du protocole). Heureusement, ce problème peut être facilement surmonté en faisant la moyenne de plusieurs images d’étalonnage biologique ou en utilisant l’alignement local pour les images de référence en crosstalk ou bright-field (tableau 2). Contrairement au cas où il n’a pas corrigé les images de référence, il est plus difficile d’identifier l’échec de la correction des images cibles. Étant donné que ces défaillances surviennent en raison de différences dans les formats de fichiers, les conditions d’imagerie, les synchronisations d’imagerie, les méthodes d’imagerie et d’alignement entre les images de référence et les images cibles (tableau 2), les utilisateurs doivent toujours être prudents lorsqu’ils utilisent des images de référence obtenues dans des conditions/timings différents à partir des images cibles. Quelques images d’exemple sont disponibles pour l’essai (https://github.com/macronucleus/Chromagnon) pour obtenir une idée concrète des images de bon et mauvais exemple.

ProblèmeCauseSolution
Échec de la correction de l’image de référenceFaible contrasteAcquérir une image de contraste plus élevé si possible. Si une image de référence de champ lumineux est utilisée, réacquez l’image dans une solution à base d’eau pour obtenir un contraste plus élevé de la cellule. Sinon, essayez d’appliquer la réduction du bruit computationnelle (p. ex. filtrage gaussien). Éteignez l’alignement local, qui est plus sensible au bruit.
Contamination d’images non liéesSupprimez la source des images non reliées dans l’échantillon si possible. Pour les images de référence croisées, vérifiez les spectres d’excitation des colorants utilisés pour les images cibles. Si les colorants sont excités lors de l’acquisition d’une image à crosstalk (p. ex. Alexa Fluor 568 ou 594), considérez d’autres colorants (p. ex. Alexa Fluor 555). Si les poussières sur la puce de la caméra créent une différence évidente de canal, nettoyez la puce de la caméra ou utilisez une méthode de mise à l’air plat computationnelle.
Un point extrêmement lumineux fait par un rayon cosmiqueAcquérir l’image à nouveau si possible. Sinon, essayez d’appliquer la réduction du bruit computationnelle (p. ex. filtrage médian ou gaussien).
Artefacts de déconvolution (signaux artificiels sur les bords axials et latéraux)Coupez les pixels de bord ou les sections Z après la déconvolution. Si un côté est coupé, l’autre côté doit également être coupé pour maintenir le centre d’image.
La taille de l’étape Z trop clairseméeUne pile Z doit être acquise pour satisfaire au critère nyquiste tel qu’il est écrit dans le protocole 2.1.3.
Aberration optiqueL’aberration sphérique est l’aberration majeure causée par les utilisateurs. Choisissez la lentille objective de l’échantillon et utilisez une épaisseur de 170 μm. Si la lentille objective est équipée d’un anneau de correction, réglez-le pour trouver la position où le plus grand nombre de fluorescence est obtenu à partir de la mise au point. Dans le cas d’un objectif d’immersion d’huile sans anneau de correction, ajuster l’indice de réfraction de l’huile d’immersion qui augmente le nombre de fluorescence au point.
Le champ de vision n’est pas rempli (fig. 7)Dans le cas des images de référence d’étalonnage biologique, la moyenne de nombreuses images. Dans le cas d’images de référence en crosstalk ou en champ lumineux, utilisez l’alignement local.
Un bug logiciel non identifiéSignaler le problème par GitHub (https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues)
Échec de la correction de l’image cibleLes métadonnées du fichier image sont perduesUtilisez le format de fichier microscope d’origine qui contient des métadonnées complètes et évitez de les convertir en un fichier tiff multipage avant le traitement. Utilisez la même commande de canaux que celle écrite dans le protocole 3.3.
Méthodes d’alignement erronées pour la microscopie donnéeN’appliquez pas la méthode d’alignement locale lors de la mesure des images de référence d’étalonnage biologique aux images cibles. N’utilisez pas d’images de référence croisées autres que la microscopie à large champ.
Différences dans les conditions d’imagerieMaintenez les conditions d’imagerie constantes entre la référence et les images cibles telles qu’écrites dans le protocole 2.3.3.
Différences dans l’échantillon (y compris le couvercle)Utilisez toujours le même support de montage, le couvercle (p. ex. no 1.5H) et une profondeur de mise au point similaire.
Dérive de microscope depuis que l’étalonnage a été fait pour la dernière foisFaire un étalonnage aussi souvent que toutes les deux semaines. Maintenez la température constante et utilisez une table flottante pour éviter la dérive matérielle du microscope.

Tableau 2 : Dépannage pour correction chromatique.

figure-discussion-1
Figure 7 : Exemples d’images de référence. Enveloppe nucléaire dans les cellules de levure de fission étiquetées avec GFP et mCherry. Les images ont été acquises avec la microscopie conventionnelle de large champ. Les décalages chromatiques ont été corrigés à l’aide de Chromagnon sans alignement local en utilisant les images elles-mêmes comme images de référence. Les images ont ensuite été déconcertantes pour montrer les détails. (A) Un bon exemple avec de nombreux objets dans le champ de vision. (B) Un mauvais exemple avec des objets seulement dans le coin supérieur gauche. Le désalignement est évident dans une certaine région de l’image. (C) Un exemple indésirable où l’une des quadrisection (séparée par des lignes transversales pointillées) est vide. La barre d’échelle du panneau A indique 5 μm pour la vue sur le terrain complète et 1,25 μm pour la vue agrandie et s’applique à tous les panneaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Dans ce protocole, nous avons décrit trois types de référence différents (tableau 1). Parmi eux, les images de référence croisées et les images de référence d’étalonnage biologique nécessitent une discussion plus approfondie. Pour les images de référence croisées, les échantillons tachés de DAPI ou de Hoechst 33342, et montés dans des supports de montage de glycérol ou commerciaux peuvent être utilisés efficacement pour aligner les canaux bleus, verts et rouges. De même, Alexa Fluor 488 peut être utilisé pour aligner les canaux verts et rouges. Cependant, l’obtention de fluorescence de crosstalk est souvent difficile puisque beaucoup de colorants bleus excepté DAPI et Hoechst sont plus faibles et se désintègrent plus rapidement que la plupart des colorants verts et rouges. En outre, les spectres d’émission des colorants modernes sont plus étroits, ce qui rend l’alignement de plus de trois canaux par cette méthode difficile. Il convient également d’accorder une attention particulière à certains colorants rouges courants (p. ex., Alexa Flour 568 et 594, mais pas Alexa Fluor 555) qui peuvent être excités par la lumière violette, qui empêchent d’obtenir des images à haute contraste à partir de colorants bleus. Un autre inconvénient est que cette méthode ne peut pas mesurer l’aberration chromatique des chemins lumineux d’excitation dans l’excitation multicolore, parce qu’une seule longueur d’onde d’excitation est utilisée pour l’excitation (Tableau 1). Comme la plupart des microscopies avancées utilisent des optiques d’éclairage modifiées, l’application de cette méthode est limitée. Néanmoins, sa précision de correction plus élevée est suffisamment avantageuse pour qu’elle soit décrite dans ce protocole. En général, une image crosstalk doit être prise après une image cible pour prévenir le blanchiment ou les effets phototoxiques. Pour smlm observé avec le mode large-champ, une image de référence devrait être acquise avant d’acquérir une image cible car les colorants de fluorescence peuvent être blanchis pendant l’imagerie.

Les images de référence d’étalonnage biologique permettent aux utilisateurs d’aligner facilement le nombre souhaité de canaux au coût de la préparation supplémentaire de l’échantillon. Un autre avantage des images de référence d’étalonnage biologique est la disponibilité de références multiples « moyennes » qui aident à remplir tous les champs de vue. Cette méthode peut souffrir de différences dans les conditions d’imagerie si l’échantillon d’étalonnage est préparé sur une diapositive différente. La plupart de ce problème peut être résolu si les cibles et les références sont préparées sur la même diapositive à l’aide de verres à couverture chambrés commerciaux(tableau 1),et d’autres conditions d’imagerie sont maintenues constantes comme à l’étape 2.3.3. Dans ce cas, on peut s’attendre à une précision de correction similaire à celle des images de référence crosstalk3. Le protocole pour utiliser la phalloïdine comme indiqué ici est l’un des moyens les plus faciles de tacher une structure cellulaire unique avec plusieurs couleurs. Il existe de nombreux scénarios possibles pour préparer des échantillons d’étalonnage biologique. Pour l’immunostaining, un échantillon peut être étiqueté avec un seul anticorps primaire suivi de la coloration avec des anticorps secondaires de plusieurs couleurs. De cette façon, une structure cible unique peut être étiquetée avec plusieurs couleurs. Alternativement, 5-éthylyl-2'-désoxyuridine, détecté par « clic » étiquettes de chimie nouvellement synthétisé l’ADN dans plusieurs couleurs à haute densité, comme décrit en détail précédemment8. Pour les cellules vivantes, il est utile de préparer une souche transgénique abritant deux copies d’un gène qui sont fusionnées à GFP ou mCherry pour étiqueter la même structure avec deux couleurs. Si le numéro de copie du gène est critique comme souvent observé pour les protéines membranaires, une seule copie du gène peut être fusionnée en tandem à GFP et mCherry (Figure 7). Les protéines fluorescentes photoconvertibles, telles que le mEOS218,peuvent également être utilisées en illuminant un niveau modéré de lumière violette pour obtenir les deux espèces protéiques avec ou sans photoconversion. Dans des conditions de faible teneur en oxygène, GFP peut également être utilisé comme une protéine photoconvertible du vert au rouge19,20. Le choix du bon échantillon d’étalonnage rendra ainsi l’expérience plus robuste.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a été soutenue par JSPS KAKENHI Grant Numbers JP19H03202 à A.M., JP18H05528 et JP17H03636 à T.H., et JP17H01444 et JP18H05533 à H.Y. L.S. reconnaît le soutien des Welcome Trust Strategic Awards 091911 et 107457/Z/15/Z finance l’imagerie avancée chez Micron Oxford.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Solution de formaldéhyde à 16 %Polyscience18814-10
Plat à fond en verre de 35 mmMatTekP35G-1.5-10-C
Alexa Fluor 405 phalloïdineThermo Fisher ScientificA30104
Alexa Fluor 488 phalloïdineThermo Fisher ScientificA12379
Alexa Fluor 594 phalloïdineThermo Fisher ScientificA12381
Sérum bovinThermo Fisher Scientific16170078
Coverslip MatsunamiNo. 1S HT
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phénylindole, Dihydrochlorhydrate)Thermo Fisher ScientificD1306
Dulbecco' s Milieu Eagle modifié avec L-Gln et pyruvate de sodiumNacalai Tesque08458-16
Milieu de montage (VECTASHIELD)Vector LaboratoriesH-1000
Anticorps monoclonal anti-tubuline de souris (TAT1)Décrit dans la réf 15.
Verre de protection chambré Nunc Lab-Tek II (8 puits)Thermo Fisher Scientific155409
Anticorps polyclonal anti-émérine de lapin (ED1)Un don de Hiroshi Yorifuji, Université de Gunma, Gunma, Japon et de Kiichi Arahata, Centre national de neurologie et de psychiatrie, Tokyo, Japon ; décédé.
Anticorps secondaire avec Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11034
Anticorps secondaire avec Alexa Fluor 555Thermo Fisher ScientificA-21424
Anticorps secondaire avec Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-11032
Microsphères TetraSpeck, 0,2 & micro ; mThermo Fisher ScientificT7280

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Correction du d calage chromatiqueD calages chromatiques 3DLogiciel ChromagnonMicroscopie de fluorescenceImagerie super r solutionPr paration d chantillons biologiquesAcquisition d images de r f renceMicroscopie champ largeMicroscopie SIM 3DProtocole de marquage aux anticorps

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