Utilisation d'un analyseur de flux extracellulaire pour mesurer les changements dans la glycolyse et la phosphorylation oxydative pendant la capacitation de sperme de souris

Résumé

Nous décrivons l'application d'un analyseur extracellulaire de flux pour surveiller des changements en temps réel dans la glycolyse et la phosphorylation oxydative pendant la capacitation de sperme de souris.

Résumé

Le sperme de mammifères acquiert la capacité de fertilisation dans l'appareil reproducteur femelle dans un processus connu sous le nom de capacitation. Les processus associés à la capacitation nécessitent de l'énergie. Il reste un débat continu au sujet des sources générant l'ATP qui alimente la motilité progressive de sperme, la capacitation, l'hyperactivation, et la réaction acrosome. Ici, nous décrivons l'application d'un analyseur extracellulaire de flux comme outil pour analyser des changements dans le métabolisme énergétique pendant la capacitation de sperme de souris. À l'aide de h^-et O₂- fluorophores sensibles, cette méthode permet de surveiller la glycolyse et la phosphorylation oxydative en temps réel chez les spermatozoïdes non capacitated versus capacitating. L'utilisation de cet analyse en présence de différents substrats énergétiques et/ou d'activateurs pharmacologiques et/ou d'inhibiteurs peut fournir des informations importantes sur la contribution de différentes voies métaboliques et l'intersection entre les cascades de signalisation et le métabolisme pendant la capacitation des spermatozoïdes.

Introduction

L'application de la spectrométrie de masse a révolutionné l'étude du métabolisme. Le profilage métabolique ciblé et le traçage métabolomique permettent une surveillance précise des changements dans le métabolisme énergétique. Cependant, l'exécution de la métabolomique nécessite une formation approfondie, un personnel expérimenté et des spectromètres de masse coûteux et très sensibles qui ne sont pas facilement accessibles à tous les laboratoires. Ces dernières années, l'utilisation d'un analyseur de flux extracellulaire, comme l'hippocampe XFe96 est devenu populaire comme une méthode de substitution pour mesurer les changements dans le métabolisme énergétique dans div....

Protocole

Le sperme est recueilli à partir de souris mâles CD-1 de 8-16 semaines. Les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de Weill Cornell Medicine.

1. Jour avant l'assay

1. Préparation de la cartouche de capteur et de l'analyseur de flux extracellulaire calibrant
   1. Pour hydrater la cartouche du capteur, retirez la cartouche du capteur du kit d'assiduité extracellulaire XFe96 et placez la cartouche du capteur à l'envers à côté de la plaque d'utilité.
   2. Remplir un réservoir de solution avec 25 ml de H₂O à double di....

Résultats

Cette méthode utilise un analyseur de flux extracellulaire pour surveiller les changements en temps réel dans le taux de glycolyse et d'oxphos pendant la capacitation de sperme de souris. La figure 4 montre une expérience exemplaire où les spermatozoïdes ont été concités en présence de glucose comme seul substrat énergétique et 2-DG et antimycine et rotenone comme modulateurs pharmacologiques. Le substrat d'énergie dans le tampon d'analyseur de flux extracell.......

Discussion

La perte de la capacitation de sperme en l'absence de certains substrats métaboliques ou enzymes métaboliques critiques a indiqué le métabolisme d'énergie comme facteur clé soutenant la fertilisation réussie. Un commutateur métabolique pendant l'activation cellulaire est un concept bien établi dans d'autres types de cellules, cependant, nous commençons juste à comprendre comment les spermatozoïdes adaptent leur métabolisme à la demande croissante d'énergie pendant la capacitation. À l'aide d'un analyseur de flux extracel.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
s forts
2-Deoxy-D-glucose	Sigma-Aldrich	D8375	2-DG
3-Isobutyl-1-méthylxanthine	Sigma-Aldrich	I7018	IBMX ; préparer une solution mère de 500 mM dans du DMSO (111,1 mg/ml) et stocker dans de petites aliquotes
Antimycine A	Sigma-Aldrich	A8674	Anta; préparer une solution mère de 5 mM dans du DMSO (2,7 mg/ml) et stocker dans de petites aliquotes Albumine
sérique bovine	Sigma-Aldrich	A1470
BSA Chlorure	de calcium Sigma-Aldrich	C1016	CaCl2
Concanacaline A, Lectine d’Arachis hypogaea (arachide)	Sigma-Aldrich	L7381	ConA
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
Hepes	Sigma-Aldrich	H0887
Isothesia	Henry Schein Santé animale	1169567761	Isoflurane
Sulfate	de magnésium Sigma-Aldrich	M2643	MgSO4
N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclique monophosphate sodium	sel Sigma-Aldrich	D0627	db-cAMP
Chlorure de potassium	Sigma-Aldrich	P9333	KCl
Dihydrogénophosphate de potassium	Sigma-Aldrich	P5655	KH2PO4
Rotenone	Cayman Chemical Company	13995	Pourriture ; préparer une solution mère de 5 mM dans du DMSO (2mg/ml) et stocker dans de petites aliquotes
Bicarbonate de sodium	Sigma-Aldrich	S5761	NaHCO3-Chlorure
sodium	Sigma-Aldrich	S9888	NaCl
Equipment et matériaux
Pipette 12 canaux 10-100 &mu ; L	eppendorf	ES-12-100
Pipette 12 canaux 50-300 &mu ; L	vwr	613-5257
37 ° ; C, non-CO2 incubateur	vwr	1545
5 mL tubes de	eppendorf	30119380
50 mL tubes de centrifugation	coniques vwr	76211-286
Centrifugeuse avec adaptateur de plaque	Thermo Scientific	IEC FL40R
Kit de dissection	World Precision Instruments	MOUSEKIT
Microscope à contraste de phase inversé avec objectif 40X	Nikon
OctaPool, 25 ml, divisé	Thomas Scientific	1159X93
Réservoirs de solution OctaPool, 25 mL, divisé	Thomas Scientific	1159X95
Seahorse XFe96 Analyseur	Agilent
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102416-100	Également vendu sous le nom de XFe96 FluxPak mini (102601-100) avec 6 cartouches au lieu de 18.

de centrifugation Réservoirs de solution