Nous présentons un modèle murin d’induction de mort de cerveau afin d’évaluer l’influence de ses effets pathophysiologiques sur des organes aussi bien que sur des greffes consécutives dans le contexte de la transplantation d’organe solide.
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Article de méthode
Induction de mort cérébrale chez les souris utilisant la surveillance et la ventilation intra-artérielles de tension artérielle par trachéostomie
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Bien que le don vivant et le don après la mort circulatoire offrent d’autres possibilités de transplantation d’organes, le don après la mort cérébrale du donneur (BD) représente toujours la principale source de transplantations solides. Malheureusement, la perte irréversible de la fonction cérébrale est connue pour induire de multiples changements pathophysiologiques, y compris les modifications hémodynamiques ainsi que hormonales, conduisant finalement à une réponse inflammatoire systémique. Les modèles qui permettent une étude systématique de ces effets in vivo sont rares. Nous présentons un modèle murin d’induction de BD, qui pourrait aider à enquêter sur les effets dévastateurs de BD sur la qualité d’allogreffe. Après la mise en œuvre de la mesure de la pression artérielle intra-artérielle par l’intermédiaire de l’artère carotide commune et de la ventilation fiable par l’intermédiaire d’une trachéotomie, BD est induite par une augmentation constante de la pression intracrânienne à l’aide d’un cathéter ballon. Quatre heures après l’induction de BD, les organes peuvent être récoltés pour l’analyse ou pour d’autres procédures de transplantation. Notre stratégie permet l’analyse complète de la BD du donneur dans un modèle murin, permettant ainsi une compréhension approfondie des effets liés à la BD dans la transplantation d’organes solides et ouvrant potentiellement la voie à un préconditionnement optimisé des organes.
Introduction
La transplantation est actuellement le seul traitement curatif pour l’échec d’organe de phase finale. Jusqu’à présent, les patients atteints de décès du cerveau (BD) ont été la principale source de dons d’organes, bien que le don et le don vivant après la mort circulatoire soient des alternatives précieuses1. BD est défini par un coma irréversible (avec une cause connue), l’absence de réflexes de tige de cerveau et l’apnée2. Malheureusement, les organes de BD démontrent des résultats inférieurs dans la survie à long terme de greffe indépendamment de l’antigène leucocyte humain (HLA)-décalage et temps ischémique froid3. Pendant ce temps, des recherches intensives sur ce facteur de risque antigène-indépendant ont été effectuées ayant pour résultat trois aspects principaux des changements pathophysiologiques négociés à la suite de BD: hémodynamique, hormonale, et inflammatoire4.
À ce jour, des modèles expérimentaux de BD chez les rongeurs ont été principalement exécutés à l’aide de rats. Afin d’obtenir une meilleure compréhension des conséquences immunologiques sur les organes solides suivant BD, nous avons cherché à établir un modèle murin de BD, car actuellement seuls les modèles de souris permettent des études complètes sur les facteurs génétiques ou immunologiques. Dans ce contexte, le système de souris fournit une plus grande variété d’outils analytiques.
Le principe de l’induction BD tel que décrit ici est basé sur une augmentation de la pression intracrânienne induite par l’inflation d’un cathéter ballon inséré sous le crâne. Une pression intracrânienne accrue imite le mécanisme physiologique de la BD en bloquant la perfusion du crérebrum, du cervelet et du tronc cérébral5,,6. Pour garantir une perfusion suffisante des organes périphériques, la mesure de la pression artérielle est obligatoire pendant la procédure. Le cathéter utilisé à cette fin sert en même temps à l’administration saline afin de stabiliser la pression artérielle par substitution de liquide. Comme BD est accompagné d’arrêt de la respiration spontanée, une ventilation suffisante doit être assurée. Une couverture électrique maintient la température corporelle physiologique du noyau.
En résumé, ce modèle permettra des études approfondies sur l’influence des dommages induits par le BD, sur la migration de leucocyte7, l’activation de compliment8, la blessure de réperfusion ischémique9, et d’autres facteurs.
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Protocole
Des expériences sur les animaux ont été réalisées conformément aux Principes de soins aux animaux de laboratoire formulés par la National Society for Medical Research et le Guide for the Care and Use of Laboratory Animals préparés par l’Académie nationale des sciences et publiés par les National Institutes of Health (NiH Publication no 86-23, révisé en 1985). Toutes les expériences ont été approuvées par le Ministère autrichien de l’éducation, de la science et de la culture (BMWF-66.011/0071-II/3b/2012).
1. Cathétérisme artérielle
- Anesthésiez la souris avec une injection intraperitonéale de kétamine et de xylazine10 et un analgésique selon la pratique locale (par exemple la buprénorphine). Pincer les membres postérieurs avec des forceps pour confirmer la profondeur correcte de l’anesthésie.
REMARQUE : Pour cette étude, des souris mâles de C57BL/6N à l’âge de 8 à 12 semaines ont été employées (poids 20-25 g). Les auteurs ont testé le MÂLE BALB/c du même âge sans succès, mais n’ont pas essayé d’autres souches (voir Discussion). - Retirer les cheveux dans les régions d’intérêt (tête, cou) à l’aide d’un rasoir électrique. Assurez-vous qu’il n’y a plus de cheveux lâches pour prévenir la contamination des plaies. Par la suite désinfecter le champ chirurgical avec 70% d’éthanol/chlorhexidine/ bêtadine et placer la souris supine avec la tête face au chirurgien.
- Faire une incision cervicale de milieu de ligne avec des ciseaux disséquants.
- Disséquez les glandes sous-consommées et le tissu musculaire du cou et séparez-les afin d’exposer l’artère carotide commune. Utilisez surtout la dissection émoussée par le forceps.
- Placez trois 8-0 ligatures de soie sous l’artère carotide commune droite.
- Placez une pince sur la ligature proximal et apportez la tension dans l’artère de sorte que le flux est suspendu.
- Fermez la ligature la plus distale.
- Insérez le cathéter artériel à travers un petit trou de peau préformé sur l’aspect crânien de l’incision. Presser et déformer le lumen du cathéter s’il semble trop grand pour réduire le flux sanguin. Fixez avec les trois ligatures.
- Fixer le cathéter à la peau pour éviter la dislocation. Faites-le en utilisant une suture (p. ex. 5-0 monofilament, non absorbable) qui relie le cathéter à la peau dans la zone du trou de peau préformé.
2. Trachéostomie
- Disséquez la musculature pré-trachéale à l’aide de forceps.
- Place deux 8-0 ligatures de soie sous la trachée.
- Trachéotomiser à l’aide de micro ciseaux aussi proximally que possible pour éviter une ventilation unilatérale. Utilisez une ligne de coupe horizontale entre deux cartilages trachéaux.
- Insérez le tube de ventilation et fixez-les avec les deux ligatures préparées.
REMARQUE : L’extrémité proximale de la trachée n’a pas besoin d’être ligate. - Fermez la peau avec une suture en cours d’exécution (p. ex., 6-0 monofilament, non absorbable).
- Ventiler la souris avec une fréquence de 150/min et un volume de marée de 200 ll.
3. Induction de mort cérébrale
- Disposer la souris à la position encline.
- Retirez la peau du crâne à l’aide de ciseaux chirurgicaux et de forceps pour tenir la peau.
- Percer un trou de forage de calibre 1 mm paramédicalement au-dessus du cortex pariétal gauche. Arrêtez de forer avant de percer l’os compact intérieur et le mater dura.
- Pénétrer le pont de tissu final du crâne à l’aide de forceps émoussés, en enlevant les bords tranchants.
- Insérez le cathéter de ballon, de sorte qu’il soit entièrement dans la cavité crânienne. Assurez-vous que le ballon est préremmité avec saline et tout l’air est évacué.
- Commencer l’inflation à 0,1 mL/min sur une période de 10 à 15 min (volume total de 0,8 à 1,2 ml) à l’aide d’une pompe à seringue.
REMARQUE : La souris exposera le myoclonus, la mydriasis, l’activité de saisie et les halètements agonals. - Prononcez le cerveau de la souris mort une fois que la queue de la souris est devenue raide et érigée.
REMARQUE : BD est confirmé par un pic de tension artérielle initial caractéristique (réflexe de crachage), l’absence de réflexes de tige de cerveau et de respiration spontanée. Les tests réguliers d’apnée doivent être évités pendant les expériences, car les souris peuvent devenir instables circulatoires en raison d’un manque d’oxygène. - Arrêtez l’inflation du cathéter ballon.
- Placez une couverture chauffante sur la souris pour éviter l’hypothermie.
4. Pendant la période BD
- Surveillez et documentez régulièrement la tension artérielle. Exclure les souris avec une phase hypotensive prolongée (pression artérielle moyenne [MAP] 'lt; 50 mmHg pour 'gt;30 min).
- Infuser 0,1 mL de saline toutes les 30 minutes pour stabiliser la pression artérielle de la souris.
REMARQUE : Au total, 0,8 ml de saline a été administrée à chaque souris dans cette étude. - Après 4 h de durée BD, récoltez des organes/tissus de souris. Exclure la souris de l’expérience si le cœur de la souris ne bat pas à la fin de l’expérience.
5. Procédure Sham
- Effectuer les étapes 1.1-3.3.
REMARQUE : N’ouvrez pas l’os compact intérieur. N’insérez pas ou ne gonflez pas un cathéter ballon. - Restez près de la souris et observez continuellement l’animal. Pincer à plusieurs reprises les membres postérieurs avec des forceps pour confirmer la profondeur correcte de l’anesthésie. Appliquer une anesthésie supplémentaire sous-cutanée (environ 1/2 de la dose de départ) si la souris montre des signes d’éveil, qui, selon notre expérience, se produit environ après 2-3 h post-anesthésie.
- Appliquer la même quantité de saline intraveineuse que chez les souris BD.
REMARQUE : La fausse souris retrouvera la respiration spontanée après l’arrêt de la ventilation. La souris BD ne le fera pas. Les tests d’apnée doivent être effectués lors de l’établissement du modèle, mais pendant les expériences, il doit être évité en raison d’un stress physiologique inutile.
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Résultats
Le modèle murine BD a été réalisé avec succès plus de 100 fois avec un taux de réussite de plus de 90%. En outre, la transplantation d’organes post-interventionnels du cœur et du rein a été exécutée en toute sécurité7.
BD induit une variété de changements pathophysiologiques qui peuvent être étudiés plus en plus loin en utilisant ce modèle. Comme le montre la figure 1, la pre...
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Discussion
BD, un facteur de risque pour la qualité d’allogreffe chez les donneurs multi-organes, implique une pléthore de changements pathophysiologiques, qui ne peuvent être suffisamment évalués qu’à l’aide de modèles in vivo. Les changements hémodynamiques, la tempête de cytokine, les changements hormonaux et leur impact ultime sur la qualité et la survie de greffe d’organe ne peuvent pas être analysés in vitro4. La majorité de la transplantation de base ainsi que la recherche immunologique dépend des out...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Cathéter artériel (BD Neoflon 26G) | Transducteurs | BD 391349 | |
| (APT300) | Harvard Apparatus Inc. | 73-3862 | |
| Cathéter d’embolectomie artérielle Fogarty N° ; 3 | Edwards Lifesciences Corporation | 120403F | |
| Forceps | FST | 11271-30 | |
| Systèmes de couverture homéothermique avec sonde flexible | Harvard Apparatus Inc. | 55-7020 | |
| Ketansol | Graeub | 6680110 | |
| Micro ciseaux | FST | 15018-10 | |
| Porte-aiguille | FST | 12060-02 | |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8698H | |
| Pompe 11 Elite Infusion uniquement Appareil | Harvard Inc. | 70-4500 | |
| Ciseaux | FST | 14075-11 | |
| Microscope stéréotaxique | Olympus | SZX7 | |
| Transpore Tape | 3M | 1527-1 | |
| Underpads | Molinea.A | 274301 | |
| Ventilateur pour souris (MiniVent Model 845) | Harvard Apparatus Inc. | 73-0043 | |
| Xylasol | Graeub | 7630109 |
Références
- Hart, A., et al. OPTN/SRTR 2017 Annual Data Report: Kidney. American Journal of Transplantation. 19 (Suppl 2), 19(2019).
- The Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology. Practice parameters for determining brain death in adults (summary statement). Neurology. 45 (5), 1012-1014 (1995).
- Terasaki, P. I., Cecka, J. M., Gjertson, D. W., Takemoto, S. High survival rates of kidney transplants from spousal and living unrelated donors. New England Journal Medicine. 333 (6), 333-336 (1995).
- Pratschke, J., Neuhaus, P., Tullius, S. G. What can be learned from brain-death models? Transplant International. 18 (1), 15-21 (2005).
- Wilhelm, M. J., et al. Activation of the heart by donor brain death accelerates acute rejection after transplantation. Circulation. 102 (19), 2426-2433 (2000).
- Pomper, G., et al. Introducing a mouse model of brain death. Journal of Neuroscience Methods. 192 (1), 70-74 (2010).
- Ritschl, P. V., et al. Donor brain death leads to differential immune activation in solid organs but does not accelerate ischaemia-reperfusion injury. Journal of Pathology. 239 (1), 84-96 (2016).
- Atkinson, C., et al. Donor brain death exacerbates complement-dependent ischemia/reperfusion injury in transplanted hearts. Circulation. 127 (12), 1290-1299 (2013).
- Oberhuber, R., et al. Treatment with tetrahydrobiopterin overcomes brain death-associated injury in a murine model of pancreas transplantation. American Journal of Transplantation. 15 (11), 2865-2876 (2015).
- Floerchinger, B., et al. Inflammatory immune responses in a reproducible mouse brain death model. Transplant Immunology. 27 (1), 25-29 (2012).
- Steen, P. A., Milde, J. H., Michenfelder, J. D. No barbiturate protection in a dog model of complete cerebral ischemia. Annals of Neurology. 5 (4), 343-349 (1979).
- Cooper, D. K., Novitzky, D., Wicomb, W. N. The pathophysiological effects of brain death on potential donor organs, with particular reference to the heart. Annals of the Royal College of Surgeons of England. 71 (4), 261-266 (1989).
- Herijgers, P., Leunens, V., Tjandra-Maga, T. B., Mubagwa, K., Flameng, W. Changes in organ perfusion after brain death in the rat and its relation to circulating catecholamines. Transplantation. 62 (3), 330-335 (1996).
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Réimpressions et autorisations
