Article de méthode

Comité de LC-MS/MS validé pour quantifier 11 médicaments antituberculeux pharmacorésistants dans de petits échantillons de cheveux

DOI :

10.3791/60861

⸱

19 mai 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Sciences, TB Hair Analysis Laboratory, University of California San Francisco, 2Department of Epidemiology and Biostatistics, University of California San Francisco, 3Department of Medicine, Division of HIV, Infectious Diseases, and Global Medicine, University of California San Francisco, 4Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, University of California San Francisco

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les méthodes actuelles d’analyse de l’adhésion des patients aux régimes complexes de pharmacorésistants-tbsi (DR-TB) peuvent être inexactes et à forte intensité de ressources. Notre méthode analyse les cheveux, une matrice facilement recueillie et stockée, pour des concentrations de 11 médicaments CONTRE la tuberculose DR. À l’aide de LC-MS/MS, nous pouvons déterminer les niveaux de médicaments sous-nanogrammes qui peuvent être utilisés pour mieux comprendre l’observance des médicaments.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La tuberculose pharmacorésistante (TBD) est une menace croissante pour la santé publique, et l’évaluation des niveaux de médicaments thérapeutiques peut avoir d’importants avantages cliniques. Les niveaux de médicaments plasmatiques sont l’évaluation actuelle de l’étalon-or, mais nécessitent une phlébotomie et une chaîne de froid, et ne capturent que l’adhérence très récente. Notre méthode utilise les cheveux, une matrice qui est facilement recueillie et réfléchissant à l’adhérence à long terme, pour tester 11 médicaments antituberculeux. Des travaux antérieurs de notre groupe montrent que les niveaux de médicaments antirétroviraux chez les cheveux sont associés aux résultats du VIH. Notre méthode pour les médicaments DR-TB utilise 2 mg de cheveux (3 cm proximal à la racine), qui est pulvérisé et extrait dans le méthanol. Les échantillons sont analysés à l’attention d’une seule méthode LC-MS/MS, quantifiant 11 médicaments dans une course de 16 minutes. Les limites inférieures de quantification (LLOQ) pour les 11 médicaments varient de 0,01 ng/mg à 1 ng/mg. La présence de médicaments est confirmée en comparant les ratios de deux transitions de spectrométrie de masse. Les échantillons sont quantifiés à l’aide du rapport de zone du médicament par rapport à l’isotopologue de drogue détérité, 15N ou 13C-étiqueté. Nous avons utilisé une courbe d’étalonnage allant de 0,001-100 ng/mg. L’application de la méthode à un échantillon de commodité d’échantillons de cheveux prélevés sur des patients atteints de DR-TB sur la thérapie directement observée (DOT) a indiqué des niveaux de médicaments dans les cheveux dans la gamme dynamique linéaire de neuf des onze médicaments (isoniazid, pyrazinamide, ethambutol, linezolid, levofloxacin, moxifloxacine, clofazimine, bédaquiline, prétomanid). Aucun patient n’était sur le prothionamide, et les niveaux mesurés pour l’éthionamide étaient proches de son LLOQ (avec d’autres travaux examinant plutôt la pertinence du métabolite d’éthionamide pour surveiller l’exposition). En résumé, nous décrivons le développement d’un panel multi-analyte pour les médicaments DR-TB dans les cheveux comme une technique de surveillance thérapeutique des médicaments pendant le traitement pharmacorésistant de la tuberculose.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Au XXIe siècle, la tuberculose pharmacorésistante (TB-DR) est une catastrophe en évolution pour les programmes nationaux de lutte contre la tuberculose déjà faibles, avec des cas confirmés qui ont doublé au cours des cinq dernières années seulement, représentant près d’un tiers de tous les décès liés à la résistance aux antimicrobiens dans le monde1,2. Le traitement réussi de la TUBERCULOSE DR a traditionnellement exigé des régimes de deuxième intention plus longs et plus toxiques que le traitement de la tuberculose sensible à la drogue. En outre, les patients atteints de DR-TB ont souvent des défis préexistants importants à l’adhésion, qui a contribué à l’émergence de la résistance initialement3.

Contrairement à l’infection par le VIH où les charges virales peuvent être utilisées pour surveiller le traitement, les critères de substitution de la réponse au traitement dans la tuberculose sont retardés et peu fiables au niveau individuel4. La surveillance de l’observance des patients, un prédicteur important de la concentration et de l’échec du traitement antituberculeux sous-thérapeutiques, est également difficile. L’adhésion auto-déclarée souffre de biais de rappel et le désir de s’il vous plaît fournisseurs5,6. Le nombre de pilules et les systèmes de surveillance des événements médicamenteux (MEMS) peuvent être plusobjectifs 7, mais ne mesurent pas la consommation réelle de drogues8,9,10. Les niveaux de médicaments dans les biomatrices peuvent fournir des données d’observance et pharmacocinétiques. Par conséquent, les niveaux de médicaments plasmatiques sont couramment utilisés dans la surveillance des médicaments thérapeutiques11,12. Dans le contexte de la surveillance de l’adhérence des médicaments, cependant, les niveaux de plasma représentent une exposition à court terme et sont limités par une variabilité intra- et interpériabilité importante des patients lorsqu’ils déterminent la plage de référence appropriée de l’observance. Les effets du « manteau blanc », où l’observance s’améliore avant les visites à la clinique ou à l’étude, compliquent encore davantage la capacité des niveaux plasmatiques à fournir des modèles précis d’adhérence des médicaments13.

Hair est un biomatrix alternatif qui peut mesurer l’exposition à long terme de drogue14,15. Beaucoup de médicaments et de métabolites endogènes incorporent dans la matrice de protéine de cheveux de la circulation systémique pendant que les cheveux grandissent. Comme ce processus dynamique continue pendant la croissance des cheveux, la quantité de médicament déposé dans la matrice de cheveux dépend de la présence continue de la drogue en circulation, ce qui rend les cheveux une excellente lecture temporelle de la prise de médicaments. Les cheveux en tant que biomatrix ont l’avantage supplémentaire d’être facilement collectés sans avoir besoin de chaîne de froid pour le stockage et l’expédition par rapport au sang. En outre, les cheveux sont non-biorisqueux, ce qui offre des avantages de faisabilité supplémentaires dans le domaine.

Les niveaux de médicaments capillaires ont longtemps été utilisés dans les applications médico-légales16. Au cours de la dernière décennie, les niveaux d’antirétroviraux capillaires (ARV) ont démontré leur utilité dans l’évaluation de l’observance des médicaments dans le traitement et la prévention du VIH, auxquels notre groupe a contribué. Les niveaux d’ARV dans les cheveux se sont avérés être les plus forts prédicteurs indépendants des résultats de traitement dans l’infection de VIH17,18,19,20,21. Pour déterminer si les niveaux de cheveux des patients atteints de tuberculose DR auront le même utilité à prédire les résultats du traitement, nous avons utilisé la LC-MS/MS pour mettre au point et valider une méthode d’analyse de 11 médicaments antituberculeux dans de petits échantillons de cheveux. Dans le cadre d’une évaluation initiale de la performance de l’analyse, nous avons mesuré les niveaux de médicaments antituberculeux dr dans un échantillon pratique de patients atteints de TUBERCULOSE DR recevant un traitement directement observé (DOT) au Cap-Occidental, Afrique du Sud22.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tous les patients ont fourni un consentement éclairé écrit avant la collecte d’échantillons de cheveux. Nous avons obtenu l’approbation du Conseil d’examen institutionnel de l’Université du Cap et de l’Université de Californie à San Francisco.

1. Échantillonnage des cheveux

  1. Obtenir un consentement éclairé écrit.
  2. Utilisez des ciseaux propres pour couper environ 20-30 mèches de cheveux du cuir chevelu de la région occipitale aussi près du cuir chevelu que possible.
  3. Placer le ruban adhésif autour du côté distal des cheveux pour indiquer la directionnalité. Pliez l’échantillon de cheveux dans un carré de papier d’aluminium et entreposez-le à température ambiante. Étiqueter l’extrémité distale des cheveux pour éviter une contamination possible de la manipulation supplémentaire de l’extrémité proximal.
  4. En plus des échantillons de patients, recueillir des « cheveux blancs » : un échantillon de cheveux du cuir chevelu d’une personne qui n’a pas pris de médicaments contre la tuberculose. Recueillir une grande quantité (30 mg de cheveux blancs pour chaque échantillon de 20 patients).

2. Extraction de médicaments

  1. Étiquetez les tubes de perles. Chaque échantillon de patient nécessite un tube. Étiqueter 12 tubes de "C0" à "C11", un pour chacun des 12 points d’étalonnage. Étiquetez un tube pour un contrôle de qualité faible, un tube pour le contrôle de la qualité moyenne et un tube pour un contrôle de haute qualité. Enfin, étiquetez un tube pour Matrix Blank.
  2. Ouvrez le carré de papier d’aluminium contenant l’échantillon de cheveux. Si l’échantillon de cheveux est plus de 3 cm, couper les cheveux à 3 cm de l’extrémité proximale et utiliser cette partie proximale pour l’analyse.
  3. Peser 2 mg de l’échantillon de cheveux dans un tube de perle.
  4. Peser 2 mg de cheveux blancs dans 16 tubes de perles supplémentaires. Ceux-ci seront utilisés comme points d’étalonnage, contrôles de qualité, et la matrice vide. Les tubes suivront la même procédure d’extraction que les échantillons de patients, en plus d’être augmentés avec des normes de référence des médicaments aux niveaux indiqués dans les étapes 2.8 et 2.9.
  5. Placez tous les tubes de perles dans l’homogénéise. Exécutez l’homogénéiseur à la vitesse 6,95 m/s. Courez pendant deux cycles de 30 s chacun, avec une période de repos de 15 s entre les deux cycles.
  6. Faire un mélange standard interne et l’ajouter aux échantillons.
    1. Ajouter 40 ml de méthanol dans un flacon volumetrique de 50 ml.
    2. Dans les flacons de verre ambre, faire les mélanges des normes internes indiquées dans le tableau 1, en utilisant le méthanol comme solvant.
      REMARQUE : Le méthanol est très volatil. Laisser toutes les fioles plafonnées au cours de ce processus pour prévenir la perte due à l’évaporation.
    3. À partir de ces mélanges, ajoutez le volume indiqué dans le tableau 1 au flacon volumetrique de 50 ml. Ensuite, remplissez le flacon à 50 ml de méthanol.
    4. Capuchon et mélanger le flacon volumetric. Ajouter 500 L du mélange à chacun des tubes pulvérisés, à l’exception du tube blanc de matrice. Ajouter 500 l de méthanol au tube blanc de matrice.
  7. Faites des mélanges standard de référence.
    1. Constituent des normes de référence soignées des médicaments suivants avec du méthanol pour obtenir la concentration indiquée dans le tableau à l’étape 2.7.2. Seulement 1 ml de concentrations suivantes est nécessaire.
    2. Ajoutez 1768 L de méthanol à une fiole, puis ajoutez les quantités de norme de référence énumérées dans le tableau 2 à la même fiole pour obtenir un volume final de 2 ml. Étiquetez cette fiole "Ref Std Mix 1x". Vortex.
    3. Spike 100 L de "Ref Std Mix 1x" en méthanol de 900 ll dans une nouvelle fiole. Étiquetez cette fiole "Ref Std Mix 10x". Vortex.
    4. Spike 100 L de "Ref Std Mix 10x" en méthanol de 900 ll dans une nouvelle fiole. Étiquetez cette fiole "Ref Std Mix 100x". Vortex.
    5. Spike 100 L de "Ref Std Mix 100x" en méthanol de 900 ll dans une nouvelle fiole. Étiquetez cette fiole "Ref Std Mix 1000x". Vortex.
  8. Piquez les tubes courbes d’étalonnage en ajoutant la quantité de Ref Std Mix décrite dans le tableau 3.
  9. Créez des mélanges QC et des tubes de contrôle de la qualité des pointes.
    1. Étiquette 5 flacons "QC-A" par "QC-E".
    2. Ajoutez les quantités suivantes de méthanol aux cinq flacons étiquetés :
      QC-A: 990 l
      QC-B: 940 l
      QC-C: 950 l
      QC-D: 980 l
      QC-E: 950 l
       
    3. À l’aide des stocks de médicaments de 1 mg/mL créés à l’étape 2.7.1, ajoutez 10 l aux flacons spécifiques énumérés ci-dessous. Pour les stocks de BDQ et de CLF, qui sont à 0,5 mg/mL, ajoutez 20 L aux flacons énumérés ci-dessous.
      QC-A: PTH
      QC-B: EMB, CLF, BDQ, PTM
      QC-C: INH, LFX, LZD, MFX, PZA
      QC-D: PTH, EMB
      QC-E: CLF, BDQ, PTM

      REMARQUE : Certains médicaments sont présents dans plusieurs mélanges.
    4. Étiquetez une fiole comme «QC-A df100». Diluer 10 l de QC-A en méthanol de 990 L.
    5. Étiquetez une fiole comme « faible stock de QC ». Ajouter le méthanol de 1832 L à cette fiole. Ajouter les quantités de mélanges QC détaillées ci-dessous:
      QC-A df100: 80 l
      QC-B: 8 l
      QC-C: 80 l
       
    6. Étiquetez une fiole comme « stock mid QC ». Ajouter du méthanol de 760 L à cette fiole. Ajouter les quantités de mélanges QC détaillées ci-dessous:
      QC-A df100: 800 l
      QC-B: 40 l
      QC-C: 400 l
       
    7. Étiquetez une fiole comme « stock de Haute-CQ ». Ajouter 1376 lil de méthanol à cette fiole. Ajouter les quantités de mélanges QC détaillées ci-dessous:
      QC-D: 160 l
      QC-E: 320 l
      MFX, 1mg/mL stock: 16 'L
      INH, 1mg/mL stock: 32 lL
      LFX, 1mg/mL stock: 32 lL
      LZD, 1mg/mL stock: 32 lL
      PZA, 1mg/mL stock: 32 'L
       
    8. Spike 10 L Low QC stock dans le tube de perle Low QC.
    9. Spike 10 L Mid QC stock dans le tube de perles Mid QC.
    10. Spike 10 L High QC stock dans le tube de perle High QC.
  10. Placer tous les tubes dans un shaker chaud pendant 2 h à 37 oC. Secouer devrait être assez lent pour que l’eau ne s’éclabousse pas sur les tubes.
  11. Retirer les tubes du shaker. Transférer le liquide des tubes de perles dans de nouveaux tubes de microcentrifuge. Étiquetez ces tubes de microcentrifugeuse de la même manière.
  12. Ajouter 500 l de méthanol aux vieux tubes. Casquette et vortex.
  13. Pour une deuxième fois, transférer le liquide des tubes de perles dans le tube de microcentrifuge correspondant. Il est acceptable de transférer les cheveux pulvérisés. Cela finira par être centrifugé.
  14. Centrifuger les tubes de microcentrifuge pendant 10 min à 2 800 x g.
  15. Retirez soigneusement le liquide et transférez-le dans de nouveaux tubes de centrifugeuse avec des étiquettes correspondantes. Veillez à ne pas déranger ou transférer la boulette de cheveux.
  16. Évaporer le liquide dans les tubes de centrifugeuse à la sécheresse à 32 oC.
  17. Reconstituer les échantillons en ajoutant 200 L de phase mobile A (eau de qualité HPLC avec 1% d’acide formique) aux tubes secs. Vortex.
  18. Transférer le liquide dans des flacons ambre avec des inserts de 250 L.

3. Préparation LC-MS/MS

  1. Faire un litre de phase mobile A (eau de qualité HPLC avec 1% d’acide formic) en ajoutant de l’eau de qualité HPLC à un flacon volumetrique d’un litre. Ensuite, ajoutez 10 ml d’acide formique de 95 % à ce flacon, puis remplissez-le à la ligne avec de l’eau de qualité HPLC.
    1. Faire un litre de phase B mobile (acetonitrile avec 0,1% d’acide formic) en ajoutant un peu d’acéréonitrile à un flacon volumetrique d’un litre. Ensuite, ajoutez 1 ml d’acide formique à 95 % de l’acide formique, puis remplissez-le à la ligne avec de l’acétonitrile.
  2. Installez une colonne de 2 x 100 mm avec une taille de particules de 2,5 m et une taille de pore de 100 m avec des perles de phényl à l’éther polaires entièrement faites de silice poreuse dans le compartiment de colonne. Assurez-vous que la colonne a également recommandé fabricant cartouche de garde installé.
  3. Ouvrez le logiciel d’acquisition de données et la configuration matérielle en double clic. Mettez en surbrillance LCMS et cliquez sur Active Profile.
    1. Cliquez sur New Sub-Project, ou, si d’autres sous-projets existent déjà, cliquez sur Copy Sub-Project. Nommez le sous-projet.
    2. Cliquez sur nouveau document. Méthode d’acquisitionen double clic . Cliquez sur Mass Spec dans la fenêtre de la méthode d’acquisition.
    3. Modifier le dropdown de type d’analyse en MRM (MRM). Assurez-vous que Polarity est réglé sur Positive.
    4. Cliquez sur Liste d’importation et sélectionnez le fichier .csv MDR-TB LCMS transitions.csv qui est inclus dans les matériaux supplémentaires.
    5. Faites défiler vers le bas et réglez la durée à 16.751 min. Le temps de cycle approprié et le nombre de cycles se rempliront automatiquement.
    6. Dans la barre latérale gauche, cliquez sur Valco Valve intégré. Assurez-vous que le nom de position pour l’étape 0 est A. Dans la colonne Total Time (min), tapez 0,4 dans la première rangée et 13 dans la deuxième rangée.
    7. Dans la colonne Position, placez la ligne un à B et la ligne deux à A.
    8. Dans la barre latérale gauche, cliquez sur la pompe binaire. Réglez le gradient et le tableau de débit selon le tableau 4.
    9. Dans la barre latérale gauche, cliquez sur Autosampler. Modifier le volume d’injection à 10 l. Cliquez sur le contrôle de température activé et réglé à 4 oC.
    10. Dans la barre latérale gauche, cliquez sur Column Compartment. Fixez les températures droites et gauches à 50 oC.
    11. Fermer et enregistrer la méthode.
  4. Créez le lot en cliquant sur new Document et en sélectionnant le lot d’acquisition. Tapez un nom d’ensemble et sélectionnez la méthode nouvellement créée à partir de la barre de décrochage.
    1. Dans une feuille de calcul, créez un lot qui suit cet ordre : courbe d’étalonnage, contrôles de qualité, échantillons de patients, courbe d’étalonnage, contrôles de qualité, échantillons de patients, courbe d’étalonnage, contrôles de qualité. Ajouter les injections vides de solvants au début et à la fin de la course, ainsi qu’avant et après la courbe d’étalonnage, les contrôles de qualité et les échantillons de patients. Mettez au moins huit injections vides de solvant après des injections de la courbe d’étalonnage et de fiole de contrôle de haute qualité afin de réduire le report d’analyte.
      REMARQUE : Il peut être nécessaire d’ajouter plus d’injections vides de solvants en fonction de l’âge de la colonne.
    2. Dans la colonne adjacente aux noms de l’échantillon, tapez la position d’autosampler appropriée pour la fiole correspondante.
    3. Cliquez sur Ajouter l’ensemble. Dans la fenêtre pop-up, tapez le nombre d’échantillons dans le lot.
    4. Copiez et collez les noms d’échantillons et les emplacements de flacons de la feuille de calcul au lot nouvellement créé.
    5. Allez à l’onglet Soumettre. Cliquez sur le bouton Soumettre.
  5. Système d’équilibre en insérant la ligne de solvant A dans la phase mobile A et la ligne de solvant B dans la phase mobile B. Ouvrez la soupape de purge sur la pompe binaire.
    1. Définir la composition du solvant à 50 % B à un débit de 4 ml/min. Allumez la pompe binaire.
    2. Après 5 min, diminuer le débit à 0,3 ml/min. Fermer la soupape de purge. Vérifiez s’il y a des fuites.
    3. Dans le logiciel, appuyez sur Equilibrate sur la barre d’outils supérieure. Définir l’heure à 'gt;5 min, appuyez SUR OK.
    4. Une fois l’instrument équilibré, les modules en bas à droite de la fenêtre apparaîtront verts. Vérifiez que la pression s’est stabilisée, puis commencez le lot en cliquant sur l’échantillon de démarrage .

4. Analyse des données

  1. Une fois le lot terminé, ouvrez le logiciel de quantitation. Cliquez sur l’icône de baguette magique pour créer une nouvelle table de résultats.
    1. Cliquez sur Parcourir pour naviguer vers le dossier approprié, puis mettre en évidence le fichier de données et cliquez sur la flèche pointant droit pour déplacer les données dans la zone sélectionnée. Cliquez sur Next.
    2. Sélectionnez Créer une nouvelle méthode et cliquez sur Nouveau. Entrez le nouveau nom de méthode de quantitation et appuyez sur Enregistrer etensuite .
    3. Sélectionnez la première injection du point d’étalonnage du milieu. Appuyez sur Next.
    4. Les tiques marquent toutes les transitions des normes internes dans la colonne IS.
    5. Pour les transitions quantifiées pour les normes de référence, sélectionnez l’IS correspondant dans la colonne nom de l’IS. Cliquez sur Next.
    6. Faites défiler les transitions pour vous assurer que le temps de rétention automatiquement sélectionné est précis. Assurez-vous que Gaussian Smoothing est réglé à 1,5. Tous les autres paramètres par défaut peuvent rester tels qu’ils sont (c.-à-d. pourcentage de bruit 100 %, sous-ligne de base. Fenêtre 2.00 min, Peak Splitting 2 points).
      REMARQUE : Si vous le voulez, modifiez les paramètres d’intégration automatique à ce stade. Étant donné que ces paramètres changent en fonction de la configuration des instruments, nous n’avons pas inclus le nôtre ici.
    7. Cliquez sur Finition pour appliquer la méthode de quantitation au lot.
  2. Cliquez sur le haut à gauche Affiche le bouton d’examen de pointe pour afficher les chromatogrammes. Naviguez à travers les transitions à l’aide de la barre latérale gauche. Faites défiler chaque injection de chaque transition quantifiée et intégrez manuellement le bon pic si nécessaire.
    1. Pour intégrer manuellement un pic, cliquez sur le bouton de mode d’intégration manuelle Enable, zoomez sur le chromatogramme en cliquant et en faisant glisser le long de l’axe x ou y, puis dessinez une ligne d’une ligne de base à l’autre ligne de base, en définissant le sommet. La figure 3 présente deux chromatogrammes : l’un qui a l’INH, et a donc été intégré manuellement, et l’autre qui n’a pas l’INH.
      REMARQUE : Toutes les injections doivent être intégrées à l’aide des mêmes paramètres. La largeur maximale peut fournir une ligne directrice pour adhérer à ces paramètres, mais parfois la largeur de pointe sera différente. Pour quantifier un pic, le temps de rétention doit être à moins de 0,15 min du temps de rétention prévu pour cet analyte (tel que défini par les pics standard de référence), qualitativement confirmé comme ayant le rapport quantificateur attendu à la qualification (comme indiqué dans la figure 2), et avoir un rapport signal-bruit supérieur à 10.
  3. Dans la colonne Type d’échantillon, définissez les injections de courbes d’étalonnage (à l’exception des injections de courbes d’étalonnage vierge) à la norme. Définissez les injections de contrôle de la qualité en contrôle de la qualité. Laissez les injections restantes comme inconnu.
    REMARQUE : Cela sera réparti sur toutes les transitions.
  4. Dans la colonne concentration réelle, tapez les concentrations trouvées dans le tableau 5 pour toutes les courbes d’étalonnage et les injections de contrôle de la qualité.
  5. Cliquez sur la seconde en haut à gauche Affiche le bouton courbe d’étalonnage. Cliquez sur le bouton Régression.
  6. Définir le type de pondération à 1/x et appuyez SUR OK.
  7. Validez la courbe d’étalonnage et les échantillons de contrôle de la qualité pour s’assurer que le lot a fonctionné avec succès.
    1. Pour chaque transition de référence quantifiée (et non les transitions standard internes), regardez la précision de chaque courbe d’étalonnage (dans la colonne de précision). Au moins les deux tiers des points d’étalonnage doivent avoir une précision dans les 80-120%.
    2. Pour les points d’étalonnage bien en dehors de la précision prévue, l’injection peut être une valeur aberrante. Exclure les valeurs aberrantes si leur concentration calculée est plus de deux écarts standard par rapport aux deux autres injections de ce flacon. En cliquant sur le bouton «et pic » pour « ne pas trouver de bouton au-dessus de chaque chromatogramme .
    3. Vérifiez que la valeur R affichée au-dessus de la courbe d’étalonnage est de 0,975 .
    4. Vérifiez que toutes les injections de contrôle de la qualité ont une précision dans les 80-120%.
  8. Si toutes les conditions sont remplies, le lot est passé et les échantillons peuvent être quantifiés. Cliquez sur Modifier modifier la barre d’outils, puis cliquez sur Copier la table entière. Coller la table dans une feuille de calcul.
  9. Prenez la moyenne de la concentration calculée des deux injections d’échantillons pour déterminer la concentration déclarée de chaque échantillon.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une illustration d’un chromatogramme avec des niveaux confirmés de tous les 11 médicaments DR-TB est montrée dans la figure 1. Le temps de rétention de chaque analyte peut changer lors de l’utilisation de différents instruments et colonnes, de sorte que le temps de rétention exact doit être déterminé individuellement.

Les Chromatogrammes d’ion extraits (CIB) pour un médicament particulier (isoniazid, INH) dans l’un des étalonneurs (échantillon de cheveux blancs ai...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous rapportons ici le protocole pour la méthode que nous avons développée et validée pour quantifier 11 médicaments antituberculeux utilisés dans le traitement de la TUBERCULOSE DR dans de petits échantillons de cheveux à l’aide de LC-MS/MS. Aucune autre méthode pour quantifier ces 11 médicaments dans les cheveux n’a été précédemment développée, validée et publiée. Notre méthode peut quantifier les niveaux de sous-nanogrammes de médicaments dans seulement 20-30 mèches de cheveux d’environ 3 centimètres (cm) de longueur ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par le National Institute of Allergy and Infectious Diseases RO1 AI123024 (Co-PIs: John Metcalfe et Monica Gandhi).

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs tient à remercier le professeur Keertan Dheda, le Dr Ali Esmail et Marietjie Pretorius de l’Institut pulmonaire de l’Université du Cap qui ont facilité la collecte d’échantillons de cheveux pour l’étude. Les auteurs reconnaissent également avec gratitude les contributions des participants à cette étude.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Fioles d’injection de 2 mLAgilent Technologies5182-0716
Inserts de fioles d’injection de 250 uLAgilent Technologies5181-8872
Rupteur de perles 24OMNI International19001
Tubes à rupteur de billes (kit de billes de 2 mL, céramique de 2,8 mm, microtubes de 2 mL)OMNI International19628
BedaquilineToronto Research ChemicalsB119550
Bedaquiline-d6Toronto Research ChemicalsB119552
ClofazimineToronto Research ChemicalsC324300
Clofazimine-d7Toronto Research ChemicalsC324302
Tubes jetables de culture en verre à la chauxVWR60825-425
EthambutolToronto Research ChemicalsE889800
Ethambutol-d4Toronto Research ChemicalsE889802
EthionamideToronto Research ChemicalsE890420
Éthyonamide-d5ClearSynthCS-O-06597
Acide méthanoïqueSigma-AldrichF0507-100 mL
Bouteilles en verreCorning1395-1L
Hot ShakerBellco Glass Inc7746-32110
HPLCAgilent TechnologiesInfinity 1260
Acétonitrile de qualité HPLCHoneywell015-4
Méthanol de qualité HPLCHoneywell230-1L
Eau de qualité HPLCAqua Solutions IncW1089-4L
IsoniazidToronto Research ChemicalsI821450
Isoniazid-d4Toronto Research ChemicalsI821452
Colonne LC, Synergi 2,5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mmPhenomenex00D-4371-B0
Cartouche de garde LCPhenomenexAJ0-8788
Porte-cartouche de garde LCPhenomenexAJ0-9000
Logiciels de quantification LC-MS/MSSciexMultiquant 2.1
LévofloxacineSigma-Aldrich1362103-200MG
Lévofloxacine-d8Toronto Research ChemicalsL360002
LinezolidToronto Research ChemicalsL466500
Linezolid-d3Toronto Research ChemicalsL466502
Micro-centrifugeusesE& K Scientific695554
MoxifloxacineToronto Research ChemicalsM745000
Moxifloxacin-13C, d3Toronto Research ChemicalsM745003
MS/MSSciexTriple Quad 5500
OPC 14714Toronto Research ChemicalsO667600
Pretomanide (PA-824)Toronto Research ChemicalsP122500
ProthionamideToronto Research ChemicalsP839100
Prothionamide-d5Toronto Research ChemicalsP839102
PyrazinamideToronto Research ChemicalsP840600
Pyrazinamide-15N, d3Toronto Research ChemicalsP840602
Cloisons de cloison pour fioles d’injectionAgilent Technologies5185-5862
Évaporateur Turbovap LVBiotage103198/11

Références

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