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Article de méthode

Opsono-Adherence Test pour évaluer les anticorps fonctionnels dans le développement de vaccins contre les anthracis Bacillus et autres pathogènes encapsulés

3.1K vues

⸱

DOI :

10.3791/60873

⸱

19 mai 2020

 ,  ,  , 
1Bacteriology Division, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, 2Headquarters Division, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, 3Bioqual

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

L’essai d’opsono-adhérence est une méthode alternative à l’essai opsono-phagocytic de tuer pour évaluer les fonctions opsonic des anticorps dans le développement de vaccin.

Résumé

L’essai d’opsono-adhérence est un essai fonctionnel qui énumère l’attachement des pathogènes bactériens aux phagocytes professionnels. Puisque l’adhérence est nécessaire à la phagocytose et à la mise à mort, l’essai est une méthode alternative aux analyses opsono-phagocytiques de mise à mort. Un avantage de l’essai d’opsono-adhérence est l’option d’utiliser des agents pathogènes inactivés et des lignées cellulaires de mammifères, qui permet la normalisation à travers plusieurs expériences. L’utilisation d’un agent pathogène inactivé dans l’analyse facilite également le travail avec des agents infectieux de niveau 3 de biosécurité et d’autres agents pathogènes virulents. Dans nos travaux, l’essai d’opsono-adhérence a été employé pour évaluer la capacité fonctionnelle des anticorps, du sera des animaux vaccinés avec un vaccin à base de capsule d’anthrax, pour induire l’adhérence des anthracis fixes de Bacillus à une lignée cellulaire de macrophage de souris, RAW 264.7. La microscopie automatisée de fluorescence a été employée pour capturer des images des bacilles adhérant aux macrophages. L’adhérence accrue a été corrélée avec la présence des anticorps d’anti-capsule dans le sérum. Les primates non humains qui présentaient des concentrations élevées d’anticorps anti-capsules sériques ont été protégés contre le défi de l’anthrax. Ainsi, l’essai d’opsono-observance peut être employé pour élucider les fonctions biologiques des anticorps spécifiques d’antigène dans sera, pour évaluer l’efficacité des candidats de vaccin et d’autres thérapeutiques, et pour servir de corrélation possible de l’immunité.

Introduction

La reconnaissance, l’adhérence, l’internalisation et la dégradation d’un agent pathogène font partie intégrante de la phagocytose1, une voie saillante dans la réponse immunitaire innée de l’hôte décrite pour la première fois par Ilya Metchnikoff en 18832,3. Les leucocytes phagocytiques, ainsi que d’autres cellules du système immunitaire, sont très discriminatoires dans leur sélection des cibles; ils sont capables de faire la distinction entre le « non-soi infectieux » et le « soi non infectieux » par des modèles moléculaires associés à l’agent pathogène par leur répertoire de récepteurs de reconnaissance des motifs (PRR)4,5. La reconnaissance par l’hôte d’un agent pathogène peut également se produire avec la liaison des opsonines hôtes, comme le complément et lesanticorps 6. Ce processus, appelé opsonisation, enrobe l’agent pathogène de ces molécules, améliorant l’internalisation en se liant aux récepteurs opsoniques (p. ex., récepteurs de complément et de Fc) sur les cellules phagocytiques6. Pour qu’un agent pathogène adhère à un phagocyte, la liaison collective de récepteurs multiples avec leurs ligands cognate est nécessaire. Ce n’est qu’alors que l’adhérence peut déclencher et soutenir des cascades de signalisation à l’intérieur de la cellule hôte pour initier l’internalisation6.

En raison de l’importance de la phagocytose dans le dégagement des agents pathogènes et la prévention de l’infection, les agents pathogènes extracellulaires ont développé de nombreuses façons de subvertir ce processus pour prolonger leur survie. Une stratégie d’importance est la production d’une capsule anionique polymérique (p. ex., polysaccharide ou acide polyamino) qui est anti-phagocytique en raison de sa charge, est mal immunogène, et protège les molécules sur l’enveloppe bactérienne des PRR6,7. Des agents pathogènes tels que cryptococcus néoformans et streptocoques pneumoniae ont des capsules composées de polymères saccharides, tandis que Staphylococcus epidermidis et certaines espèces de Bacillus produisent de l’acide poly-ɣ-glutamique (PGGA)7,8. Pourtant, d’autres agents pathogènes produisent des capsules qui ressemblent à l’auto non infectieuse. Par exemple, Streptococcus pyogenes et une souche pathogène de B. cereus ont une capsule d’acide hyaluronique qui est non seulement anti-phagocytique, mais qui peut également ne pas être reconnu comme étranger par le système immunitaire9,10.

La conjugaison de la capsule en protéines porteuse les convertit à partir d’antigènes pauvres et indépendants en T hautement immunogènes dépendants des antigènes qui peuvent induire des titres anticorps anti-capsule sériquesélevés 11,12. Cette stratégie est utilisée pour les vaccins homologués contre S. pneumoniae, Haemophilus influenzaeet Neisseria meningitides11. Les activités opsoniques des anticorps anti-capsules ont généralement été évaluées par des analyses de mise à mort opsono-phagocytiques (OPKA)13,14,15,16. Ces analyses testent si les anticorps fonctionnels peuvent déclencher la phagocytose et tuer14. Toutefois, l’utilisation de l’OPKA avec des agents pathogènes infectieux, tels que les agents et toxines biologiques de niveau 1 (BSAT), y compris B. anthracis17,est dangereuse et présente des risques pour la sécurité; ces analyses nécessitent une manipulation approfondie d’un agent sélectionné. La manipulation d’agents sélectionnés ne peut se faire que dans des laboratoires restreints de niveau 3 (BSL-3); les travaux dans ces domaines exigent des procédures d’exploitation prolongées en raison des nombreuses précautions de sécurité qui doivent être suivies. Les laboratoires BSL-3 ne sont généralement pas équipés de l’équipement spécialisé utilisé pour le travail opka, comme les microscopes et les cytomètres. Ainsi, nous avons développé un essai alternatif basé sur l’utilisation de bactéries inactivées18,19. Nous appelons cela un essai opsono-adhérence (OAA) qui ne dépend pas de l’internalisation et de tuer comme sorties d’analyse; au lieu de cela, l’adhérence des agents pathogènes inactivés opsonized est employée comme index de phagocytosis. Mécaniquement, oaa est un substitut approprié parce que l’adhérence se produit a priori et est intimement liée à l’internalisation et à la mise à mort intracellulaire. Du point de vue de la biosécurité, l’OAA est préférable parce qu’elle nécessite une manipulation minimale d’un agent infectieux, est expérimentalement de plus courte durée que l’OPKA et peut être effectuée dans les laboratoires BSL-2 après qu’un stock de l’agent pathogène inactivé a été produit et transféré.

Nous démontrons l’utilisation de l’OAA pour examiner la fonction opsonique des anticorps anti-capsules trouvés dans sera des primates non humains (NHPs) vaccinés avec une capsule conjuguée [c.-à-PGGA de B. anthracis conjugué au complexe de protéine de membrane externe (OMPC) des méningitides de Neisseria]20. Des bacilles opsonized de sérum ont été incubés avec une ligne adhérente de cellules de macrophage de souris, RAW 264.7. Après fixation, le monocouche cellulaire et les bacilles adhérents ont été photographiés par microscopie de fluorescence. L’adhérence bactérienne a augmenté quand les bacilles ont été incubés avec le sérum des NHPs vaccinés avec le conjugué de capsule comparé au sérumde contrôle 20. L’adhérence est corrélée avec la survie du défi anthrax20,21. Ainsi, l’utilisation de l’OAA a caractérisé la fonction des anticorps anti-capsule et a grandement facilité l’essai de notre candidat de vaccin.

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Protocole

Conformément à la Loi sur le bien-être des animaux, à la politique du Service de santé publique et à d’autres lois et règlements fédéraux relatifs aux animaux et aux expériences impliquant des animaux, la recherche décrite ici a été menée en vertu d’un protocole approuvé par le Comité des soins et de l’utilisation des animaux en établissement. L’établissement où cette recherche a été menée est accrédité par l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, International et adhère aux principes énoncés dans le Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Conseil national de recherches du Canada, 201124.

1. Culture et entretien de la lignée cellulaire, RAW 264,7

REMARQUE : Les procédures suivantes doivent être effectuées avec des techniques aseptiques.

  1. Chauffer le sérum bovin fœtal (FBS) dans un bain d’eau de 56 °C pendant 30 min pour inactiver le complément.
    REMARQUE : Le temps d’inactivation de 30 min commence lorsque FBS atteint 56 °C. Pour surveiller la température, chauffer un volume d’eau similaire dans un bécher dans le même bain d’eau. Une fois que l’eau atteint 56 °C, commencez le compte à rebours de 30 min pour FBS. Alternativement, FBS qui a été inactivé par la chaleur est également disponible dans le commerce.
  2. Préparer le milieu pour les cellules RAW 264.7 en combinant 90% de DMEM avec un glucose élevé et 10% de chaleur inactivée FBS (v/v). Ajouter la L-glutamine à une concentration finale de 6 mM.
    REMARQUE : Le DMEM avec le glucose élevé est formulé avec 4 mM de L-glutamine. Le supplément de L-glutamine à 6 mM favorise la croissance cellulaire cohérente. 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine peuvent être ajoutés pour prévenir la contamination. Une autre lignée cellulaire murine commune, J774A.1, peut également être utilisée et cultivée dans des conditions similaires.
  3. Décongeler un flacon de cellules congelés dans un bain d’eau de 37 °C et retirer du bain dès qu’il fond. Ajouter le contenu de façon aseptique à 5 mL de milieu complet dans un tube conique. Inverser le tube conique deux fois et tourner à 300 x g pendant 5 min pour pelleter les cellules.
  4. Aspirer le milieu à l’aide d’un pipet pasteur stérile attaché à un aspirateur pour enlever l’agent de congélation. Resuspendez la pastille cellulaire dans 5 mL de milieu frais.
  5. Transférer la suspension dans un flacon ou un plat traité par culture tissulaire. Ajouter suffisamment de milieu pour couvrir complètement le fond du flacon et tourbillonner pour répartir uniformément les cellules. Indiquez le numéro de passage commençant par « 1 ».
  6. Incuber les cellules à 37 °C en présence de 5 % de CO2 et d’humidité jusqu’à ce que 95 % à 100 % de la confluence soit atteinte. Vérifiez les cellules quotidiennement au microscope à partir du deuxième jour d’incubation. Ne laissez pas les cellules atteindre >100% confluency car cela fera décoller les cellules et mourir.
    REMARQUE : Le temps nécessaire pour atteindre la confluence dépend du nombre de cellules vivantes qui ont été plaquées et de la zone de croissance du flacon. Ainsi, il est prudent de vérifier les cellules tous les jours.
  7. Cellules de sous-culture en raclant et en diluant le stock cellulaire dans un milieu frais permettant au moins deux jours de croissance entre les grattages. Augmentez le nombre de passages de 1 à chaque sous-culture.
    REMARQUE : Le passage et le grattage immédiat le lendemain entraîneront une perte plus rapide de l’adhérence générale des cellules au fil du temps. Raw 264.7 cellules ne doivent être utilisés jusqu’à environ passage 15.
  8. Pour plaquer les cellules RAW 264.7 pour l’analyse OAA, remplacez-les par un milieu frais et utilisez un grattoir cellulaire pour gratter doucement les cellules du flacon. Pipette de haut en bas pour briser les touffes de cellules pour un comptage cellulaire plus facile.
    REMARQUE : La méthode traditionnelle de subcultation de RAW 264.7 est par raclage. D’après notre expérience, l’utilisation de trypsine provoque raw 264.7 cellules à perdre l’adhérence au fil du temps plus vite qu’avec le grattage.
  9. Pour compter les cellules, diluer des volumes égaux de cellules et trypan solution bleue. Charger 10 μL sur un hémocytomètre. Observez et comptez le nombre de cellules vivantes qui excluent le colorant à l’aide d’un microscope composé inversé avec une lentille objective 10x.
  10. Plaque 1.4 x 104 cellules viables par puits dans une plaque de fond plate en verre de 0,15 μm d’épaisseur (plaque #1). Laisser les cellules se développer pendant 3 jours. Remplacez le milieu passé un jour avant d’exécuter OAA.
    REMARQUE : Après 3 jours d’incubation, le nombre de cellules doit être d’environ 5 x 104/well.

2. Culture bactérienne et préparations

REMARQUE : L’espèce bactérienne utilisée dans ce protocole est une souche virulente encapsulée, B. anthracis Ames. Toutes les manipulations avec cette espèce nécessitent une biosécurité et des habilitations de sécurité appropriées et doivent être effectuées dans un cabinet de sécurité biologique de classe II ou III situé dans un laboratoire BSL-3. Suivez les procédures d’exploitation institutionnelles pour le travail BSL-3 et pour l’utilisation d’équipement de protection individuelle lors de la manipulation des bactéries.

  1. Préparer l’infusion de cœur cérébral (BHI) bouillon en dissolvant 37 g de poudre BHI dans 1 L d’eau et autoclaving à 121 °C pendant 15 min. Conserver le bouillon à température ambiante.
  2. Préparer une solution de bicarbonate de sodium à 8 % dans l’eau et stériliser à l’aide d’une seringue filtrante de 0,20 μm. Conserver la solution à 4 °C et l’utiliser dans un délai de 1 jour.
  3. Mélanger 8 g de bouillon nutritif, 3 g d’extrait de levure et 15 g d’agar dans 1 L d’eau pour préparer les assiettes d’agar NBY. Autoclave à 121 °C pendant 15 min. Verser dans des boîtes de Pétri et laisser solidifier. Conserver les assiettes à 4 °C.
    REMARQUE : Les plaques d’agar NBY peuvent être faites avec ou sans bicarbonate de sodium. L’ajout de bicarbonate de sodium aux plaques de bouillon et d’agar induit la croissance de colonies mucoïdes composées de bacilles encapsulés. La concentration finale de bicarbonate de sodium dans les médias liquides et solides est de 0,8 %.
  4. Préparer le bouillon de culture pour les anthracis B. en mélangeant 50 % de bouillon BHI autoclavé, 40 % de FBS et 10 % de solution de bicarbonate de sodium (v/v).
    REMARQUE : Ce bouillon est formulé pour produire de courtes chaînes de bacilles encapsulés.
  5. Préparez une plaque maîtresse de B. anthracis en la striant pour l’isoler sur une plaque d’agar NBY à partir d’un stock de spores un jour avant de la culture dans le bouillon. Incuber à 37 °C.
  6. Inoculer 30 mL de bouillon de culture dans un flacon ventilé de 250 mL avec plusieurs colonies de B. anthracis.
    REMARQUE : Un rapport volume/surface spécifique du bouillon, tel que spécifié ici, est nécessaire pour produire des bacilles encapsulés au maximum.
  7. Agiter la culture du bouillon à 125 rpm, 37 °C avec 20 % de CO2 et l’humidité pendant 18 à 24 h.
    REMARQUE : La croissance de B. anthracis à des températures supérieures à 37 °C peut inhiber la production de capsules.
  8. Utilisez des taches négatives à l’encre de Chine pour assurer une encapsulation suffisante et que les bacilles sont en chaînes courtes (1-5 bacilles/chaîne) avant la fixation (voir la section 3).
  9. Pour déterminer les unités de formation des colonies (CFU), diluer en série 100 μL de culture 1:10 dans la solution saline tamponnée de phosphate (PBS) et les dilutions de la culture des plaques sur les plaques d’agar de sang des moutons. Incuber pendant 12-18 h à 37 °C. Comptez les FC et déterminez le nombre de bactéries par mL de culture.
    REMARQUE : Le comptage peut également être effectué à l’aide d’un hémomètre au microscope une fois que les bactéries ont été réparées. Cependant, ce n’est pas recommandé parce que les bacilles sont difficiles à voir sous un faible grossissement.
  10. Ajouter 16% de paraformaldéhyde (PF) à l’ensemble du volume de la culture bactérienne à une concentration finale de 4% PF pour fixer les bacilles. Agitez lentement sur un shaker à température ambiante pendant 7 jours.
    REMARQUE : Sept jours d’incubation dans 4 % de PF sont basés sur la procédure d’exploitation standard institutionnelle USAMRIID pour fixer les bacilles végétatifs.
  11. Pour enlever le fixatif et tester la stérilité, trois fois laver 4 mL (10% de volume) de suspension bactérienne fixe dans un tube conique de 50 mL par centrifugation à ≥3000 x g pendant 45 min et à l’aide d’un 30 mL /lavage avec PBS. Conserver le reste de l’échantillon dans 4 % PF à 4 °C.
    REMARQUE : Après pelletage, la pastille bactérienne est moelleuse en raison de la présence de capsule. Prenez soin de ne pas déranger la pastille pendant le lavage. Il est nécessaire d’enlever tout fixatif afin qu’il n’interfère pas avec le test de viabilité. Si nécessaire, augmenter le nombre de lavages.
  12. Pour les tests de viabilité, inoculer 40 mL d’un milieu de croissance bactérienne (p. ex. bouillon BHI) avec 4 mL de suspension lavée (≤ 10 % du volume du bouillon) et incuber à 37 °C pendant 7 jours. Vérifiez la densité optique à 600 nm avant et après 7 jours pour mesurer la turbidité.
  13. Après 7 jours d’incubation dans la culture du bouillon, plaque ≥100 μL de bouillon sur une plaque d’agar et incuber pendant encore 7 jours. Si aucune augmentation de la turbidité et aucune croissance sur les plaques ne sont observées, la culture originale est considérée comme stérile et peut être transférée dans un laboratoire BSL-2.
    REMARQUE : Le Programme fédéral des agents sélectionnés22 exige que les anthracis B. inactivés ne puissent être transférés des laboratoires BSL-3 qu’après avoir démontré une stérilité complète de l’échantillon. Le test de viabilité pour les anthracis B. inactivés consiste à culturer 10 % de l’échantillon dans le bouillon pendant 7 jours, suivi de la culture sur support solide pendant encore 7jours 22,23. Suivez les directives institutionnelles pour recevoir l’approbation de transfert une fois que la stérilité est établie.

3. Coloration négative et microscopie légère pour observer l’encapsulation et les chaînes de bacilles

  1. Mélanger 5 μL de suspension bactérienne avec 2 μL d’encre de Chine sur une lame de microscope. Placez un verre de couverture de 1 ou 1,5 μm d’épaisseur sur la suspension sans créer de bulles.
    REMARQUE : Le vernis à ongles peut être utilisé pour sceller le verre de couverture sur la glissière.
  2. Observez la suspension bactérienne à l’aide d’une lentille objective à l’huile 40x à 100x sur un microscope léger. Assurez-vous que les bacilles sont encapsulés en observant une zone de dégagement (la capsule exclut l’encre de Chine) entourant chaque bactérie et que les chaînes de bacilles sont courtes.

4. Étiquetage FITC des bactéries

  1. Dissoudre l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) dans le sulfure de diméthyle à une concentration de 2 mg/mL.
  2. Mesurer le volume de bouillon bactérien inactivé.
  3. Laver le stock 3x dans PBS pour enlever fixatif.
  4. Ajouter la solution FITC à une concentration finale de 75 μg/mL. Agiter lentement le mélange de 18 à 24 h à 4 °C.
  5. Trois fois laver les bactéries en granulant à ≥3000 x g, 45 min et en utilisant 30 mL PBS / lavage pour éliminer l’excès fitc. Assurez-vous que la pastille moelleuse n’est pas dérangée pendant le lavage. Resuspendez les bacilles en PBS dans le même volume de départ.
  6. Aliquot et stocker les bacilles dans des microtubes à -20 °C jusqu’à utilisation. Ne pas congeler/décongeler les bacilles plusieurs fois car les bacilles peuvent perdre la capsule.

5. Opsonisation bactérienne

  1. La chaleur inactive un petit volume d’essai sera (à partir de NHPs) à 56 °C pendant 30 min dans un bloc thermique.
  2. Décongeler et laver les bactéries étiquetées FITC avec PBS 2x en les granulant à 15 000 x g pendant 3 à 5 min. Resuspendez en PBS dans le même volume de démarrage.
  3. Dans une plaque inférieure ronde de 96 (plaque #2), diluer périodiquement le sérail d’essai dans le milieu cellulaire. Dans une autre plaque inférieure ronde de 96 (plaque #3), ajouter 10 μL de sérail d’essai dilué dans chaque puits.
    REMARQUE : Dans chaque assiette, le PBS et le singe sera normal ont été inclus à la place du sera dilué d’essai comme contrôles négatifs. Nous avons également choisi un sérum d’essai comme un contrôle positif pour générer une courbe standard pour normaliser tous les essais effectués sur différents jours. Le sérum positif de test de contrôle a été arbitrairement choisi parce qu’il était abondant.
  4. Pour #3, ajouter 10 μL de complément lapin fraîchement reconstitué.
    REMARQUE : Une fois reconstitué, jetez le complément restant de lapin de bébé ; ne pas recongeler et décongeler.
  5. Pour plaquer #3, ajouter le volume approprié de bacilles étiquetés FITC pour une multiplicité d’infection de 1:20. Par exemple, ajoutez le volume qui contient 5 x 104 x 20 bacilles pour 5 x 104 cellules. Garnir chaque puits dans la plaque #3 avec le volume approprié de milieu cellulaire pour un total de 105 μL.
    REMARQUE : La #1, qui contient des cellules, reçoit 100 μL de bactéries opsonisées avec les 5 μL restants comme volume vide. Nous avons testé chaque dilution du test sera en double.
  6. La plaque d'#3 à 37 °C pendant 30 min en présence de 5 % de CO2 avec humidité pour opsoniser les bacilles.

6. Analyse d’observance et étiquetage fluorescent des cellules mammifères

  1. Maintenir tous les reagents à 37 °C avant utilisation.
  2. Placer la plaque #1, qui contient des cellules adhérentes, sur un bloc thermique de 37 °C.
  3. Utilisez un pipettor multicanal pour enlever le milieu usé des puits et remplacer rapidement par 100 μL de bactéries opsonisées de la plaque #3. Assurez-vous qu’aucune bulle n’a été générée dans les puits pendant le pipetage. La plaque d'#1 à 37 °C avec 5 % de CO2 et l’humidité pendant 30 min pour l’adhérence.
  4. Laver chaque puits 5x avec 150 μL PBS sur un bloc thermique de 37 °C pour enlever les bacilles non attachés.
    REMARQUE : Il faut veiller à ce que les cellules ne soient pas dispersées accidentellement pendant le lavage.
  5. Diluer 16% PF avec PBS 1:4 pour faire 4% PF. Fixer les cellules avec 4% PF pendant 1 h en ajoutant 150 μL à chaque puits. Laver les cellules 2x avec PBS.
  6. Mélanger 2 μL HCS (criblage à haute teneur) Orange Cell Stain dans 10 mL PBS. Ajouter 150 μL de cette solution de coloration aux cellules fixes et incuber pendant 30 min à température ambiante.
  7. Laver les puits 2x avec du PBS.
  8. Conserver à 4 °C jusqu’à la microscopie.

7. Microscopie

REMARQUE : En général, un microscope automatisé à fluorescence à haut débit facilitera l’imagerie de l’OAA. Si un système automatisé n’est pas disponible, des images fluorescentes de bacilles adhérents peuvent être prisesmanuellement 21. Dans cette étude20, les bacilles adhérents et les monocouches cellulaires ont été photographiés à l’aide du système de microscopie à balayage laser Zeiss 700 avec équipement spécialisé; notre système était composé du microscope inversé Zeiss Axio Observer Z1 équipé d’une scène automatisée, du module Definite Focus, de l’objectif 40 x NA 0.6, de la caméra Axio Cam HRc et du logiciel Zen 2012 (Blue Edition). Les images acquises sont des images de champ large, pas des images confoccales. Le protocole suivant est conçu comme une configuration de microscope de base qui s’applique à une variété de systèmes automatisés de microscopie.

  1. La plaque d'#1 à température ambiante pendant 30 min. Allumez le microscope et l’équipement connexe.
    REMARQUE : L’acclimation à température ambiante empêche la condensation de se former sur la plaque de verre pendant l’imagerie. En outre, il empêche le déconcentrage dû au changement de température.
  2. Placez la plaque sur la scène et concentrez-vous sur les cellules à l’aide d’un champ lumineux ou d’un contraste de phase.
  3. Sélectionnez 96 bien format que le réglage de la plaque. Sélectionnez les paramètres du canal.
    REMARQUE : La longueur d’onde maximale d’excitation et d’émission de FITC est de 495/519 nm; la tache orange de cellules de HCS sont 556 et 572 nm. D’autres fluorophores peuvent être utilisés en fonction des filtres disponibles au microscope.
  4. Sélectionnez le paramètre en mode Tuile. Indiquez le nombre d’images à acquérir.
    REMARQUE : La fonction carrelage permet la capture de plusieurs emplacements dans un puits d’échantillon et peut être réglée pour acquérir une image dans un carrelage ou un format aléatoire. Nous avons photographié 10 zones aléatoires par puits.
  5. Changez le mode d’acquisition en « noir et blanc » ou « monochrome » et en binning ≥ 2x2.
    REMARQUE : Le réglage du binning de 1x1 à 2x2 ou 4x4 augmenterait la vitesse de microscopie mais entraînerait également une résolution plus faible de l’image. Pour l’OAA, il suffit d’utiliser ces paramètres car l’analyse énumère à la fois les macrophages et les bactéries adhérentes.
  6. Activez le module autofocus ou de mise au point. Indiquez à quelle fréquence la fonction d’autofocus doit être exécutée. Activez la fonction Z stack, si disponible. Indiquez le nombre de piles Z qui captureront l’épaisseur du monocouche cellulaire et des bacilles adhérents.
    REMARQUE : Le nombre de piles Z choisies augmentera le temps de microscopie, mais assurera qu’une image avec la mise au point correcte est prise à chaque pile Z.
  7. Désignez un dossier de fichier pour enregistrer des images. Exécutez le programme d’imagerie automatisée.

8. Collecte et analyse de données

  1. Comptez le nombre de bacilles adhérents et de cellules mammifères par image. Comptez chaque chaîne de bacilles comme une bactérie.
  2. Tracer les bacilles/cellules du sérum et du titer de test de contrôle positif (p. ex., la dilution de 1:10 est de 10 unités de litre) pour générer une courbe standard dans un programme de statistiques approprié.
  3. Analyser le sérum de test de contrôle positif à l’aide d’un raccord de courbe de régression non linéaire. Analysez ensuite les échantillons restants à l’aide de la courbe standard du sérum de test de contrôle positif pour déterminer les titres correspondants.
    REMARQUE : Il est généralement plus précis de choisir les dilutions de l’échantillon près du milieu de la courbe standard lors de la détermination des titres.
  4. Calculer la moyenne géométrique des échantillons de chaque groupe vaccinal. Calculez les valeurs P des titres transformés en rondins par analyse ANOVA de différence la moins significative.

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Résultats

Cette section montre des micrographes représentatifs recueillis au cours d’une expérience de l’OAA ainsi que des résultats montrant que l’OAA peut être utilisé pour examiner la fonction biologique des anticorps. Ici, l’analyse a été utilisée avec succès pour évaluer l’efficacité d’un candidat vaccin contre l’anthrax. Il est essentiel de vérifier l’état de l’encapsulation sur les bacilles que peu ou pas d’encapsulation les amène à adhérer aux cellules hôtes, produisant un fond élevé. La figure 1

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Discussion

Les vaccins à base de capsules se sont montrés efficaces contre de nombreux agents pathogènes bactériens, et beaucoup sont homologués pour uneutilisation chez l’homme 25,26,27. Ces vaccins fonctionnent en générant des anticorps ciblant la capsule et beaucoup de ces études utilisent l’OPKA pour montrer les fonctions opsono-phagocytiques des anticorps13,14,

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont pas d’association commerciale ou autre qui pourrait poser un conflit d’intérêts.

Remerciements

J. Chua, D. Chabot et A. Friedlander ont conçu les procédures décrites dans le manuscrit. J. Chua et T. Putmon-Taylor ont effectué les expériences. D. Chabot a effectué une analyse des données. J. Chua a écrit le manuscrit.

Les auteurs remercient Kyle J. Fitts pour son excellente assistance technique.

Le travail a été soutenu par la subvention de l’Agence de réduction des menaces de défense CBM. VAXBT.03.10.RD.015, numéro de plan 921175.

Les opinions, interprétations, conclusions et recommandations sont celles des auteurs et ne sont pas nécessairement approuvées par l’armée américaine. Le contenu de cette publication ne reflète pas nécessairement les points de vue ou les politiques du département de la Défense, et la mention de noms commerciaux, de produits commerciaux ou d’organisations n’implique pas nécessairement l’approbation du gouvernement des États-Unis.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,20 et micro ; Filtre à seringue m (25 mm, cellulose régénérée)Corning, Corning, NYSeringue 431222
10 mL (pointe Luer-Lok)BD, Franklin Lakes, NJ302995
15µ ; 96 plaques noires à 96 puits (plaque #1 pour l’imagerie)In Vitro Scientific, Sunnyvale, CAP96-1-N
16 % paraformaldéhydeMicroscopie électronique Science, Hatfield, PA15710
Fiole traitée pour culture tissulaire de 75 cm carrésCorning, Corning, NY430641
Agar (poudre)Sigma-Aldrich, St. Louis, MOA1296
Complément pour bébé lapinCedarlane Labs, Burlington, NCCL3441
Extrait de levure BactoBD, Sparks, MD288620
BBL Perfusion cerveau-cœur (BHI)BD, Sparks, MD211059
Plaques de gélose au sang (TSA avec sang de mouton)Remel, Lenexa, KSR01198
Racleur de cellulesSarstedt, Newton, NC83.183
Plaques de culture cellulaire Costar 96 puits (plaques #2 & 3 pour les dilutions)Corning, Corning, NY3596
Verre de couvertureMicroscopie électronique Science, Hatfield, PA72200-10
Bouillon de nutriments DifcoBD, Sparks, MD234000
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), haute teneur en glucoseGibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA11965-092contient 4500 mg/L de glucose, 4 mM de L-glutamine, Phenol Red
EVOS FL Auto Cell Imaging System (microscope à fluorescence)Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAAMAFD1000
Sérumde veau fœtalHyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UTSH30071.03non irradié aux rayons gamma, non inactivé par la chaleur
Isothiocyanate de fluorescéineInvitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAF143
HCS Cell Mask Orange Cell StainInvitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAH32713
hémocytomètre (Neubauer amélioré)Hausser Scientific, Horsham, PA3900
Solution d’encre d’IndeBD, Sparks, MD261194
L-glutamine (200 mM)Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA25030081support de complément avec 2 mM supplémentaires de L-glutamine
Nikon Eclipse TE2000-U (microscope composé inversé)Nikon Instruments, Melville, NYTE2000
PBS sans calcium ni magnésiumLonza, Walkersville, MD17-516F
Solution de pénicilline-streptomycine, 100xHyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UTSV30010 boîtes de
Pétri (100 x 15 mm)Falcon, Corning, Durham, NC351029pour plaques de gélose
RAW 264.7 lignée cellulaire de macrophage (Tib47)ATCC, Manassas, VAATCC TIB-71
LamesVWR, Radnor, PA16004-422
Bicarbonatede sodium Sigma-Aldrich, St. Louis, MOS5761
Solution de bleu de trypan (0,4 %)Sigma-Aldrich, St. Louis, MOT8154
Microscopie à balayage laser Zeiss 700 (microscope confocal)Microimagerie Carl Zeiss, Thornwood, NY4109001865956000

Références

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